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,动物的细胞与组织培养,定义：从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理环境，在体外建立无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。,1 动物细胞培养,群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。,群体培养（左）和克隆培养（右）,Definitions of Tissue Culture Terms,cell culture-the maintenance and growing of dispersed cells outside the organism.Secondary cultureCells taken from a primary culture and passed or divided in vitro.These cells have a limited number of divisions or passages.tissue culture-the maintenance of a tissue or fragment in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or function monolayer-single layer of cells growing on a surfaceorgan culture-maintenance of tissues,whole or parts of organs in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or functionexplant-an excised fragment of an organ which usually retains some degree of tissue architecture,原代培养（primary culture）：即细胞或组织离开机体后的首次培养。primary culture-started from cells,tissues or organs taken directly from an animal传代（passage）：培养的细胞生长到一定的密度后转移到新的容器中培养或需要更换到新的培养液称为传代或传代培养。subculture-the transplantation of cells from one culture to another(passaging)细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系。如果可以连续传代则称为连续细胞株原代培养细胞成功传代即为细胞系。cell line-arises from the primary culture at the time of the first subculture-finite life spancontinuous cell line-a cell line which has been transformed-infinite life span细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,2 发展历史,动物细胞（组织）培养技术起源于19世纪所应用的某些胚胎学技术。动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家Harrison。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。Harrison-isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres-grew them in frog lymph-observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.法国学者Carrel功不可没。他1923年设计的卡氏培养瓶，用鸡胚抽提液培养心肌组织取得成功并维持34年之久,特别注意到实验中的无菌操作。,表三、实验室中常用的几种细胞系,Henrietta Lacks,American black,died of cancer of uterine cervix in 1951,3 应用领域,生产单克隆抗体和疫苗。组织与器官再生、培养。动物细胞基因工程,动物细胞培养生产的生物制品,（1）病毒疫苗：乙肝疫苗(HbsAg)、脊髓灰 质炎疫苗(Polio)、狂犬疫苗(Rabies)等。（2）非抗体免疫调节剂：干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、B 细胞生长因子（BCGF）、巨噬细胞激活因子（MAN）T 细胞替代因子（TRF）等。（3）多肽生长因子：神经生长因子（NGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因 子（EGF）、血清生长因子（SF）等。,（4）酶类：组织血纤维溶酶原激活剂（tPA）等。（5）激素：红细胞生成素（EPO）、促黄体生成素（LH）、促滤胞素（FSH）等。（6）肿瘤特异性抗原：癌胚抗原（CEA）等。（7）单克隆抗体（MCAB）。（8）病毒杀虫剂：杆状病毒等。（9）皮肤移植：单细胞培养等。,3.1.1 动物细胞的特点问题一与微生物、植物细胞相比，动物细胞有哪些特殊之处？,动物细胞与微生物细胞相比，主要有以下不同：,（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。（2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易 受污染。（3）培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪 切力敏感。（4）动物细胞间主要以聚集体形式存在。（5）原代细胞一般繁殖50代左右即退化 死亡。,3.1.2 体外培养,原代培养（亦称初代培养）传代培养（亦称继代培养）。,Primary Culture,retention of the 3D shape,outgrowth and migration of cells,3.1.3 动物细胞（组织）培养的生长特性,体外培养细胞类型,1 粘附型细胞 anchoragedependent,粘附生长是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面,称为单层附壁培养。,细胞贴壁延展过程,Contact inhibitionWhen cells contact each other,they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycle.Transformed cells will continue to proliferate and pile up each other.,体外培养细胞类型（形态）,1 成纤维型2 上皮型3 游走型4 多形型,（一）成纤维细胞型细胞 Fibroblast,外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形。前者贴壁后呈长梭形，圆形细胞核位于中央，胞质外伸出23个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。有时也相互平行排列，成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。心肌，平滑肌、血管内皮细胞的体外培养常呈此类型。,（二）上皮型细胞 Epithelial cell,类似上皮细胞的细胞，特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状”。皮肤的表皮细胞、消化道与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等，Hela,（三）游走型细胞 wandering,分散生长，一般不连接成片形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养器皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则。该类细胞不稳定，外形不规则且不断变化，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。表现这种细胞形态的主要是单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、某些肿瘤细胞等。,（四）多形型细胞 Polymorphic,多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经元和神经胶质细胞。,影响细胞形态的因素,能够影响细胞形态学特征的主要因素包括：血清成分、培养基成分及添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。例如，一些已分化的细胞在有无血清的培养液中生长，形态特征就会有所差异。形态会因条件而改变（来源、生长条件和功能状态不同）。,2 非粘附型细胞（悬浮型细胞）,体外生长不贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。,悬浮培养类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易。这种方法有多方面的优越性，易于大规模生产，便于过程的控制。可惜能在悬浮状态下生长的细胞种类有限，且不太方便观察。,3.2 动物细胞培养 的基本技术,3.2.1 体外培养的条件,3.2.1.1 与微生物细胞培养相比动物 细胞培养的特殊性大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。,对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。,培养条件,Temperature,pH,Dissolved gas,Nutrients,培养基,20世纪40年代以后，从事动物组织培养的各国科学家把研究的重点集中在培养基的改造上。1951年，Earle等人开发了供动物细胞体外培养的培养基。,MediaThe choice of media is cell type specific and often empirical-no all purpose medium.Should provide:nutrients,buffering capacity,isotonic,and be sterile,天然培养基,动物血清、组织提取液、鸡胚胎提取液等优点：营养价值高缺点：成分复杂、来源有限、成本较高小（胎）牛血清蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、多种生长因子等成分。,合成培养基,Earle 于1951年首次使用。优点：成分已知、易控制缺点：无法替代一些未知成分解决途径合成培养基中添加小牛血 清，彼此互补,无血清培养基,血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分血清培养基缺点：对后期产物的分离、提纯及检测造成干扰。来源有限、成本较高无血清培养基：试图全部替代血清成分，尤其是生长因子（例如胰岛素）、激素（例如生长激素）等。,培养过程图解,细胞系生长过程的3个主要阶段,（一）原代（初代）培养期 指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。组织和细胞刚离体，生物学特性变化不大，具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，很适合做药物测试，细胞分化等实验研究。,（二）传代期 原代培养细胞一经传代后便称为细胞系，在全生命期中该阶段的持续时间最长。一般情况下，当传代10-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。,（三）衰退期 该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。,动物细胞培养过程生长曲线,Kinetics of growth phase,Logarithmic scale!,Cells reach confluence(cover all available surface),每代细胞的生长曲线：潜伏期对数生长期停止期（平台期）,每代贴附生长细胞的生长过程,分为以下几个时期游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期:此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,小结,动物细胞培养的特点无血清培养基在实验研究中的特殊意义细胞类型及生长特点细胞系生长阶段和各阶段特点细胞系生长曲线及各期特点,动物细胞培养技术2,常用的培养方法,悬滴培养Hangingdrop cultivation培养瓶培养旋转管培养Rotate tube cultivation克隆培养法Cloning culture technique细胞同步化培养动物细胞大规模培养 分批式batch，流加式fedbatch，半连续式semicontinuous，连续式，灌流式perfusion,三 原代培养与传代培养,取材,TrypsinEDTAcollagenase,取材部位是否准确组织是否保持活性材料处理是否恰当,2 原代培养组织块培养,3 传代培养消化法,一般传代培养的步骤,(1)吸出培养瓶内旧培养液。(2)加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。(3)25分钟后检查，如有细胞间隙变大，细 胞质回缩现象，终止消化。(4)吸出消化液，加入PBS液，轻轻转动以 免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单 用胰蛋白酶，可直接加入培养液。(5)用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬 液，计数后记录其浓度。（6）重新接种培养。,四 建立细胞系过程,肿瘤细胞的体外培养与建系过程,以人上皮型食管癌109细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程：,（1）取材,食管癌患者的手术标本,（2）原代培养,1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于4下静置2小 时。2）然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含 青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗 涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培 养瓶中。3）于37、CO2培养箱内培养2小时后，再 补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培 养液，继续培养。,（3）建系过程,组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为ECA109。ECA109 经生物学特性分析后确定细胞系建立成功,建立细胞系的要求,国际上对Certified cell的确定尚无统一标准1 组织来源2 细胞生物学检测：形态，特异结构，细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特异性如腺细胞，肿瘤细胞3 培养条件和方法,细胞系和细胞株鉴定,鉴定指标：纯度，细胞学特性，稳定性，污染情况鉴定方法：细胞形态学观察，绘制生长曲线，计算分裂指数，染色体组型和带型分析，同工酶酶谱检测档案资料及管理使用：美国标准细胞库ATCC,人遗传突变细胞库HGMR,细胞衰老细胞库CAR,细胞计数,四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左线和上线边的细胞。细胞密度个/ml平均细胞数x103x稀释倍数,培养细胞活力测定,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠,2.台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力,3 四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104 细胞/孔，每孔培养基总量200ul（96孔培养板每孔容积370ul），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2mgml的MTT液（50ul孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150ul孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm），记录结果，绘制生长曲线。,操作步骤:,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,液氮罐,Cryopreservation,How does freezing induce damage?cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth Thawing rate is also important(thaw rapidly),最适度以下的,最适度以上的,慢冻程序,标准程序：当温度在-25 以上时，12/min 当温度达-25 以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1 预先配制冻存液：含20%血清培养基 10%DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入 适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷 冻细胞名称和冷冻日期。4 存活率可达80一90。DMSO液用培 养液配好，避免因临时配制产热而伤害 细胞。,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍 以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细 胞。,五 动物细胞大规模培养1 基本流程,2 生物反应器系统,（1）生物反应器设计依据,除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。,（2）分类,一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等。,（3）动物细胞培养的载体,实现规模化急需解决的问题 问题一 细胞贴壁生长的载体,微载体培养技术,1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。微载体是直径60-250m的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。,*贴壁培养的载体材料 与生物反应器系统,主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。后者是一重要技术，包括微载体、多空载体、微囊,*一种微载体产品及孔状的显微结构,材料：生物相容性，机械稳定性热稳定性,（4）生物反应器培养系统与工艺,问题二 系统构建问题三 传代技术问题四 培养工艺,与微载体结合的生物反应器系统,（5）培养工艺连续灌注培养,生长在载体上的动物细胞,收获细胞,一个问题：怎样实现接种传代培养？,球传球技术,（5）应用举例,生物反应器培养非洲绿猴肾细胞vero和狂犬病毒,1 材料与方法,（1）细胞：非洲绿猴肾细胞Vero细胞(ATCC):150-180代。（2）培养基：DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium GIBCOL)，5%10%小牛血清和硫酸庆大 霉素，用碳酸氢钠或盐酸调至pH7.2。（3）微载体：CT-3微载体（4）反应器：5LCellGen细胞培养反应器(NBS.CO.U.S.A.)，50LCellCul-50A细胞培养生物反应器,2 培养过程,以CelliGen5L细胞培养反应器作为种子罐培养，当细胞生长到一定密度时，将细胞和新的微载体一起移入CellCul-50A细胞培养反应器中。自动控制：温度370.1、溶解氧为50%空气饱和度、转速为2032rpm。细胞培养到一定密度后，接种狂犬病毒。第2天停止搅拌，抽出培养基，加病毒培养基继续培养。病毒培养条件为pH7.4pH7.8、溶解氧为40%60%空气饱和度、温度为37.0。,3 培养结果,培养8天，细胞密度达1.1107cells/ml。细胞贴附在微载体上生长的电镜照片见图。在整个培养过程中细胞形态饱满光滑、长较快，细胞在较短的时间内达到高密度，且可多层生长。接种病毒后10天，能产生较高的病毒量。,六 动物细胞体外培养 现状与展望,存在的问题,（一）细胞密度低，产物浓度低。（二）细胞群体在大规模、长时间培养过程中分 泌产物能力易丢失，或产物活性易降低。（三）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微 载体很昂贵。因此大多仅能在小规模范 围内研究，难以转化为生产力。（四）目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较 欠缺。（五）在线监测水平技术不完善，限制了优良培 养系统的开发。,今后应重点开展的工作,（一）细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面 的理论研究。（二）开发能高密度生长、大量分泌目标产品的 细胞系。（三）开发细胞生长性能优良、细胞解离容易，并能重复使用的新型廉价的微载体。（四）研制高效的培养模式与系统，包括新型的 无菌生物反应器培养系统与工艺、先进的 在线检测、分析与自动控制技术等。（五）相关基因工程与细胞培养技术结合的技术研 究。,思考题,1 原代培养取材时应注意的问题，有哪些培养方法？各自适应范围是什麽？2 贴壁细胞传代采用什麽方法？其技术关键是什麽？3 大规模细胞培养有哪些操作模式？各有哪些优缺点？你认为如何来改进和发展？,