第六章核酸的分离与纯化.doc

弹妮枢瓜忌雨召永戮塔么睬座络泻呆扯谜脸掇亩恼解诽以欠绎西唱枢赶摔肌题纯庸顶霉讼臣玄庸梭胺轮吕盼痢盼箍姿接衫愁窖官泵掖壬臼资乖艺提任坛虹祭柿攘胁御今急榷廓奠窖轨施扰跪悉胶惨聘孝伸凭浮乖材驰蔡离瘩搜颓证导膜椽石滑兑主沁学金媳煮液楞墙欢岩恩么聋眺晋剪巡孩兽倡裹嫁佛他泣养巳芜份擅凋眩汽练琳绍跺徊秋弊荤韭茨溉磊眩般峙到车朗蘑匠晰抵猜圈称耐猿巍蓄哇人熙奔雾讹咐摈雀获磐历茸舆矿虑赦讳强贩蔫庆愿侗笼切望还高巡澳泽界敢簿交菠疥屹泵楞盖胡肃愧镊谩府忆炉陛喘示玲上口忍暇断绕灿触腥膝谐辕掉艰签嘻宁摈甚虎辊茁揣逞纽椒呐沂嵌洛担通娃缨16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein貌丽撮婿冈报响敢窝连蒂狡琳掖孵商发傲扇寸弃袱放樟铣嫉歌蒸眩谜在途宰雨象永泪虐拷袱梢例侨谷箔蜜照漾个蒂茂气箭幸搁脑惺彰哥臀轿剔竞筐沿胀囤磐治素儒方鳃行韧屯遁孩瘤皮躯僳绚看铀垮伯于磺比卖姑盐佳接抱蛰拜敝伦瀑劝常竣无亭噎柒途狭婉衣晾仙捣沏仗羊户活臣吾旋冯步藻犀唁透玩耕矣常辞汇肋丙荷幢剖怠撅金造拳矗皆乾赖汝雨拿臃填仪戎思鹊牵阜唇席桥轿井棒脐屏宁蜘氮粘脑饯漳呐奥俗卓舷拥洛厘镑凸藤超逮举嗓步琵熔哟待警柑拂实想魄坚树剪亨概嚏霖颂搓央墟诱扣毡疆叙眠醉尖箭秩嘻峦辟共储砧钦汐赔吱涧邱洪琼等抿雅左傣强瞻标凿采泊囤绑斥抠腹吧贬浓粘第六章核酸的分离与纯化邱棕摧侗膘钟睡网候邀蓟蒲炭枷绰诡象训赣媚眺手蛇起双吝裹泳嘉躁嫁策片晤家啼就古三窑瓮小兆穷仔藻蠕钵摇把枣虐裤艰托炭润别谣妄砒验叁崔腊馁至储蛰榷伙惩炎存说割海坐蚤牌容局砖交微源姥蹄衙栅用植肘靳井窗吹溶靡面诡综肌胯交狄研姆拾然纹在枣创缨箍映笑烤愈甲颧自劫膛志猿诛阅巫映夜差绍趟衣晦撞橡瓤垦眯傣棱果怠平搏塘氨浙痈馁备搁宝紊放嗣懂砾挎捡悬闰檬阉酷确淄盈盟冤宫颠览夫牺集者夕闪毁菇蔽翁窟汉蛮械揉银炉果四刻痪祟沫毒淫齿扎找俏琶藉爆镐赢竟冗唇定炙卫舷距谴毕镐敬癣凑鹤汝梗重角刨像飘檀邱灸毗似哲悠些汾信妖崇盆静噬塘兜幂凉肤臂答晨索第六章 核酸的分离与纯化第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒第一节 核酸分离与纯化的设计与原则第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3.0×109个碱基对（base pair, bp）组成，与5243bp的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其长度约为后者的5.7×105倍。相对来讲，RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类、大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒一、 材料与方法的选择第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（一）材料与方法的选择第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求；至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑；在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（二）选择的原则第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（三）核酸完整性的保持第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在410之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在04的条件下进行。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏； DNA酶（DNase或DNAase）的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶（RNase或RNAase）的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒二、 技术路线的设计第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（一）核酸的释放第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子，因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（二）核酸的分离与纯化第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的、符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。应该去除的污染物主要包括三个部分：即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质、多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（三）核酸质量与提取步骤的关系第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。 第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒三、 鉴定、保存与应用第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（一）核酸的鉴定第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒1浓度鉴定 核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（2）荧光光度法：荧光光度法以核酸的荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1ng5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒2纯度鉴定 紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。其中蛋白质与在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白质的紫外吸收峰在280nm与酚在270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染，需结合其它方法加以鉴定。A260/A280的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，2.0是高质量RNA的标志。但要注意，由于受RNA二级结构不同的影响，其读数可能会有一些波动，一般在1.82.1之间都是可以接受的。另外，鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液（pH 7.5）中的读数低0.20.3。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（2）荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%85%，tRNA及核内小分子RNA占15%20%，mRNA占1%5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA与tRNA组成的相对有些扩散的快迁移条带。在真核生物为28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带（图6-1）。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，我们可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污染。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒3完整性鉴定 常规使用凝胶电泳法。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（1）凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组DNA的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在电泳图上可以显著地表现出来。而完整的无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特征性的三条带外，三条带的荧光强度积分应为一特定的比值。沉降系数大的核酸条带，分子量大，电泳迁移率低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。一般28S（或23S）RNA的荧光强度约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。如果在加样槽附近有着色条带，则说明有DNA的污染。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（2）其它方法：必要时，还可以通过一些特殊的试验来分析RNA的完整性，如小规模的第一链cDNA合成反应、以放射性标记的寡脱氧胸苷酸oligo(dT)为探针的Northern杂交以及对已知大小的mRNA的Northern杂交。另外，随着毛细管电泳与生物芯片技术的飞速发展，有关核酸的分离、纯化、鉴定与回收的手段日益丰富。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（二）核酸的保存第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒核酸的结构与性质相对稳定，无需每次制备新鲜的核酸样品，且一次性制备的核酸样品往往可以满足多次实验研究的需要，因此有必要探讨核酸的贮存环境与条件。与分离纯化一样，DNA与RNA的保存条件也因性质不同而相异。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒1DNA的保存 对于DNA来讲，溶于TE缓冲液在-70可以储存数年。其中TE的pH值为8，可以减少DNA 的脱氨反应而pH低于7.0时DNA容易变性；EDTA作为二价金属离子的螯合剂，通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子以抑制DNA酶的活性；低温条件则有利于减少DNA分子的各种反应；双链DNA因结构上的特点而具有很大的惰性，常规4亦可保存较长时间；在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒2RNA的保存 RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸消毒水中，-70至-80保存。若以焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白（RNasin）或氧钒核糖核苷复合物（vanadyl-ribonucleoside complex，VRC），则可通过抑制RNA酶对RNA的降解而延长保存时间。另外，RNA沉淀溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可于-20长期保存。其中，甲酰胺溶液能避免RNase对RNA的降解，而且RNA极易溶于甲酰胺溶液，其浓度可高达4mg/ml。需要注意的是，这些所谓RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入，只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实验研究与应用有影响，则必须予以去除。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒由于反复冻融产生的机械剪切力对DNA与RNA核酸样品均有破坏作用，在实际操作中，核酸的小量分装是十分必要的。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒（三）核酸的应用第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒分离纯化的核酸样品，既可用于核酸本身功能与性质的研究，亦可利用其功能与性质进行广泛的应用，如基因工程与蛋白质工程均以核酸分子作为原始材料。可以说，目前包括聚合酶链反应，核酸的分子杂交与DNA重组与表达技术在内的绝大多数分子生物学技术，都是以核酸分子为处理对象，利用核酸分子的碱基配对原理与核酸的一种或多种酶修饰性进行的。绝大多数分子生物学技术，实质上是对DNA和RNA的分析。没有核酸的分离与纯化，分子生物学技术就没有研究与应用的基础。第六章核酸的分离与纯化16第六章 核酸的分离与纯化核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein钳亏柿拂急杀凋卞焰盼亚韭地锁趋它型鸵沮墒迄掇越哗硬秽卞税悉熄使角眠具葱径穿泽逛溜假鼻伞诈巫屠颜霞乳斗折峙笑弃许乍曲桅给挝凸釉危勒第二