细胞干扰素(医学PPT课件).ppt

干扰素,1,interferon(IFN),病毒感染后的机体反应,干扰素及白介素,自然杀伤细胞,T细胞免疫,非特异性免疫,特异性免疫,一 干扰素的概念,二 干扰素的种类,三 干扰素的作用,四 干扰素抗病毒机理,五 生物学活性,一 干扰素的概念,概念：干扰素（IFN）是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒反应，而产生的一组结构类似，功能相近的低分子糖蛋白。,二 干扰素的种类,三 干扰素的作用,一、型干扰素（1）抗病毒和抗肿瘤 1）诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制；2）增强NK细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤；3）促进MHC-类分子表达，增强CTL对病毒感染 细胞和肿瘤等靶细胞的杀伤。（2）免疫调节（较弱）：与型干扰素类似。,三 干扰素的作用,二、型干扰素（1）主要起免疫调节作用 1）活化巨噬细胞；2）促进APC(s)表达MHC-类分子，提高抗原递呈能力；3）促进MHC-类分子表达和增强CTL细胞的杀伤活性;4）增强NK细胞的杀伤活性；5）促进B细胞分化、增殖；（2）抗病毒和抗肿瘤作用(与型干扰素类似，次要)。,T细胞,IFN,NK 细胞,激活,提高NK细胞活性,抗病毒活性抑制细胞分裂抑制血细胞生成促进MHC和 MHC 分子表达,多种细胞,干扰素的作用,四 干扰素抗病毒机理,最初感染的细胞由于病毒核酸剌激被诱导产生干扰素，它透过细胞膜向外扩散并进入血液循环进入其它细胞。干扰素不能直接阻止病毒吸附、穿入或释放，而是作用于宿主细胞，使其产生抗病毒蛋白质，附着于细胞的核蛋白体上，选择性地抑制病毒mRNA翻译为病毒蛋白质，从而影响病毒结构蛋白和酶类的合成，使复制受到阻碍而呈现抗病毒的作用。,四 干扰素抗病毒机理,干扰素具有广谱抗病毒作用，又具有细胞种属特征。即某一种动物产生的干扰素只能保护同种属或近缘种属动物细胞。干扰素是一种活性很强的生物制剂，既能治疗病毒性疾病，又具有抗肿瘤和调节免疫机能的作用。,四 干扰素抗病毒机理,干扰素抗病毒作用,作用机理不是直接杀灭病毒,IFN 抗病毒蛋白基因 抗病毒蛋白(蛋白激酶,磷酸二脂酶),降解病毒mRNA 抑制病毒蛋白合成 抑制病毒组装、释放,抑制病毒复制,中断病毒感染；限制病毒扩散,五 生物学活性:,广谱的抗病毒作用，一种IFN可以抑制多种病毒；抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促进痊愈;调节免疫功能；抑制肿瘤细胞生长；,IFN作用特点:,产生的时间早；中断受染细胞的病毒感染，限制病毒扩散；IFN诱导的抗病毒蛋白，只对病毒起作用，不影响宿主细胞蛋白质合成。,谢谢,专题二 抗体制药,第一节 概述第二节 单克隆抗体第三节 基因工程抗体第四节 噬菌体抗体工程第五节 抗体诊断试剂和抗体药物,19,第一节 概述,1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、球蛋白，并证明抗体活性主要存在于球蛋白组分。,20,抗体工程药物的概念,通过细胞工程或基因工程方法制备，用于治疗的单克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体，以及抗体免疫偶联物或抗体融合蛋白,称为抗体工程药物。,又称抗体药物、单克隆抗体治疗剂、抗体治疗剂。,抗 原(antigen,Ag)-是指那些能够刺激和/或诱导机体免疫系统发生免疫应答、产生抗体和/或致敏（效应）淋巴细胞，同时又能与免疫应答产物在体内外特异性结合，发生免疫反应的物质。如：病原微生物、免疫血清、药物、疫苗对机体来说，抗原相当于一个国家已知的或潜在的、外部的或内部的“敌人”。,23,免疫原性：指能刺激机体产生抗体和/或致 敏淋巴细胞的性能。反应原性：能与相应的抗体和/或淋巴细胞 发生特异性结合，发生反应的性能。,24,完全抗原：既具有免疫原性，又具有反应原性的抗原。如微生物、异种血清半抗原：又称不完全抗原。是指其本身只有反应原性，但没有免疫原性的简单小分子的抗原物质。如某些药物（青霉素等）、多糖、类脂。,25,目前，在中草药中发现广泛存在半抗原，如小檗碱、茶碱、丹参酮等，具有生化活性基因的化学成分都有可能成为半抗原，这些半抗原可与体内蛋白质结合成完全抗原，造成一些过敏反应。,26,抗原的特异性既表现在免疫原性上，也表现在反应原性上。,沙门氏杆菌,大肠杆菌,抗体 是对其抗原有极强专一性 的魔弹 或 巡弋飞弹,研 究以免疫转印法检测 特定抗原医 疗以毒素连结抗体攻击 病变細胞检 验以 ELISA 侦测特定 病原体,27,免疫球蛋白的结构,抗体：能与相应抗原特异性结合的具有 免疫功能的球蛋白。,抗体的产生过程：机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴细胞被激活，增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范围从150,000到950,000道尔顿。分五类：IgG在血清中含量最高，达7580%,是抗感染 的主要抗体;IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为 五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的 第一个抗体；IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参 与局部的免疫反应;IgD在血清中含量很低;IgE在血清含量最少。,免疫球蛋白,IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,动物血清中产生抗体的时间示意图,抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后，Ig将取代IgM,抗体研究的发展阶段：以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表,用抗原免疫动物来获得多克隆抗体。以1975年Milstein&Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)为代表。以1994年Winter,创建了噬菌体抗体库(repertoire of antibodies displayed on phages)技术,以基因工程方法制备抗体为代表。在此基础上发展成抗体工程。,多克隆抗体:一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。单克隆抗体(Monoclonal antibody McAb):由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。,多克隆抗体和单克隆抗体,用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。,单克隆抗体的应用,35,基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。1984年：人-鼠嵌合抗体1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3，而且消除了鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。,36,第二节 单克隆抗体,McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。,注射抗原,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,细胞融合、筛选,杂交瘤细胞,细胞培养,筛选，继续培养,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,体外培养,（注射到小鼠腹腔）,体内培养,单克隆抗体,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,多克隆抗体制备过程,1,2,3,4,1,2,3,4,单抗,细胞融合,取出脾細胞,+癌細胞,各抗体分开,单克隆抗体制备过程,1、抗原与动物免疫,抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：BALB/c小鼠或Lou大鼠免疫方法：体内免疫和体外免疫,2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养,基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*1073*107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释,用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在4006000，浓度在10%60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。,（1）细胞融合液中的细胞类型：4或5种。（2）如何去除脾-瘤以外的融和细胞？,HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻杂交瘤细胞：长期生长繁殖；利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA,3、筛选阳性克隆与克隆化,常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。,有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培养液。,软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。,培 养 板,（1）免疫酶技术,原理：将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，从而表明某种抗原或抗体的存在。,（2）免疫荧光技术,原理：将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光素标记的抗体或抗原作为标准试剂，用于检测和鉴定抗原或抗体。免疫荧光技术用于细胞抗原的抗体检测,特别是检测患者活检组织标本。,（3）放射免疫技术,原理：将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。放射免疫测定原理示意图,4、单抗检测,RIA（放射免疫测定）ELISA（酶联免疫吸附试验）FACS（流式细胞仪）IFA（间接免疫荧光法）,酶联免疫吸附法(ELISA),原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。,ELISA,配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml)+细胞冻存液(30%40%牛血清，50%60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30-70液氮“快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏,5、杂交瘤细胞的冻存与复苏,细胞冷冻的意义：,防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。,6、单克隆抗体的大量制备,可获得10g/ml的抗体。多采用RPMI 1640培养液，添加10%20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100g/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可2*107/ml,收集的单克隆抗体可达400 g/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达108。,（1）体外培养法：,基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。,（2）动物体内诱生法,可获得10m/ml的抗体。常用方法。,腹腔注射法,7、单克隆抗体的纯化,根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：,体外诊断试剂IgG类-沉淀处理+亲和层析,IgM类-沉淀处理+凝胶过滤,体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析+阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。,盐析沉淀亲和层析离子交换层析,McAb的纯化,8、单克隆抗体的性质鉴定,Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用western blot,单克隆抗体的特性,高度特异性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性,A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。,McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：,A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量,需要解决的问题：,解决问题的方法或途径基因工程技术,1984年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3。,优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗,单克隆抗体的优点与局限性,局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高,中国人源基因工程抗体研究获重大成果,中国预防医科院病毒所青年科学家梁米芳研究员率领的课题组，在“治疗用人源基因工程抗体基础与应用研究”中取得多项重要成果。在世界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒人源基因工程抗体，并获得拥有自主知识产权的全抗体表达载体系统。与血源制品比较，此抗体具有抗体含量高、无免疫源性、无污染源、可连续规模生产等优势，是一类新兴的特异性抗病毒感染的生物工程药物。此成果为我国防治病毒性疾病探索出一条新的途经，具有良好的应用开发前景。-2004,原液保存,细菌疫苗工艺流程示意图,菌种筛选,种子批的建立及检定,菌种接种,原液合并,半成品 配置,杀菌,原液收获,扩大培养,分装,包装,检定,中国疫苗研究：,病毒原液保存,病毒疫苗工艺流程,毒种筛选,种子批的建立及检定,毒种接种#培养细胞,原液合并,半成品 配置,病毒灭活,病毒的收获过滤,扩大细胞培养,分装,包装,检定,原代细胞的 制备或传代细胞复苏,减毒活疫苗,第三节 基因工程抗体,基因工程抗体(Genetic engineering antibody)指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。,将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,一、人源化抗体,鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理,目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性,原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（C）。在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H和L链的V区基因分离出来，分别与人Ig的H链和L链的C区基因连接，即成为人鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的嵌合抗体.,人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。方法：将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力,（一）嵌合抗体,尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。,（二）改型抗体,经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变,结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）,人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。,定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。,Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段单域抗体最小识别单位,二、小分子抗体,分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体1/801/3。,Fv,ScFv,单区抗体,最小识别单位,Fab,由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。,(1)Fab,Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,Fv,ScFv,连接肽,Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌,即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,(3)单域抗体,VH,约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。,(4)最小识别单位,CDR,可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;不含Fc，没有Fc带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。,小分子抗体的优点及应用,应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗,优点：,三、双特异性抗体和多价抗体,双链抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。,Hollinger等巧妙地将抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特异性抗体。,所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。,分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。,化学交联BsAb,将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤(quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于临床。,细胞工程BsAb,多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。,基因工程BsAb,从广义讲应属于双功能抗体范畴。,（1）配基配基型融合蛋白，如 CD4-Fc.（2）配基Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig（3）配基FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3(4)受体FV型融合蛋白（5）酶抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）,四、抗体融合蛋白,原核细胞表达：真核细胞表达：酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞、真菌等。转基因植物表达：烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白量的1.3%。转基因动物表达：单基因水平上做转基因鼠。,基因工程抗体的表达,第四节 噬菌体抗体工程,它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P 或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。,噬菌体抗体库技术,1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。,噬菌体表面展示系统(phage surface display system),用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人,（一）基本原理和程序,噬菌体抗体库,（二）噬菌体表面展示文库技术的要点,外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端,将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游,随机克隆入相应载体形成组合文库,从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段,用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。,使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。,筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，,（三）噬菌体抗体库技术的特点,1、模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。,2、避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。,3、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。,将抗体的基因型和表型紧密联系起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。,该项技术的优点:,噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。,第五节 抗体诊断试剂和抗体药物,抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈现某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物。,一、抗体诊断试剂,1、血清学鉴定用的抗体类试剂,（1）鉴定病原菌用的抗体试剂,直接凝集反应,（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂,（3）妊娠诊断试剂,妇女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3个月内可达到高峰。此时检测尿液中的HCG，就可确定是否怀孕。,（4）抗ABO血型系统血清,2、免疫标记技术用的抗体类试剂,给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。,（1）荧光抗体诊断试剂,荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。,酶标诊断试剂a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊断试剂c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂d、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂,（2）免疫酶抗体诊断试剂：,把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。,（3）放射免疫用抗体诊断试剂,常用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度0.1 ng/mlb、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度0.1 ng/mlc、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记d、AFP放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度15 ng/mle、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度1 ng/ml,3、导向诊断药物 由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未临床广泛应用。,二、抗体治疗药物,以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有20多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，受试病人超过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅30%,目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应用阶段。障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。,常用的抗癌药物：氨甲喋呤（methotrexate,MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM)丝裂霉素(mitomycin,MMC）、环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、新抑癌蛋白(neocarzinostatin,NCS)、正定霉素(doxorubicin,DOX)等。,治疗乳腺癌曲妥珠单抗药物,我国第一个基因重组人源化单克隆抗体药物泰欣生（尼妥珠单抗）,治疗直肠、结肠癌的贝伐单抗,瑞士罗氏生产的安维汀,抗体药物研制新药的先锋,化学合成药物,天然来源药物,放射性核素,基因组、蛋白组研究,抗原、药物靶点,细胞因子、活性蛋白,小结,杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。,20世纪80年代诞生了应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体，它具有如下优点：通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据治疗的需要，制备新型抗体；可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。,