细胞工程第5章：细胞融合与单克隆抗体技术2文档资料.ppt
Chapter5、细胞融合与单克隆抗体技术,51 细胞融合技术511 细胞融合现象512 细胞融合技术513 动物杂交细胞的筛选及其遗传表型的控制52 单克隆抗体技术521 杂交瘤技术的基本原理522 单克隆抗体的特性523 单克隆抗体的制备,51 细胞融合技术,511细胞融合现象一、细胞融合（cell fusion）：是指两个或多个真核细胞合并成为一个 双核或多核细胞的生物学现象和过程。二、细胞融合过程分四个阶段：细胞接触 细胞质膜的融合 细胞质 重组 遗传物质的选择,三、细胞融合的分类：,基因型相同的细胞融合，形成的双核或多核细 胞，称同核体（homokaryon）；短期死亡；不同基因型的细胞融合 形成的双核或多核细胞，有丝分裂 双亲染色体 称异核体（杂种细胞）融合 分裂成二 合核体（synkaryon）（也称单核杂种细胞）,四、细胞融合基本原理（见图）,512 细胞融合技术,一、细胞融合技术：是指通过物理化学和生物方法人为地将两个不同来源的细胞融合产生目的杂种细胞的工程技术过程。,二、细胞融合的发生：,自然界存在很多细胞融合现象，如：受精、成肌细胞融合，但频率低；细胞内吞与外排也属细胞膜融合现象；细胞内膜系统物质运输过程等。,三、细胞融合技术分类：,动物细胞融合细胞 细胞融合 人为方法构建 植物细胞 自然融合技术 原生质体融合 细胞拆合人为方法，人为组合,四、融合促成法 加速细胞融合的方法,物理法电融合诱导法：20世纪，80年代，直流电脉冲，膜电位改变，质膜破裂、融合，融合率高，重复性强，损伤小，易观察、控制；（见图）,化学法,NaNO3诱导法中和细胞表面负电荷，促进聚集；高Ca2+和pH诱导法改变膜电位；PEG诱导聚乙二醇（卡波蜡，Carbowax），分 子量20020000，1000，为固体；醚键联结，分子末端 带负电荷，1974年，对大麦、大豆原生 质体融合；（见图）高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导法：提高100300 倍，融合率高，PEG浓度35%最佳，毒性小，可靠质量，来源方便，常用；,生物法,用仙台病毒（sendal virus，也称日本血凝病毒HVJ，属副流感类群），20世纪，60年代，日本，冈田（Okada）发现，原因是各种细胞均有其受体，病毒膜碎片还有融合功能，主要是53000糖蛋白的作用。,五、不同细胞融合的条件及其主要应用,六、细胞融合基本过程（见图）：,融合后的柑橘,融合柑橘与母本比较,513 动物杂交细胞的筛选及其遗传表型的控制,采用动物细胞融合技术诱导细胞融合后，形成由亲本细胞同核体及异核体组成的细胞混合群体。不同的细胞在体外培养条件下有着不同的生长特性。在未融合的亲本细胞中，缺乏增殖能力的终端分化亲本细胞，往往在短期培养后死亡，无限传代或部分有限世代的亲本细胞保持原有生长特性，往往能较快地适应培养条件而成为优势生长的细胞群；,由于杂交细胞在融合处理后的细胞群体中数量少，生长缓慢，往往受到优势生长的亲本细胞抑制，需要筛选；杂交细胞在体外培养过程中，可能因为基因的丢失或突变，使其原有的遗传表型消失或减弱，应定期检测杂交细胞遗传表现型，进行控制。,一、杂交细胞的筛选：,杂交细胞筛选可根据不同细胞生理、生化特性，设计具体的筛选方案和选择体系，优先选择杂交细胞；,二、杂交细胞表型及其控制：,杂交细胞的遗传表型具有多样性（双亲特征都有，且植物细胞能与动物细胞杂交）和不稳定性（染色体排斥、基因丢失，可以用来进行基因定位）；狭义的杂交细胞遗传表型的控制是指基于对杂交细胞的基因型和（或）表型动态分析的基础上，使有利用价值或人们关注的表型得到维持的措施。,杂交细胞遗传表型的控制过程：遗传表型的动态观察和定期分析（核型与带型）建立种子细胞库，定期传代分种，避免细胞过度生长稳定的染色体数（或倍性、个数变化）与带型，能有稳定的产物,52 单克隆抗体技术（杂交瘤技术）,杂交瘤细胞 是指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞；它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力，又具有参与融合的体细胞的一些特征。,杂交瘤技术（hydridoma technique，也称MAb制备技术）是指建立杂交瘤细胞系的技术；通常指B细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B细胞融合，以建立能分泌特定的均质抗体。,MAb 系指由一个B细胞克隆产生的，只识别某一特定抗原决定簇的均质抗体。克隆（cloning）指无性繁殖系，也指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。,521 杂交瘤技术的基本原理,动物受到抗原刺激后可发生免疫反应，产生相应的抗体；免疫反应极为复杂，它由多种多样的免 疫应答细胞共同完成；病原微生物和天然抗原，往往含有多种 抗原决定簇，刺激免疫系统后，可形成 针对不同抗原决定簇混合抗体；,一个抗原具有不同决定簇（表面位点达 10008000个），它可针对不同决定簇的抗体所识别；产生一种抗体的B细胞极少，一个细胞 集落中往往只有1-2个；B细胞是缺乏增殖能力的终端分化细 胞，体外克隆十分困难；,1957年，Burnet提出“克隆选择学说”，认为每个B细胞都有一种特殊受体，接受适当刺激后，能活化并扩增形成克隆，分化为浆细胞产生专一抗体；1975年，英，Kohler和Milestein利用细胞融合技术，获得以小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞（理论上是B细胞）为亲本的杂交瘤细胞系，能产生特定的均质抗体1984年，获诺贝尔生理医学奖。,522单克隆抗体的特性（见图表）,与多克隆抗体（PcAb，polyclonal antibody）相比，MAb具有以下显著特点：高度均质性结构、亲和力、亲合力相同；高度特异性单一抗原决定簇，不发生交叉反应；高效价ELISA（酶联免疫吸附测定法）效价达成10.6-10.8；来源稳定，可大量生产；容易标准化。,523单克隆抗体的制备（周期长，技术性要求强）,制备MAb涉及一系列实验技术方法及试剂的选择，包括抗原、免疫动物、免疫方案、筛选检测抗体的方法、骨髓瘤细胞、饲养细胞、血清、融合剂、细胞融合方案、杂交瘤细胞克隆化、细胞的扩大培养和冻存等。,一、抗原的纯度保证特异性MAb的关键；二、免疫动物 雌性，BALA/C小鼠，6-8周龄为宜；三、细胞融合：骨髓瘤细胞的选择：广泛使用的是SP2/0细胞；HAT选择性培养液（H：次黄嘌呤，A：氨基嘌呤，T：胸腺嘧啶核苷）；,四、抗体筛选：,美国伯乐酶标仪680,五、杂交瘤细胞的克隆化：有限稀释法 软琼脂培养法六、单克隆抗体特性鉴定：使用评介；特异性分析 类或亚类、中和活性、亲和力、类型分析 识别的抗原表位是否适合；亲和力比较 免疫组化染色和免疫印迹 结合位点的分析,七、特异性抗原的定量检测：如某些病毒抗 原、肿瘤相关抗原、细胞因子受体等；八、激素、药物及其蛋白质精细结构分析；九、肿瘤基础研究及临床诊断、治疗；十、移植排异反应：抗CD3MAb、IL-2MAb 药物治疗排异反应、TNF-MAb治疗脓 毒症和类风湿性关节炎。,B淋巴细胞-浆细胞产生或有的细胞因子：（1）Ig-免疫球蛋白(damage),IgD、IgA、IgM、IgG和IgE；（2）BCR-B细胞表面抗原受体；T淋巴细胞产生或有的细胞因子：TCR-T细胞表面抗原受体；白细胞产生或有的细胞因子：MHC-主要组织相容性复合体；HLA-人白细胞抗原体系；免疫系统产生或有的细胞因子：CD-白细胞分化因子；IL-白细胞介素；CSF-集落刺激因子；IFN-干扰素；LT-淋巴毒素；TNF-肿瘤坏死因子；TGF-转化生长因子,【习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系 PcAb与MAb、单价抗体与双价抗体 一抗与二抗 杂交细胞筛选与HAT选择性培养液 抗体筛选与ELlSA法,
