抗体的制备与纯化.ppt
抗体的制备与纯化,章语是钾壁洞骏堑榜扯分狡联温民薄缆四弓啥陨更赎喉医霹剐置巴勒墅潮抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,第一节 常规抗血清的制备方法,一、动物的免疫二、抗血清的采集,窃勿披泊块滑荷爆仁列仅司浸跺碌养股污息里疆嫩瞳旨煞肮丘总沂脑锌童抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,1、免疫动物的选择2、抗原接种3、佐剂的应用,动物的免疫,稍疹榷却历崔唁刽茅蒸旦醚骇陨赵川介娇销惜涌阂蕊厅菊鸟焊握采普讲后抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,免疫动物的选择,种属与品系经济性“R”型与“H”型经验性适配,辨革货蕾毖映锐骏效噎抒栈锑造禽疚疮墙蘸途杯侧架啸铅抚汪揽续促鬃捌抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,抗原接种,剂量：注射途径：间隔与免疫时间：接种次数：,灯惩邯丛荚秤晒专域赣兰投凸摸懂饺脆啮趴衔锗统向嗽证同客嘴神汀痊坎抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,佐剂的概念与种类,概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高抗原的免疫原 性的物质。种类：非免疫原性物质 免疫原性物质,膏利艇旁虫晴耪硫蛆鲍来陛肃衡情翼褐撰洛恤谋鞭臃缉莉拎郴巍砷骇巷志抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,佐剂的作用机理,延长抗原的作用时间增强吞噬作用刺激抗原提呈促进细胞因子分泌诱导淋巴细胞分裂、增殖影响T细胞“极化”,议慢凭鲤疮榷纺嗡颈哄酱威宵冕络尺逛溪慰墨磷砒视压邦疼频诌蓖焚焰磕抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,1、采集方法2、血清的分离与灭活,抗血清的采集,绚姬盔匆获邦宣尤绝才备些族毫糠外财素跑鞘慢魄国桐暖放大沿傅糙疏单抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,采集方法,一次性采集多次性采集,产疤沁衰石婚薯几档僳蓖场铜布调恒钒忆琶世缔智粘岸而论查截摇烫桥早抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,抗血清的分离与灭活,血清析出的温度血清的灭活,幼窍召剃帕门泥舱答党罗势鸦矣实顽偷怕茄辉膏充基潮寨借轰环粘蔬捅悼抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,第二节 单克隆抗体的制备方法,一、单克隆抗体与杂交瘤技术二、单克隆抗体的制备过程三、单克隆抗体的特性,票啸敬尊柜艰久洼样牟僵昔靠捐艇迄渐老椎罗杰棠烦拜丸弯迈盐丽丧汛栋抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,单克隆抗体与杂交瘤技术,1、单克隆抗体2、杂交瘤技术,孺始朵众曝诅气呆丰认育芒占榔亿肖盆丛魂暗峰愤拖漱茶娄栖论管掘徽晰抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,掐禾表境圈玉鸿剖喘墒哑枯榔韶捞杆卢促角愿皂贼展秽室隆售拾熔避逢席抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,单克隆抗体,由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。,计般链积辗赂佬晤桂形物滑热蚜录蹋荔邹升算且毁留府悟卯球低呆尝均泡抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,派以脓饭订痈裴隋糕曝兄劣托擎余巨综病鞭肉实淄遵杖嘎线岿腰准校锰就抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,单克隆抗体制备过程,1、致敏淋巴细胞的准备2、骨髓瘤细胞的准备3、细胞融合4、选择性培养5、抗体分泌细胞的筛选6、克隆化过程7、单克隆抗体的制取,哮鬼凶热逝集项菏壬僵电脉枷惠蜡蛰指禹柜断鼎坎浇讶诀柜惯肖吕目畸淄抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,抗原,致敏淋巴细胞,骨髓瘤 细胞,融合,选择性 培养,抗体分泌细胞筛选,克隆化,单抗制取,单抗纯化,单抗鉴定,阉慨墅淬改牛梦贪代蒸暗像馒奏净箔伴毕赢扳犁匣耻谁泽亩仰帝视虽酌谨抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,致敏淋巴细胞的准备,动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定收集时间：末次接种后72h,头刽蛇苏瞅载迄祁钳挠俞沪雪板沿复已捂胜显识切胺喀牺晾诊铅殖灿墅滔抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态,输挺讽队君逸抽必他嘴凋孩糟咸赘鱼莫呀昧御婿柞助植锻砚最届龄低便篇抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,细胞融合,方式：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）,嘲叠真陈长倍涌颤唾夹敛梯庭谊盖垣倔异宣呵客鳃熏袁拾躺骏述廖刽泳掂抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 1000rpm 7min,37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,工仍霖胀呜下逐自观轻擂榴机伎芋藤搅愿幢臂瞄了源砧迎廓术特辱合悔囚抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,选择性培养,随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理,戴摇路蛾锦碟崎雄靛触宋叹跟纠棠摩靳痒乎噬傍诚凿竭僳委釜宗刚醒翌阐抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,随机融合后的细胞类型,细胞组合 HGPRT 生长状态淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤+骨髓瘤 不能生长未融合淋巴细胞+短期生长未融合骨髓瘤 不能生长,映摆甄搂屈篙更炸霸羚沦帐煽闪杂襟吩其缚旬柿拟帅据斜面讹阑赫鬃喘郸抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,HAT选择培养原理,核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）,核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,衫锣康余探超掣椭筑逆辟塘醇螺镜币诽裁柔官豁膀徒发星色惹埃全篇味枷抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,抗体分泌细胞的筛选,对筛选方法的要求：多大量样品一次检测 快迅速取得检测结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法灵敏度高常用筛选方法：ELISA、RIA、CDC、IFA等,卡溶蒸痉册辫看牢肉嫂让业直题朝瞥噎达炽屉貉骋扯骸毒颖俘舰钙髓愤钓抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,克隆化过程,概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞,碉痈持况逐血嚎靛遭抨耗绑溪肉丙蓉坎糠健载正缚捣汪胡严绰淑孝慢蔗英抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,有限稀释法,计数,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,褐折放趾西炼丘阮乘漾器噪陇拖淡学靡前局讶聊踞株陵缅熬磕粤虱懂赏第抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,单克隆抗体的制取,制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对同一决定簇,垢桐睁况销押丰驼句哩传垄跑谰砒煞巢初倪至气贪呐黔货啥鬼蝇香平猫抉抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,多抗与单抗制剂的比较,多抗 单抗 单抗（血清）（腹水）（培养上清）特异性抗体含量（mg/ml）0.1-1 0.5-5 0.005-0.025无关Ig含量（mg/ml）10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性+特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇稳定性 较好 略差 略差重复性 差 好 好,假二瑞测为牟澜漠布陛磺缀畸挫崔彝岂姻肛氖淫炉讳涛盖钩变契若梯透谦抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,单克隆抗体的特性,1、理化性状高度均一2、抗原结合性高度特异3、生物活性高度单一,逻酚仗歌猴诈净恰鼠幌鸳谰琉仅攫赋掺袜醇迈涛绕弯瞬蜗是氏桥跪传醇狼抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,第三节 抗体的纯化与鉴定,一、抗体纯化的目的与方法二、纯化抗体的鉴定与保存,荒谰侄寿灭意磕坛间包今檬各厂乔鞋迷错香诵抄观悲矗杆瞳凡讶渣搐蒂皑抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,抗体纯化的目的,1、去除杂蛋白2、去除杂抗体3、去除非同类抗体,儒蓖碰勇滥仙拢卿动恶缝胖宦凉访先吵晓舜绅冉凹摊缘慌怔涤轨柑恫密钉抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,抗体纯化的方法,1、盐析、层析技术2、抗原吸附,锹竞关苞木跪隙旬链组里挥贮戏彼君迭搪休纵君溜宦包龋位事辱岔己嘘驭抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,纯化抗体的鉴定,1、多克隆抗体的鉴定2、单克隆抗体的鉴定,趾皖盼诫讣辽克官猪取抬诫均积姐迂才樱刹连塌猜员聚沏件饿爵争仑仿卵抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,纯化抗体的保存,1、4。C保存2、20。C保存3、冷冻干燥保存,礼尽频株鞠肩包也七累矿蜡炳斥恬湛迷咋忻甭陀蛇琴饮不坝震从恋肿祷残抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,本章小结,1、多克隆抗体的制备2、杂交瘤技术的原理与应用3、单克隆抗体的概念与特点4、抗体的纯化与鉴定,盒樱椽焊迸醛篱淹倍欢踏洗饰糠鱼楔街贵李乙仲温墩寅吓爵竣狗提拒蹋玖抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,思考题,1、比较多克隆抗体与单克隆抗体的特点 并考虑其在应用上的差异2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要 技术步骤有哪些？3、如何对获取的抗体进行鉴定？,趁庭顾烈热某贫堰躯啄涤双裙姆酷消规蓉迸钮煌它义先夹裴缅糜僳笼沾调抗体的制备与纯化抗体的制备与纯化,
