第七章现代生物学.ppt

第七章 现代生物学技术在蛋白质工程中的应用,传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、酶联免疫吸附测定（ELISA）新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术,第一节 表面展示技术,运用 DNA 重组技术在噬菌体、细菌、真菌、病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术等方面得到了广泛应用。,概念,表面展示技术是利用基因工程手段将外源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。,一、噬菌体展示技术,噬菌体展示技术（phage display techniques，PDT）是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术（如右图所示）。1985 年 Smith 等首次应用了该技术。,1988年Parmley和Smith将B-Gal表达于噬菌体的表面，并证实该蛋白有生物活性，可以被相应的抗体识别。随后，许多有功能的蛋白都被表达于噬菌体的表面，包括分泌性蛋白(如抗体、生长激素)、细胞内蛋白和酶类，为这些蛋白的基因工程改造奠定了基础。从理论上讲，任何蛋白只要能够分泌到细菌周质腔均可被表达于噬菌体的表面。,1990年，George等证明噬菌体不会因外源性DNA片段的插入而影响其本身的粘附、侵入及整合。这种带有外源性基因片段的噬菌体感染宿主菌表达出外源性基因产物和PIII的融合体融合壳蛋白，由于PIII的特殊定位，外源性片段得以在噬菌体表面表达，并同时保持了本身的三维结构和功能，进而使噬菌体成为一个理想的携带工具。,Phage structure:,Fiber structure,1 原理,具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因（主要是基因或基因）之间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的完整性和活性。,噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图,噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。其建立基于三个原则：在衣壳蛋白基因（主要是基因或基因）的 N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白的天然构象，并能被相应的抗体或受体所识别。,利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。,展示文库的特点,富集程度高，由此建立的展示文库的可达106-1012位置明确，噬菌体的PIII蛋白定位特殊，定位于噬菌体的尾部，其氨基末端为噬菌体结合F纤毛噬菌体的衣壳蛋白有很大的可塑性大部分的蛋白质都可在其表面表达,目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有：丝状噬菌体展示系统 噬菌体展示系统 T4 噬菌体展示系统 T7 噬菌体展示系统 其中，T7 噬菌体系统可以高、中、低拷贝展示不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展示系统。,单链丝状噬菌体展示系统 P III 展示系统，主要用于获得高亲和力的克隆，形成单价表面展示体系 P VIII 展示系统，主要用于筛选亲和力较低的克隆，形成多价表面展示体系 P VI 展示系统,T4噬菌体展示系统 其病毒颗粒在宿主细胞内组装，不经过分泌途径，因而其表面展示多肽的范围更广，尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质噬菌体展示系统（同上）可展示有活性的大分子蛋白（100kDa以上）以及对宿主细胞有毒性的蛋白，在后基因组时代前景相当可观,应用的基本原理（Panning),将已经建立好的噬菌体文库进行淘选所谓淘选，是将展示文库作为流动相，而将与欲选择的重组基因产物的特异性的配体（或称靶分子）作为固定相，洗去不能与固定相特异结合的文库大部分成员，将特异结合的成员留下进一步扩增，并反复数轮淘选，即可将无用的基因去掉而将有用的基因富集并分离出来。,Panningprocessing,2 应用,（1）噬菌体展示技术与蛋白质工程 将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到噬菌体展示载体上，构成一个高容量的噬菌体多肽文库时，该文库可用于特异性功能多肽的筛选。同样，利用噬菌体展示 cDNA 文库，可筛选出特定的蛋白质或基因。,（2）噬菌体展示技术与抗体工程 噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入第三次革命。噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。,将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phage antibody library）。,（3）生产高效低价疫苗 它能方便地大量生产疫苗用抗原表位，可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗。,（4）研究诊断用疫苗（两种情况）,1 在抗原决定簇已知的情况下，构建重组噬菌体可以为血清学分析提供大量的抗原来源，因为它不需要裂解宿主细胞而直接分泌到培养基中；抗原制备纯化简单，成本低下；噬菌体颗粒稳定，易于长期保存；能在同一个噬菌体同时展示不同的病原体的抗原决定簇。,2 在预先不知道诊断用靶抗原的情况下，使用患者血清从抗原决定簇库中筛选出展示特异性抗原决定簇的噬菌体，这种噬菌体只能与病人血清抗体反应，而不能与正常人的血清反应，从而建立起疾病的特异性诊断方法。,(5)筛选酶抑制剂 Norgren等利用该技术筛选到了7种酶系种的6种抑制剂，Dennis从肽库中筛选到能非竞争性地抑制丝氨酸蛋白因子VIIa活性的肽段,3 噬菌体展示技术的局限性,(1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。(2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合。作为噬菌体的宿主，大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制，不能进行氨基酸的修饰，蛋白质的糖基化或不能合成D型氨基酸。,(3)噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。从建库开始，密码子的选择与寡核苷酸的合成，即编码肽的基因就带有一定的偏爱性，这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。,二、核糖体展示技术与 mRNA 展示技术,核糖体展示（Ribosome display）技术与 mRNA 展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行，用 mRNA 的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它大大提高了文库容量和筛选通量（10121014），而且能够增加表达的蛋白质溶解度。,核糖体展示技术的基本原理,核糖体展示技术的基本原理是通过PCR扩增目的基因的 DNA 文库，同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环，并置于具有偶联转录-翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面。去掉3端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3末端,将蛋白质和mRNA连接在一起。并形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用 RT-PCR 扩增，进行下一循环的富集和选择，最终筛选出高亲和力的目标分子（如图所示）。,核糖体展示原理示意图,核糖体展示的过程,mRNA 展示技术的原理,mRNA 展示技术也是以 mRNA 和多肽复合体作为筛选的基本单元。其与核糖体展示的区别在于，复合体中 mRNA 与蛋白质通过一个小分子共价连接，如嘌呤霉素（如图所示），且该复合体的产生完全在体外，因此很容易构建大型突变文库（含10121013 个独立序列）。,mRNA 展示技术原理示意图,嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳定的氨酰tRNA类似物。当3端带有嘌呤霉素连接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时，嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成稳定的酰胺键，使mRNA 的3端与多肽的羧基 端共价结合起来。,三、细菌表面展示技术,细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS）或流式细胞筛选仪（flow cytometry）是非常有效的高通量筛选方法。此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。,原理,细菌表面有许多能显示保留单一性状在细胞表面的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白很容易通过荧光探针显示出来，荧光产物和细胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白质库的一个非常有价值的特性，同时也是定量检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。,流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下几个明显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧光激活细胞分选技术（FACS）进行更快速更高效筛选。,细菌表面展示文库FACS筛选原理示意图,目前已有的多种细菌表面展示系统,细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如鞭毛、菌毛 晶核蛋白（Icenucleation protein，INP）、自体转运蛋白（Autotrans-porter）、S2 层蛋白 枯草杆菌的芽胞外膜，L2 型大肠杆菌和变形杆菌的细胞膜,四、酵母表面展示技术,酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起来的真核展示系统。酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。酵母细胞颗粒大，可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以 或 a 凝集素作为融合骨架。,1 目的蛋白-凝集素表面展示系统,此系统将目的蛋白作为 N 端，与凝集素 C 端部分融合，目的蛋白经凝集素展示于酵母细胞表面。凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定能力由蛋白质 C 端 320 个氨基酸决定，富含 Ser/Thr 残基。,迄今，已经有多个应用凝集素的 C 端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是-半乳糖苷酶（如图）。,2 a凝集素-目的蛋白表面展示系统,这是一种将目的蛋白作为 C 端与a 凝集素 Aga2p 亚基的 N 端融合的表面展示系统。a 凝集素通过与 凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与凝集素不同，a 凝集素由两个亚单位的糖蛋白组成。,a-凝集素的组成,a-凝集素由核心亚单位（Aga1p）和结合亚单位（Aga2p）两个亚单位组成，Aga1p共 725 个氨基酸，合成后被分泌到胞外，与酵母细胞壁的 葡聚糖共价连接。Aga2p 共 69 个氨基酸，合成后也被分泌到胞外，但其通过 2 个二硫键与 Aga1p 结合，仍与酵母细胞相连。,Aga2p 的 N 端部分参与二硫键的形成，外源蛋白通过与 Aga2p 的 C 末端融合可展示于酵母细胞表面（如图）。,酵母表面展示技术的应用,蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力和稳定性的定向进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟。活的口服疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体，因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有免疫原性。因而可通过在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。,第二节 蛋白质分析鉴定技术,一、蛋白质芯片技术蛋白质芯片（protein chip）技术是为满足人们对蛋白质的高通量、大信息量、平行分析研究而产生的。蛋白质芯片的产生将基因组学平台和蛋白质组学平台很好地连接起来。,1 蛋白质芯片的概念,蛋白质芯片（protein chip）也叫蛋白质微阵列（protein microarray)，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片（如图）。,图 典型的蛋白质微阵列芯片,2 蛋白质芯片的分类,根据用途的不同蛋白质芯片可分：蛋白检测芯片 蛋白功能芯片,蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片段抗体、受体等固定在载体上，制备检测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。,蛋白功能芯片：将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白-酶反应的研究。,3 蛋白质芯片的制备,Cavin M等制作出高密度蛋白质微阵列,4 蛋白质芯片中探针的标记,探针类型：蛋白质、酶或其它配基 标记物类型：荧光染料、酶，此外还有红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（GFP）,5 蛋白质芯片信号的检测及数据处理,信号检测：激光共聚焦检测、电荷藕合器件（CCD）检测 数据处理：应用一定的计算机软件对检测中的扫描图进行处理，形成数据，得出结论。,6蛋白质芯片的特点,快速、定量分析大量蛋白质；使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即可进行分析和检测；采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好；所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强，其不足在于稳定性及操作复杂等因素限制。,7蛋白质芯片的应用,（1）基础研究方面的应用蛋白质DNA相互作用研究:用生物化学表面芯片（PS20），以 DNA 作诱饵，结合特异蛋白质，用质谱法检测，筛查转录因子。蛋白质-mRNA 相互作用研究:通过mRNA 转录与 RNA 结合蛋白质的内在联系建立了一种高通量的方法，用于鉴定在结构上和功能上有关的 mRNA 转录。,（2）临床方面的应用蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤其是在疾病的诊断和疗效判定，即生物学标志物的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。如应用于自身性免疫疾病的诊断，肿瘤的早期诊断等。由于蛋白质芯片是在分子水平进行诊断和预测的，因而它提供了一种更准确的方法。,（3）新药研制方面的应用 研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低耗、快速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前新药开发工作的重中之重。蛋白质芯片高通量、并行性的特点，大大地加快了化合物的筛选速度。蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达就可以确定被检药物对人体是否有毒副作用，或达到多大剂量才会引起毒副作用。,（4）环境监测及食品工业中的应用蛋白质芯片还能运用于环境监测及食品工业中，用来检测环境或食品中微量的有毒化学物质或病原菌，如大肠杆菌。,二、蛋白指纹图谱技术,蛋白指纹图谱技术也称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS），是一种包含层析与质谱的特殊蛋白质芯片技术，用于蛋白质的定量分析。它结合了芯片微阵列与质谱技术两者的优点，是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术。,1 原理,2 组成,3 应用,结合生物信息学的分析方法从大量的蛋白质和多肽中筛选出潜在的生物标记物，建立高特异性和敏感性的蛋白质指纹图谱模型。蛋白指纹图谱技术在医学领域的应用，主要用于多种疾病，特别是肿瘤的早期诊断。,第三节 其他新蛋白质工程技术,目前新兴的蛋白质工程技术原子力显微镜技术蛋白质打靶技术蛋白质分子印迹技术蛋白质截短技术蛋白质错误折叠循环扩增技术,一、原子力显微镜技术,原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）由 G.Binnig 等于 1986 年发明，是扫描探针显微镜家族的主要成员，其横向分辨率为 23 nm，纵向分辨率为 0.5 nm。它可以在接近生理环境的大气或液体条件下成像，获得直观的三维表面信息，还可以对原子和分子进行纳米级操纵，因此在生物结构的研究中具有独特的优势。,原子力显微镜系统结构,1 原理,AFM 的基本原理是通过控制并检测样品针尖间的相互作用力来分析研究样品的表面性质的。其工作原理如图所示。,2 应用,采用AFM 研究白蛋白、血红蛋白、胰岛素等吸附在不同固体界面上的行为用于蛋白单分子结构与功能研究AFM 可用于观察蛋白质的分子结构及其参与的生理活动等。如抗体结构、纤维蛋白聚合、胶原装配、抗原抗体识别等。,二、蛋白质打靶技术,蛋白质打靶是最近几年发展起来的一种研究蛋白质功能的新方法。由于其高度的特异性和可控性，正越来越广泛地应用于神经功能的研究中。,原理,它采用了一种被称为免疫外源凝集素的新工具：这是一种通过 DNA 重组技术而获得的 IgG的Fc 片段和目标受体胞外域的融合蛋白。这使其保持了天然的与配体结合的特异性和亲和力，正是通过这种结合而发挥影响受体功能的作用。,与其他体内分子控制方法相比，蛋白打靶的优点有：,与基因打靶仅限于在鼠体应用不同，蛋白打靶原则上可用于任何物种；与单克隆抗体相比，其在改变靶目标功能方面是高效的；免疫外源凝集素是高度稳定的蛋白，不像反义核苷酸易被降解，经典的药理学研究缺少蛋白打靶高度的特异性。,三、蛋白质分子印迹技术,分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology，MIT）是模拟自然界所存在的分子识别作用，如酶与底物、抗体与抗原等，以目标分子为模板合成具有特殊分子识别功能的分子印迹聚合物的一种技术。,分子印迹技术的发展历程,1949 年 Dickey 首次实现了染料在硅胶上的印迹，提出了“专一性吸附”的概念，这一概念可视为“分子印迹”的萌芽。1973 年 Wulff G 研究小组对分子印迹聚合物的成功制备使该研究取得了突破性进展，并广泛应用于色谱分离、抗体或受体模拟、生物传感器以及酶的模拟和催化等诸多领域。,随着 Mosbach 和 Whitcombe 等在共价、非共价和共价-非共价混合型分子印迹聚合物制备技术方面的创新性工作，分子印迹技术得到了广泛研究和迅猛发展。1997 年还成立了国际分子印迹协会（Society for Molecular Imprinting，SMI）。,分子印迹机理主要有共价法和非共价法两种，下图为非共价法过程示意。,分子印迹技术的核心是制备分子印迹聚合物，其制备原理为：,在合成高分子前，将待分离物质（即印迹分子、模板分子）加入能与之发生分子间作用的功能单体中，形成复合物；然后通过加入交联剂、引发聚合反应，形成高度交联的固态高分子，把这种作用固定下来；接着利用化学或物理方法将印迹分子从高分子中移去。,1蛋白质印迹聚合物的聚合方法,蛋白质印迹聚合物的聚合方法主要有包埋法、表面印迹法和抗原决定基法。,目前蛋白质印迹技术仍存在的问题,首先，蛋白质分子印迹过程和识别过程的机理是亟待解决的问题。其次，目前使用的功能单体、交联剂和聚合方法都有较大的局限性，尤其是没有令人满意的聚合方法以得到高吸附量的 MIP，这就使得分子印迹技术远远不能满足实际应用的需要。第三，如何寻找到温和而有效的洗脱剂也是亟待解决的问题。,2应用前景,蛋白质印迹聚合物是一种人工模拟抗体，与生物抗体相比较，具有对高温、酸、碱耐受性强，在苛刻条件下可操作性及制作成本低、可重复使用等优点。,四、蛋白质截短技术,蛋白质截短技术（Protein truncation test，PTT）是从蛋白质水平对基因突变进行检测的新技术。,原理,PTT 的原理是通过蛋白质水平进行突变检测，整个过程包括把双链 DNA 的 PCR 产物转录成 RNA，进而由 RNA 翻译成蛋白质。这一组反应可以相继在已商品化的兔网织红细胞裂解液中进行。,检测过程,体外翻译系统含 35S-标记的氨基酸进行SDS-PAGE电泳分离蛋白质。凝胶经固定、烘干，放射自显影 2-16 h。若检测的序列中存在导致翻译提前终止的突变，则最终的蛋白质产物为两种。,五、蛋白质错误折叠循环扩增技术,蛋白质错误折叠循环扩增技术（protein misfolding cyclic amplification，PMCA）就是最新发明的在体外诱导朊蛋白（PrPc）产生错误折叠生成朊毒粒（PrPsc）的技术。是近几年来刚刚建立的朊病毒微量检测技术。,PMCA 技术的原理与特点,PMCA 是一种在体外进行的人为加速朊毒粒错误折叠过程的技术。第一个阶段是让痕量的 PrPsc和大量的 PrPc 共同培育，在外界条件下促使 PrPc向 PrPsc 的转化，形成 PrPsc聚合体；第二阶段是用超声波对样品进行处理，以打碎第一阶段培育过程中形成的PrPsc 聚合体，使 PrPsc“种子”的数量得到增加，从而使下一个循环扩增的效率进一步提高。,谢 谢！,