生物化学_第十一章_DNA的生物合成课件.ppt

,第十一章 DNA生物合成（DNA Biosynthesis）大连医科大学生物化学与分子生物学教研室 崔秀云,教学要求：遗传信息的中心法则 DNA 复制的一般规律 真核生物DNA复制所需要的酶及因子 真核生物DNA复制的过程 原核生物DNA复制的过程 DNA的逆转录过程 DNA损伤与修复,遗传信息传递的中心法则（central dogma）,在DNA进行合成时，以亲代DNA为模板合成子代DNA，即将遗传信息准确地复制到子代DNA 分子上，这一过程叫做复制（replication）。以DNA为模板合成与DNA某段核苷酸顺序相对应的RNA分子，此过程称为转录（transcription）。然后以RNA中的mRNA为模板，按照其核苷酸顺序所组成的密码（codon）指导蛋白质合成，这一过程称为翻译（translation）。遗传信息传递方向的这种规律称为中心法则（central dogma）。某些RNA病毒可通过逆转录过程进行遗传信息的传递。,遗传信息的中心法则,翻译,第一节 DNA复制的概况一.DNA的半保留复制,在DNA复制过程中，两条螺旋的多核苷酸链之间的氢键断裂，然后以每条链各自作为模板合成新的互补链。这样新形成的两个子代DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。在此过程中，每个子代分子的一条链来自亲代DNA。另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semi conservative replication)。,图111 DNA半保留复制及实验依据,二、DNA复制在起始点上通常是双向复制,复制起始点向两个方向延伸，形成两个方向相反Y型或叉型结构，称之为复制叉（replication fork）。复制叉是由于DNA 双链解开分成两个单链，以各自单链作模板，子链沿模板延伸所形成的Y 字形结构，似叉子形状故称复制叉,图 11-2 双向复制及复制叉示意图,DNA新链的合成总是从5到3方向进行，而模板链则从3到5方向与之对应。由于DNA双螺旋中的两条链是反向平行的，所以在复制时一条链合成的方向和复制叉前进的方向相同，可以连续复制，而另一条链合成的方向与复制叉前进的方向相反，故不能连续复制。这种DNA的复制方式称为半不连续复制。连续复制的链称为前导链或领头链（leading strand），不连续复制的链称为后随链或尾随链（lagging strand）。后随链先合成多个小片段，然后再连接起来。,三、DNA 复制是半不连续复制,图11-3 DNA 半不连续复制示意图在DNA复制中，两条母链分开形成复制叉，子链的合成都是5 到3 方向。与复制叉前进方向相同的链是连续复制的，称前导链（leading strand）。与复制叉前进方向相反的链的合成是不连续的，称尾随链（lagging strand）。,DNA 聚合酶不能从头合成，大多数DNA 复制必须有一小段RNA 为其提供自由的3-OH 末端，在此末端上DNA 聚合酶催化参入的脱氧核苷酸，形成3，5磷酸二酯键，使DNA链延伸。利用模板首先合成的一小段RNA 称引物，这一过程为引发（priming）。,四、DNA 复制必须有引物,五、DNA 复制具有高度保真性,DNA 是遗传的物质基础，DNA 复制的高度准确性对保持遗传物种的稳定性具有重要的意义。无论原核生物还是真核生物，负责DNA 复制的主要DNA 聚合酶在聚合反应时对底物的选择严格按碱基配对的原则。此外，这种酶还具有3到5外切核酸酶的活性，能及时地将错配的碱基（即核苷酸）水解掉。这种外切核酸酶的活性起到了校正作用（proofreading）。细胞修复系统也是保证DNA 高度保真性的重要因素。,第二节 参与真核生物DNA复制的有关酶类及蛋白因子,表11-1真核生物DNA复制的两种主要聚合酶及有关因子蛋白质（英文代号）功能 DNA聚合酶/引发酶（DNA pol/primase）引物的合成 DNA聚合酶（DNA pol）DNA复制主要酶 拓扑异构酶（TopoI，TopoII）松弛DNA双螺旋 解(螺)旋酶(Helicase)能解开DNA双螺旋 单链DNA结合蛋白(SSB)及复制蛋白A（RPA）结合单链DNA,复制因子C（RFC）参与滑动夹子 的装配 增殖细胞核抗原（PCNA）滑动夹子 核酸酶H（RNaseH）去除RNA引物 盖核酸内切酶I（FENI）去除RNA引物 DNA连接酶（DNA ligase）连接冈崎片段,表11-1真核生物DNA复制的两种主要聚合酶及有关因子2蛋白质（英文代号）功能,1DNA聚合酶（DNA polymerase）,DNA聚合酶以DNA为模板,以dNTP为原料,需要镁（或锌）离子作激动剂催化如下的反应:,式中(dNMP)n代表含有n个脱氧核苷酸的DNA片段，dNTP代表任何一种脱氧核苷三磷酸。,图11-4 DNA 聚合酶的三维结构模式图,2引发酶（primase）,引发酶能利用DNA 为模板，以NTP为底物，合成一小片段RNA，作为DNA 聚合酶的引物。在真核生物，引发酶与DNA聚合酶形成一个复合物，这个复合物合成大约10个核苷酸长的RNA引物，然后DNA聚合酶的大亚基发挥DNA 聚合酶的活性，以dNTP为底物合成大约15-30个脱氧核苷酸以延长引物。RNA-DNA 引物（大约40个核苷酸）合成后再由其他DNA聚合酶延长DNA 链。,3拓朴异构酶（topoisomerase）,在复制过程中，DNA的超螺旋结构必须解开，拓朴异构酶能松弛超螺旋。人类有两种拓朴异构酶，分别为I型和II型。,图11-5 DNA 拓扑异构酶 II 作用示意图,4解(螺)旋酶(helicase),在DNA复制中以单链DNA为模板，合成子代DNA。解螺旋酶能解开双螺旋，其作用是在复制叉前解开一小段DNA。,5单链DNA结合蛋白(single-strand DNA binding protein,SSB),单链DNA结合蛋白对单链DNA有高亲和力，能特异地结合到分开的单链DNA上。对DNA复制区形成的单链DNA有稳定作用。在真核生物中，一种单链DNA结合蛋白称之复制蛋白A（replication protein A,RPA）结合到暴露的单链上。,图11-6.解旋酶及单链DNA 结合蛋白的作用示意图,6.复制因子C（replication factor C,RFC）,RFC是一种夹子的装载因子（clamp-loading factor）。RFC帮助这个环的装配。此因子作为DNA聚合酶和之间的连系物或纽带，有助于前导链和后随链的同时合成。,7增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）,增殖细胞核抗原是DNA聚合酶的辅助蛋白质，包含在引物的识别复合物中。DNA聚合酶催化DNA合成反应的连续性是由PCNA来承担的。PCNA的三个亚基绕着DNA形成一个滑动夹子（sliding clamp）,DNA聚合酶附着于滑动夹子上。PCNA是在复制的细胞中发现的第一个核抗原，为此而命名。此因子也存在于全身性红斑狼疮病人血清中。,图11-7 滑动夹子（a）夹子加载蛋白如RFC与DNA结合。（b）夹子加载蛋白与PCNA装配成滑动夹子。(c)DNA聚合酶与滑动夹子相结合，开始沿模板前进。(d)PCNA的结构，PCNA的三个亚基形成一个环，DNA从大孔中间自由通过。,8核酸酶H和盖内切核酸酶（RNaseH and flap endonuclease 1,FEN1）,它们参与去除RNA引物的作用。核酸酶H是一种内切核酸酶，降解RNA引物，留下一个核苷酸连在冈崎片段的末端,由FEN1完成去除最后一个核苷酸。,9.DNA连接酶,DNA连接酶催化两个DNA片段通过3，5-磷酸二酯键连接在一起，形成更大的DNA片段。这一反应需要ATP供能。DNA 连接酶不但在DNA复制中起作用，而且在DNA损伤的修复和重组DNA中不可缺少。,图11-8 DNA 连接酶催化的反应,第三节 真核生物DNA的复制过程,真核生物DNA是在细胞S期开始复制。DNA的复制从多个复制点开始复制过程大体上可分成以下几个阶段。,一、DNA复制的起始二、DNA链的延伸三、DNA复制终止,一、DNA复制起始过 程1DNA复制的起始,真核生物有多个复制起始点(origins of replication,ori)。复制起始点有特殊的序列。复制起始点称为自主复制序列（autonomously replicating sequences,ARS）。此序列含有由11个核苷酸组成的保守序列：A（T）TTTATA（G）TTTA（T）。,一个称之为起始识别复合物（origin recognition complex，ORC）的大的蛋白复合物组装于此。ORC在起始点上的组装还不足以开始起动，必须有另一种称为小染色体维系蛋白（mini-chromosome maintenance protein,MCM）的复合物参与。MCM有解旋酶活性。这一激活过程是由细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖蛋白激酶调节的。真核生物DNA复制的起始过程见(图11-9),A：起始辩认复合物（ORC）结合到起始位点上。B：小核染色体维系蛋白（MCM）结合到上面。C：在细胞周期的调节信号作用下后，起始复合物被激活，解旋酶的活性 打开了亲代双链，形成一个小泡。RPA结合到暴露的单链上。解旋酶 附着于DNA上，小泡被扩大。D：聚合酶/引发酶 复合物合成第一个RNA 引物和短的DNA。E：RNA引物被聚合酶延长，脱氧核苷酸参入。,图11-9 真核生物DNA复制的起始,2RNA引物的合成,引发酶与DNA聚合酶形成一个复合体，能识别起始位点，并且以核糖核苷三磷酸为底物（NTP），以解开的一段DNA为模板，合成一个短链RNA（810个核苷酸）引物。然后从引发酶的活性转变为DNA聚合酶的活性，RNA引物的3-OH末端为合成新的DNA单链的起点，以dNTP为原料，延长引物大约15-30个脱氧核苷酸。,图 11-10 引物及引物的合成以DNA 为模板，以NTP为底物，在引发酶的催化下，形成3，5磷酸二酯键。,二、DNA链的延伸DNA聚合酶/引发酶产生RNA-DNA后，当达到一定长度（大约40个核苷酸），DNA聚合酶不具备持续合成的能力，RFC紧密结合到引物-模板接合处，DNA聚合酶与模板DNA脱离，再引发另一个引物的合成。RFC负责组装PCNA滑动夹子，然后DNA聚合酶（pol）结合到PCNA组成的滑动夹子上，导致pol/之间的转换。由DNA聚合酶完成冈崎片段延伸，最终长度130-200个核苷酸，当它遇到原先已形成的冈崎片段5末端时，pol/PCNA复合物从DNA上释放下来。前导链引物合成后由DNA聚合酶连续延伸DNA 链，长度可达5-10 kb。,两条链均按5到3方向合成，一条链3末端的方向朝着复制叉前进的方向，可连续合成，称前导链（leading strand）。另一条链5末端朝着复制叉，合成是不连续的，形成冈崎片段，此链称后随链(lagging strand)。,图 11-11 DNA冈崎片段的形成,2RNA引物的水解,引物的去除通过两个步骤，首先由RNase H降解RNA引物，留下单个核糖核苷酸连接到冈崎片段上。然后，由盖内切核酸酶（flap endonucleae 1,FEN1）除去最后一个核苷酸。FEN1也能除去由于DNA聚合酶产生的某些错误的碱基。,总结真核生物DNA合成的过程（后随链的合成）见图11-12,11-12 参与真核DNA复制后随链的酶及复制过程,A：RPA,一种单链DNA结合蛋白，结合到单链模板上，使连续的复制叉解开双链。B：在聚合酶/引发酶作用下开始合成RNA引物。C：引物合成达到810个核苷酸后，复合物的聚合酶活性起作用，合成15-30个脱氧核苷酸以延长引物。然后，聚合酶/引发酶复合物从模板上解离。D：RFC结合到这个片段的末端，催化装配由PCNA构成的滑动夹子。E：聚合酶复合物结合到滑动夹子上，并延长冈崎片段。F：当复制复合物达到RNA引物时，引物被RNaseH和 FENI共同作用下水解。G：留下的间隙由连续延长的冈崎片段所填补，存在的缺口由DNA连接酶封闭。,三、DNA大分子的形成,DNA连接酶将相邻的两个DNA片段连接起来，形成大分子DNA链。由于DNA聚合酶具有校正功能，即通过它的核酶外切酶的功能，能及时切除错配的碱基，使DNA复制具有高度的保真性，保证遗传信息的稳定性。,四、端粒DNA的合成,端粒(telomeres)是染色体末端的结构，它是由许多富含鸟嘌呤核苷酸的特殊的重复顺序DNA及相关蛋白质组成的复合体。不同种属重复序列组成不同。端粒酶（telomerase）是催化端粒合成的酶。端粒酶是由蛋白质及RNA组成的，它具有逆转录酶的活性，能与自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA,图11-13 端粒与端粒酶端粒DNA：人的DNA 的3末端存在的重复顺序（TTAGGG）n端粒酶：酶本身含有与端粒DNA序列互补的RNA片段，催化端粒DNA-3末端的延长。,图11-14 A 端粒酶催化端粒的合成人的端粒是由TTAGGG重复序列组成的，端粒的3末端TTA与端粒酶中的RNA碱基互补;以此RNA为模板通过逆转录延伸端粒的3末端;端粒酶经过转位重新与端粒的3末端的TTA配对,催化另一个重复序列的合成.,图11-14 B 端粒的形成过程（D）当富含G-的链延长到足够长度时，引物酶合成一段RNA引物，与富含G-链的3-末端互补,（E）DNA聚合酶利用新合成的引物填补C-丰富的链，DNA 连接酶封闭缺口最后，（F）引物被去除，在富含G-的链留下12-16 个核苷酸。,第四节 原核生物DNA的复制表11-3 细菌与真核生物复制具有相似功能组分的比较,功能 细菌 真核细胞合成的主要酶 Pol III核心酶 Pol 拓扑异构 Omega()蛋白 TopoI gyrase（旋转酶）解旋酶 Dna B T抗原解链酶 DnaC T抗原 维持单链 SSB RPA 引物合成 DnaG Pol/引发酶 滑动夹 Pol III的亚基 PCNA 夹子装载 Pol III的亚基复合物 RFC 连接反应 连接酶 连接酶1RNA去除 Pol 1 RNaseH,FEN1,表11-4 细菌DNA聚合酶,分类 主要功能Pol I 合成冈崎片段，及DNA修复Pol II DNA修复Pol III 主要复制酶 Pol 1V 跨损伤修复Pol V 跨损伤修复,图11-15 DNA聚合酶的结构示意图,Pol III是由7-10个亚基组成的不对称二聚体。核心酶含有、三个亚基。亚基催化磷酸二酯链的形成，亚基具有35核酸外切酶的作用，是起较正功能的外切核酸酶（proofreading exonuclease），亚基为装配所必须。滑动夹子由两个亚基组成。它通过复合物夹子载体组装到DNA上，此步骤需要ATP。两个亚基围绕双螺旋形成一个环，以利于聚合酶沿着模板滑动。,图11-16 大肠杆菌聚合酶III 同时催化 DNA两条链的复制,两个聚合酶III结合在一起，尾随链形成环，才能穿过复合物。两条链在一个位置上合成。,图11-17 DNA 聚合酶I结构模示图,DNA聚合酶 I 是单一多肽链的蛋白质，主要由从A至R共18个-螺旋组成。特异的蛋白酶把DNA聚合酶 I 的F与G螺旋之间切断，得到从A至I的小片段和从G到R的大片段。大片段具有53聚合酶和35外切酶活性，称为Klenow片段，是分子生物学研究中常用的工具酶。,原核生物DNA聚合酶 I 的主要功能是去除DNA引物和对DNA损伤的修复。,原核生物DNA的复制过程与真核生物类似，也包括三个过程：1复制的起始 2片段的延长 3DNA复制的终止,一、原核生物DNA的复制过程,（一）复制的起始1复制起始点及复制叉的形成 大肠杆菌染色体只有一个复制起始点（oriC），含245bp。此区域含有三个串联重复序列，每个序列由13bp组成，富含A、T，有利于解链。其下游还有四个反向重复序列，每个序列含9bp（图11-18）。,图11-18 E.coli复制起始点的核苷酸序列排布,复制蛋白DnaA能识别该序列并与其相结合，然后DnaC与其结合。DnaC作为匹配媒体(matchmaker)，允许解螺旋酶DnaB结合，将母链DNA分开，形成一个复制叉。在起始点出现复制泡，从起始点向两个方向移动，这种复制是双向性的。参与细菌复制起始的蛋白质见表11-5。,表11-参与细菌复制起始的各种蛋白质及其功能 蛋白质名称 功能DnaA 识别起始位点DnaB 解螺旋酶活性，解开DNA双链DnaC 协助解螺旋酶的活性DnaG 引发酶活性，催化RNA引物合成SSB 单链DNA结合蛋白 Omega()拓扑异构 gyrase（旋转酶）拓扑异构,2引物的形成 在后随链上，DNA引发酶（DnaG）与解螺旋酶（DnaB）结合形成一个复合体。DnaB使复合物沿着模板链移动，促使母链分开。这种移动需要ATP水解供应能量。单链DNA结合蛋白（SSB）与单链DNA相结合，防止母链的退火，也防止发夹结构和其它二级结构的形成。由DnaG 引发酶合成短的RNA引物。,（二）DNA 片段的延长DNA聚合酶III从引物3-OH起，延伸冈崎片段大约1000-2000bp。当着聚合酶复合物遇到已经合成的冈崎片段的RNA引物时，延长反应则停止。DNA聚合酶III从DNA模板上解离下来。前导链则连续合成，直到终点。（三）DNA 复制的终止1RNA引物的去除,RNA引物的去除和空隙的填补均由DNA聚合酶I催化，该酶具有53外切核酸酶的活性，从冈崎片段5 端切除RNA引物；该酶的聚合酶活性，催化dNTP加到3-末端，填补RNA引物被除去而留下的空隙。此酶固有的35外切核酸酶的活性起着校正作用，提高空隙填补的凖确性。2冈崎片段的连接DNA聚合酶I填补空隙后，留有缺口，DNA连接酶催化冈崎片段之间形成磷酸二酯键，封闭缺口，连接成一条长链（图11-19）。3DNA复制的终止大肠杆菌从一个起始点开始双向复制各进行180，同时在终止点汇合，完成一次复制过程。Tus蛋白参与复制的终止，它使复制叉停止前进。细菌在生长条件适宜时，每20分钟就可繁殖一代。,前导链在聚合酶III与滑动夹子结合下连续合成。为合成后随链，解旋酶（DnaB）和引物酶（DnaG）沿着模板移动。每1000-2000bp 合成一个引物。聚合酶III延伸引物，一直达到前一个冈崎片段为止。聚合酶I去处RNA引物，并填补留下的空隙。最后缺口由连接酶封闭。,图11-19 原核生物DNA复制模式图,第五节 逆转录过程及其它复制的方式,某些病毒是以RNA为基因组，如RNA肿瘤病毒及AIDS病毒。它们分别造成人类肿瘤和免疫缺欠。逆转录酶（reverse transcriptase）可催化以RNA为模板合成DNA的反应。因此它又被称为RNA指导的DNA聚合酶（RNA-directed DNA polymerase,RDDP）。,逆转录酶具有三重功能。它既可利用病毒RNA作模板，合成一条与模板互补的DNA单链，二者形成RNA-DNA杂交分子。逆转录酶同时又具有核糖核酸酶H的活性，专一地水解RNA-DNA杂交分子中的RNA。留下来的单链DNA作模板，在该酶或其他DNA聚合酶的作用下，合成另一条互补DNA链，形成双链DNA分子,图11 逆转录过程,逆转录酶存在于所有致癌RNA病毒中，其功能可能与病毒的恶性转化有关。病毒的RNA通过逆转录先形成DNA（前病毒），然后整合到宿主细胞染色体DNA中去，使细胞内除合成自身原有的蛋白质外，又能合成病毒特异的某些蛋白质。逆转录酶也分布于正常细胞，如蛙卵、正在分裂的淋巴细胞、胚胎细胞（鸡胚及鼠胚）等。推测这类酶在细胞分化和胚胎发生中可能起某种作用。在重组DNA中，可利用逆转录酶合成某些mRNA相应的DNA，称互补DNA（complementary DNA,cDNA）。,一、逆转录及逆转录酶的作用,前导链及后随链分别有不同的复制起始点，不是同时合成的。前导链合成至全长的2/3时，后随链开始合成，故后随链的模板在前导链合成时被排斥出来，形成D-襻。两条链合成的方向相反。最后，前导链复制完成，后随链复制尚未完成。,二、线粒体DNA的复制,图11-21 线粒体DNA的复制（D-襻型）,三、嗜菌体DNA按滚环方式复制大肠杆菌嗜菌体如 X 174 是单链DNA病毒，在侵入细菌后，病毒在细菌中复制成双链环型DNA。由病毒自身编码的A 蛋白（具有核酸内切酶的活性）在复制起始点造成一个缺口，用产生的3-OH为引物，利用宿主酶体系，一边滚动一边进行连续复制。M13嗜菌体DNA在宿主细胞里也是滚环复制。,图11-22 嗜菌体DNA的滚环复制A蛋白打开正链，以内环（-）为模板，3-OH 为引物延长子链（红色）；第一次滚动完成，A蛋白切断子链和母链并连接成新的正链。以3-OH端继续复制，可产生许多子代单链环形DNA。,第六节 DNA的损伤与修复,一、基因突变可传递给子代细胞DNA碱基顺序的变化叫做基因突变,（一）基因突变的类型 1点突变：DNA分子中的一个碱基被另一种碱基所取代。由于单一碱基的改变而产生新的密码子，编码不同的氨基酸所造成的突变称错义突变（missense mutation）；由于一个碱基改变使正常的密码子成为终止密码子而导致转录终止，这种突变称无义突变（nonsense mutation）。这种突变引起的后果比错义突变可能更为严重。,2分子中有一个或多个碱基缺失。3分子中发生一个或多个碱基的插入。由于碱基的插入或丢失引起移码突变（frameshifts），移码突变不仅改变了氨基酸的种类和顺序，同时也引起编码多肽链提前终止或更罕见的延长。4DNA 链间共价交联：具有两个功能基团的烷化剂，如丝裂霉素可以使两条DNA链之间共价交联。5.三联体扩增(triplet expansion)这种三联体是简单重复多态性的一种（也称微卫星DNA）。在正常个体，重复数目有一定的范围。当重复数目超出正常时，这样便合成一个长的相同氨基酸残基插入到编码多肽链中，从而造成疾病。如亨逖敦氏病（huntington s disease）。,（二）基因突变的因素 1.自发性突变,图11-2 自发性转换突变的发生机制*腺嘌呤的亚氨型同分异构体与胞嘧啶配对（A-C），在下一次复制时，由于胞嘧啶与鸟嘌呤配对，在子代DNA分子中，原来A-T变成G-C。,2.环境因素,图11-2.DNA损伤造成嘧啶二聚体形成,电离辐射、紫外线和化学诱变剂等，都能造成DNA的损伤。DNA的损伤包括碱基的更替、丢失、骨架中磷酸酯键的断裂，两条链之间形成交联等。,二、DNA损伤及修复(一)直接修复 酶学光复活是一种直接修复过程。几乎所有的生物细胞中都含有一种光裂合酶（photolyases）。此酶在可见光（300-600nm）的作用下被激活后与DNA分子上的嘧啶二聚体结合，并在二个辅助因子（FADH2，次甲四氢叶酸）的协同下打开二聚体。使损伤的DNA恢复正常结构。光裂合酶从单细胞到鸟类广泛存在，但哺乳动物细胞缺乏此种酶,（二）错配修复（mismatch repair,MR）错配修复是在酶系统的作用下，将在复制中错配的碱基，小的插入或缺失进行修复。在真核生物，一种MSH蛋白能辨认损伤部位，并募集外切核酸酶去除损伤部分，DNA聚合酶进行修补，最后由DNA连接酶封闭和连接。,（三）碱基切除修复（base excision repair,BER）,图11-25 DNA碱基切除修复A：圆圈表示错误的碱基。B：一种DNA糖基化酶切除错误的碱基。C：AP内切核酸酶切除磷酸二酯链及糖基。D：DNA聚合酶填补单一核苷酸。E：DNA连接酶封闭,（四）核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER),切除修复可分以下几个步骤：1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位。2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸。3）以另一条完整的DNA 链为模板，在DNA聚合酶或其他的DNA聚合酶作用下，按53方向进行修复合成。4）DNA连接酶将所合成的DNA链与原来的链接上（图12-19）。人类切除修复DNA大约需要许多种XP蛋白因子参加。编码XP 蛋白质的某些基因缺欠，会导致着色性干皮病（xeroderma pigmentosum，XP）,图11-2 核苷酸切除修复 A:DNA一条链损伤,B、C:核酸内切酶识别损伤部位并在损伤部位的两端切除一段DNA,D:DNA聚合酶以另一条完好的DNA链为模板合成一段新的DNA,E:缺口处由DNA连接酶封闭。,A.DNA一条链损伤（如含有嘧啶二聚体）BDNA复制后，其中一个子代是正常的，而另一个子代的一条链出现空隙。C以正常子代中原来自母链的一段DNA序列通过重组，将缺损部分修复。D.最后，再以子代中完整的链为模板，修补缺失的互补序列。,（五）重组修复（recombinational repair）,图11-2DNA的重组修复,（六）跨损伤修复（translesion DNA synthesis）,图11-28 跨越损伤DNA的合成(TT)表示模板的损伤的部位。一些特殊的DNA聚合酶可以跨越损伤部位继续合成。,SummaryDNA replication is semi-conservative,semi-discontinuous,bi-direction and faithful.DNA polymerases need primer and sets of accessory proteins.DNA is replicated in the 5 to 3 direction by the assembly of dNTP on complementary DNA templates.In eukaryotes,DNA is synthesized major by DNA polymerase and.In E.coli DNA is synthesized major by DNA polymerase III.,DNA replication process includes three steps:initiation,elongation and termination.Replication is initiated by the synthesis of short RNA primers,by primease.The DNA is then extended from the 3 end of the primers through the action of DNA polymerase.The leading strand at replication fork is synthesized continuously,whereas the lagging strand is synthesized discontinuously by the formation of Okazaki fragments.,RNA primers on newly synthesized DNA are excised and replaced by DNA polymerase.The single-strand nicks are then sealed by DNA ligase.Telomeric DNA is synthesizes by the RNA-containing enzyme telomerase.Retroviruses produce DNA on RNA templates in a reaction sequence catalyzed by reverse transcriptase.,Mitochondrial DNA is replicated in the D-loop mode by DNA polymerase.The some phages with single-stranded circular DNA genomes,such as X 174,use a rolling circle replication.DNA can be damaged by various agents and by replication errors.DNA damages may be repaired by different methods.,问 题,单 选 题,1.下列有关DNA复制酶的叙述哪个是正确的？A.所有的聚合酶都具有5-3和3-5外切酶的活性 B.DNA聚合酶的聚合作用是在DNA引物上进行的 C.DNA聚合酶和都需要模板和引物 D.DNA聚合酶保留在模板上直到大量核苷酸合成为止。E.聚合酶反应的特异性是聚合酶内在的性质。,2.DNA 两条链均作为模板发生在:A.复制 B.切除修复 C.错配修复 D.转录偶联修复 E.上述所有情况,3.合成DNA的原料是：A.dAMP,dGMP,dCMP,dTMPB.AMP,GMP,CMP,TMPC.dATP,dGTP,dCTP,dTTPD.ATP,GTP,CTP,TTPE.dADP,dGDP,dCDP,dTDP,4.DNA合成的不连续性:A.当它达到每一个单链的末端时，所需的 DNA 聚合酶从模板上释放下来。B.因为合成是从起始点双向进行的C.导致合成冈岐片段D.意味着仅当第一条链合成之后才合成第二条链E.意味着3-5和5-3两种聚合酶都需要,5.在DNA复制时，下利所有因子对DNA链解旋和解链都是必需的，但除外 A.负超螺旋傾向解旋 B.通过解旋酶解开不稳定的碱基对 C.需要拓扑异构酶的作用 D.SSD蛋白酶的活性 E.需要以ATP的形式供应能量,6.真核DNA的复制 A.仅有一个复制体形成，因为只有单一复制起 始点 B.冈歧片段有1000-2000核苷酸的长度 C.只要起始泡形成，解旋酶就从DNA上脱离下 来 D.至少有一种DNA聚合酶有3-5 外切核酸酶 的活性 E.在细胞的全过程都发生,7有下述有关端粒酶的描述都是正确的，但除外 A.RNA复合物作模板合成DNA B.它将端粒加到DNA 链的5末端 C.在大多数真核生物，它提供了线性 染色体的机制 D.它识别G-丰富的单链DNA E.它是一种逆转录酶,8细胞中进行DNA复制的部位是:A.核蛋白体 B.细胞膜 C.细胞核 D.微粒体 E.细胞浆,9.DNA复制中的引物是：A.由DNA为模板合成的DNA片段 B.由RNA为模板合成的RNA片段 C.由DNA为模板合成的RNA片段 D.由RNA为模板合成的RNA片段 E.引物仍存在于复制完成的DNA链中,10DNA复制时，子链的合成是：A.一条链 53，另一条链35 B.两条链均为53 C.两条链均为连续合成 D.两条链均为35 E.两条链均为不连续合成,11冈崎片段是指：A.DNA模板上的DNA片段 B.引发酶催化合成的RNA片段 C.后随链上合成DNA片段 D.前导链合成的DNA片段 E.由DNA连接酶合成的DNA,12DNA复制时辩认复制起始点主要酶是：ADNA聚合酶 B.拓扑异构酶 C.解链酶 D.引发酶 E.DNA连接酶,13DNA复制中，下列哪一种酶是不需要的？A.DNA指导的DNA聚合酶 B.DNA连接酶 C.拓扑异构酶 D.解链酶 E.限制性内切酶,14下列关于大肠杆菌DNA聚合酶III的叙述哪一项是正确的？A.具有35核酸外切酶活性 B.不需求引物 C.需求4种不同的三磷酸核苷 D.dUTP是它的一种作用物 E.可以将二个DNA片段连起来,15下列关于逆转录的叙述哪一项是错误的？A.以RNA为模板合成DNA B.RNA-DNA杂交体是终产物 C.催化链的延长其方向为53 D.底物是四种dNTP E.遵守碱基配对规律,多选题,1.DNA 复制过程中具有催化3，5 磷酸二酯键生成的酶有引物酶 DNA 聚合酶 单链DNA 结合蛋白 解螺旋酶 连接酶,2.DNA 复制的特点是 A.半保留复制 B.需合成RNA 引物 C.形成复制叉 D.有半不连续性 E.引物提供3末端,3.大肠杆菌DNA 聚合酶1的催化活性与作用是A.修复DNA 分子的损伤B.切除RNA 引物C.填补切除引物后留下的空隙，合成短的DNA 片断D.在RNA 合成中起校正作用E.RNA 复制中起作用,4.反转录酶催化的反应描述正确的是A.RNA 指导的DNA合成反应B.RNA 的水解反应C.DNA 指导的DNA 合成反应D.有3到5外切酶的活性E.RNA复制反应,5.参与原核DNA 复制的DNA 聚合酶有A.DNA 聚合酶1B.DNA 聚合酶IIC.DNA 聚合酶IIID.DNA 聚合酶 E.DNA聚合酶,6.需要DNA 连接酶参与的过程有A.DNA 复制B.DNA 体外重组C.DNA 损伤修复D.DNA 反转录E.RNA 复制,单选题答案,1.答案C DNA聚合酶和是真核生物DNA复制中起作用的主要酶,它们都需要模板和引物。2.答案 A 只有在DNA复制时，DNA 的两条链均作为模板合成子代DNA。这种复制称DNA的半保留复制。,3.答案C DNA的合成需要四种脱氧核苷三磷酸为原料，在DNA聚合酶的催化下形成多核苷酸链。合成反应是耗能的,故需要脱氧核苷三磷酸。,4.答案C DNA合成的不连续性导致合成冈岐片段的生成。DNA新链的合成始终是按53方向进行的。随着双链的打开，由起始点形成复制叉后，新合成的两条方向相反的链中，一条链的合成方向与复制叉前进方向是一致的，合成就能顺利地连续进行；另一条链的合成方向则与复制叉前进方向相反，DNA的合成是不连续的,导致合成冈崎片段。,5.答案D DNA复制时，SSD对单链DNA有结合作用故称为单链DNA结合蛋白，对DNA解旋和解链不是必需的。6.答案 D 真核DNA的复制时，至少有一种DNA聚合酶有3-5 外切核酸酶的活性。如DNA聚合酶具有这种活性。在DNA复制过程中DNA聚合酶的3-5 外切核酸酶的活性能及时去除错误核苷酸的掺入，这对于保证DNA复制的保真性是必须的。,7答案 B 端粒酶将端粒加到DNA 链的3末端。因为DNA 的3末端存在着富含鸟嘌呤核苷酸的重复顺序,端粒酶中的RNA与其互补合成端粒。8答案 C DNA存在于细胞核内,DNA复制的有关酶类也存在细胞核内,故DNA的复制是在细胞核内进行的。,9.答案 C 引发酶以DNA为模板，以NTP为原料，合成一小段RNA，此RNA片段为DNA的合成提供3-OH末端，DNA聚合酶在RNA3-OH末端的基础上，合成DNA。10答案 B DNA聚合酶催化DNA复制，其合成的方向只能是53，故两条链合成的方向均为53。为此，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是不连续的。,11答案 C 由于DNA两条链合成的方向均为53。为此，一条链的合成是连续的，称前导链。另一条链的合成是不连续的，称后随链。冈崎片段是指后随链上合成的DNA片段。12答案 D 引发酶在复制起始点以DNA为模板，首先合成一小段RNA引物，其后DNA聚合酶才起作用。,13答案 E 在DNA复制中不需要限制性内切酶。在基因工程及基因诊断等该酶是重要的工具酶。14答案 A 大肠杆菌DNA聚合酶III除了具有聚合酶的活性外，还具有35核酸外切酶的活性。此活性对复制的保真性具有重要的作用，能及时切除错配的碱基。,15答案 B 逆转录过程是以RNA为模板，终产物是双链DNA而不是RNA-DNA的杂交体。,多选题答案,1.答案 A、B、E 引物酶及DNA 聚合酶均能催化核苷酸之间形成3，5 磷酸二酯键。DNA连接酶能催化两个DNA 片断之间通过3，5 磷酸二酯键相连。2.答案 A、B、C、D DNA 复制的特点是半保留复制，需合成RNA 引物，形成复制叉，半不连续复制。,3.答案 A、B、C 大肠杆菌DNA聚合酶 I 具有3 到5 和5到3外切核酸酶的活性并具有聚合酶的作用。主要功能是去除RNA引物和对DNA损伤的修复。4.答案 A、B、C 反转录酶是RNA 指导的DNA 聚合酶，同时兼有RNase H 的活性，能专一水解RNA，也能催化DNA的合成