细胞生物学研究方法文档资料.ppt
1.光学显微镜2.电子显微镜 3.扫描探针显微镜,100m,100nm,1 nm,一、显微技术,普通光学显微镜,相差显微镜,微分干涉差显微镜,荧光显微镜,激光扫描共聚焦显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,普通光学显微镜,最大分辨率，0.2um,原理：,利用一组透镜将标本连续放大。,一、显微技术,1.光学显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,分辨率或分辨力,在人的明视距离25cm处，能清楚的分辨两点的最小间隔的能力，用R来表示。,R=0.61/nsin,一、显微技术,普通光学显微镜,聚光器,目镜,标本,反射棱镜,光源,物镜,普通光学显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,标本制备：,取材,固定,染色观察,直接涂片,甲醛、戊二醛、乙醇,包埋切片,(固定),普通光学显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,口腔上皮细胞,血细胞,Fulgen染色,2）应用：主要观察活细胞,倒置相差显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,1）利用光的衍射和干涉效应,神经母细胞,10X40,10X60,倒置相差显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,倒置相差显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,荧光显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,微管呈绿色、微丝红色、核蓝色,微管呈绿色,染色体呈蓝色,荧光显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,原理：,物镜,标本,分光镜,滤光片,滤光片,光 源：紫外光,标本内的荧光分子：,标本自身含有荧光物质,用荧光物质标记标本,检测细胞表面或细胞内特定的抗原,应用：,特点：,荧光显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,荧光检测,细胞结构的三维重建,应用：,激光共聚焦扫描显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,原理：,激光共聚焦扫描显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,共聚焦针孔,物镜的焦平面,光源针孔,物镜,检测器,分光镜,激光光源,激光共聚焦扫描显微镜,一、显微技术,1.光学显微镜,透射电子显微镜,扫描电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,透射电子显微镜,成像原理:电子束穿透样本而成像,应用:观察细胞内部超微结构,一、显微技术,2.电子显微镜,透射电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,透射电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,标本的制备：,固定,包埋,切片,染色,（重金属盐）,观察,透射电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,1)光源,2)透镜,3)成像原理,4)标本处理,与光学显微镜比较:,透射电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,极细的电子“探针”扫描样品表面，收集二次电子成像。,主要观察样品的表面三维形态结构。,扫描电子显微镜,成像原理,主要应用,扫描电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,小肠绒毛,Absorptive Epithelial cell,microvilli,扫描电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,带有冠细胞的人类卵子,卵子表面的精子,扫描电子显微镜,一、显微技术,2.电子显微镜,细胞悬液,单一种类细胞,离心或者吸附性差异,蛋白酶消化,机械剪切,消化、机械并用,二、细胞的分离和培养,1.从组织中分离,皮肤瘢痕,小鼠胸腺,骨髓间质干细胞,平滑肌细胞,成纤维细胞,T细胞,大鼠骨髓,平滑肌,研磨、过滤、离心,吸附培养瓶底,剪碎、蛋白酶、离心,附在瓶壁爬出来,二、细胞的分离和培养,1.从组织中分离,流式细胞仪,应用：,1)分选细胞,2)细胞表型分析,3)染色体分析,4)DNA分析,二、细胞的分离和培养,2.细胞分选（cell sorting）,基本原理：,激光,在一定的营养条件下将细胞在体外进行培养，使之继续生长增殖的过程。,基本材料与器材：,培养容器，培养基，血清，CO2培养箱，超净工作台，倒置显微镜,二、细胞的分离和培养,3.细胞培养（cell culture）,超净工作台,CO2培养箱,细胞培养无菌操作,细胞体外生长的条件:,1）需要营养;,2）适宜温度、湿度;,3）适宜的pH值;,4）无菌的环境以及支持物.,二、细胞的分离和培养,3.细胞培养（cell culture）,传代培养(subculture cell)：,将细胞按一定的比例转瓶扩大培养。,原代培养(primary culture cell)：,直接从机体取下细胞、组织 和器官后立即进行培养。,二、细胞的分离和培养,3.细胞培养（cell culture）,细胞系中挑出一个细胞，培养形成的克隆。,原代培养的细胞经传代成后就叫细胞系。,细胞系(cell line)：,细胞株(cell strain)：,二、细胞的分离和培养,3.细胞培养（cell culture）,破坏细胞膜,低渗,超声振荡,机械研磨,各种细胞器及大分子,离心,层析,电泳,生物质普技术,三、细胞组分的分级分离,其他分子生物学技术,离心分离技术：,差速离心,移动区带离心,分离细胞器、生物大小分子常用的技术，根据各种颗粒或大分子的大小、密度的不同进行分离。,等密度离心,三、细胞组分的分级分离,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,差速离心,低速,较高速,高速,离心分离技术：,三、细胞组分的分级分离,等密度离心,移动区带离心,细胞融合技术,四、细胞工程技术,细胞核移植技术,干细胞研究技术,指两种不同类型的细胞在灭活病毒或者PEG处理下融合成为一个异核体，经过有丝分裂后两个核也融成一个核，形成杂交细胞。,细胞融合技术,四、细胞工程技术,英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,单克隆抗体制备,细胞显微操作仪,核移植技术,多利羊,四、细胞工程技术,1,3,2,多利,卵细胞,体细胞,去核,取核,核移植,1*,获取目的细胞,培养细胞,处理细胞,标本观察、组分分析,细胞研究大致流程,组织切片、处理,个体处理,THANKS!,
