生物碱的提取和分离方法研究进展毕业论文.doc

生物碱的提取和分离方法研究进展 摘要：生物碱是一类具有显著生理活性的含氮有机化合物，是许多中药的有效成分，提取与纯化是生物碱制备的关键环节。本文论述了生物碱的性质、生物碱的功效，简单介绍了生物碱的传统提取方法，着重阐述了生物碱的现代提取技术，如超临界流体萃取技术、微波辅助提取技术、双水相萃取技术等，从分子印迹技术、膜分离技术、有机溶剂萃取、色谱和树脂吸附等方面探讨了生物碱的纯化。关键词：生物碱；提取；分离1 引言生物碱是指中药中一类含氮杂环的有机物，具有碱性和广泛的生理功能，是许多药用植物的有效成分，目前运用于临床的生物碱药品已达80种之多，相当多的生物碱具有抗肿瘤活性、低毒性和成本低之特性，因而引起了人们的广泛关注。与此同时，人们对生物碱的提取和分离方法研究也在不断地深入和加强。随着各类生物碱的市场需求量的增加，经济效益的提高，提取分离生物碱的方法也在不断改进和提高。2 生物碱2.1生物碱的性质生物碱是为一类含氮的有机化合物，存在于自然界（一般指植物，但有的也存在于动物）。有似碱的性质，所以过去又称为赝碱。大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。具有光学活性，但少数生物碱例外。生物碱大多具有明显的生物活性，且往往是许多药用植物的有效成分。2.2生物碱的功效植物体内生物碱含量虽少，但与人类关系密切。许多生物碱是治病良药，如毛莨科黄连根茎中的小蘖碱是黄连素的主要成分，有抗菌消炎作用；萝芙木中的利血平能降血压；石蒜中的加兰他敏对小儿麻痹症有疗效1；罂粟果皮中所含的吗啡碱是著名镇痛剂；奎奎宁碱是有价值的解热药；三尖杉碱和长春花碱是治癌良药2；秋水仙素（碱）能人工诱变产生多倍体。有的生物碱可用来制作农业用的杀虫剂。人们在脊椎动物和无脊椎动物体内也分离到了生物碱，其中某些动物的生物碱与它们报摄取食用的植物有关，蟾蜍、蝾螈和某些鱼类中发现的生物碱是真正的动物代谢产物。3 生物碱的传统提取技术绝大多数生物碱是利用溶剂提取法进行提取。生物碱的溶解性能是提取与纯化的重要依据3生物碱及其盐类的溶解度与生物碱分子中氮原子的存在形式、极性基团的有无及数目、溶剂种类都有密切关系。极性强的生物碱亲水性较强，易溶于极性溶剂；弱极性生物碱亲脂性较强，易溶于弱极性溶剂。游离的生物碱大多亲脂性较强，而生物碱盐一般亲水性较强。按极性强弱可将生物碱提取溶剂分为极性溶剂、半极性溶剂和非极性溶剂。生物碱的提取方法直接影响生物碱的品质。生物碱的传统提取方法有，如煎煮、浸渍、渗漉等方法。3.1 煎煮法煎煮法是中药最早、最常用的制剂方法之一，将中药粗粉加水加热煮沸，将中药成份提取出来的方法。此法简便易行，适用于有效成分能溶于水，且对加热不敏感的药材，能够提取出相对较多的有效成分但含挥发性及有效成分遇热易破坏的中药不宜用此法。朱舟等4选用水煎煮提取，运用均匀设计表安排实验，选择提取的最佳条件。表明煎煮次数多，总生物碱的提取得率高，由此确定最高值为4次，煎煮时间影响最小，最终确定优化条件为：12倍量水/次，2 h/次，煮提4次。3.2 浸渍法浸渍法是将处理过的药材，用适当的溶剂在常温或温热（6080）的情况下浸渍以溶出其中成分。该法一般是在常温下进行，对热敏性的物质的提取很有利，操作简单，但所需时间长，溶剂用量大，有效成分浸出率低。尤其是水作溶剂时易发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。常温浸渍是较为常用的生物碱提取方法，如秦学功等5考察了苦豆子种子中生物碱的冷浸工艺条件，室温下用稀盐酸提取苦豆籽中的苦参总生物碱，研究不同条件下的总碱浸出率，最高可达3.7以上。陈月圆等6以小檗碱为指标，对黄柏中的总生物碱提取方法进行了优化，分别用水、乙醇和酸作为溶剂，使用乙醇为溶剂的提取率为84.4，远高于其他两种溶剂。3.3 渗漉法渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉且溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。浸出液可以达到较高浓度，适用于热敏性、有效成分含量低或贵重药材的提取。此法常温操作不需加热，溶剂用量少，过滤要求较低，使分离操作过程简化，但是费时较长，操作技术要求较高，否则会影响提取效率，当提取物为黏性、不易流动的成分时，不宜使用该法。采用0.5%的硫酸溶液对中药材黄连用渗漉法提取，收集7倍量渗漉液即可保证生物碱的提取率，与回流法比较，渗漉法提取物含杂质少、提取率高、使用溶剂量少7。3.4 热回流法回流法是以乙醇等极性较大且沸点较低的有机溶剂为溶媒，在水浴中加热回流，该法最大的特点在于通过溶剂的蒸发与回流，使得每次与原料接触的溶剂都是纯溶剂，从而大大提高了萃取动力，达到提高萃取速度和效果的目的。但提取效率不高，受热易破坏的成分不宜使用此方法。3.5索氏提取法此法将热回流法中的挥发性溶剂馏出后再次冷凝，重新回到浸出器中继续参与浸取过程，多采用索氏提取器完成。该法利用索氏提取器多次提取生物碱，可以反复利用溶剂，提取效率高，且操作方便。连续提取法提取液受热时间长，因此对受热易分解的成分也不适用。4 生物碱的提取新技术随着物理科学的发展，针对传统提取过程中存在的能耗大、有效成分损耗大、杂质较多、效率较低等问题，一些新技术应用于生物碱提取工艺中，在传统方法的基础上利用新技术的强化作用或流体在超临界状态下进行萃取大大提高了提取效率，降低了过程能耗，因其显著优势而成为研究热点。4.1 超临界流体萃取技术超临界流体萃取技术是20世纪70年代末才兴起的一种新型生物分离精制技术，90年代后期开始应用于药用植物中有效成分的提取。其原理是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而实现对极性大小、沸点高低和分子量大小不同的组分间的选择性分离。SCF特有的理化性质8，9使其具有比液体溶解能力大、比气体易于扩散和运动且传质速率远高于液相过程的特点，目前普遍采用的SCF为CO2。超临界流体萃取具有以下优势：(1)萃取率高；(2)选择性高，分离彻底；(3)工艺简单，操作费用低；(4)操作温度低，适于热敏性物质提取；(5)CO2无毒、不易燃，安全性高且价格低廉。目前利用超临界流体萃取技术提取天然成分已成为研究热点。张立伟等10利用超临界 CO2 流体萃取苦参中的总生物碱，提取率为常规方法的2.4倍，耗时为常规方法的1/3。4.2 微波辅助提取技术微波辅助提取技术是利用微波与介质的离子和偶极子分子的相互作用，促使介质转动能力跃迁，加剧热运动，使细胞壁破裂，胞外溶剂易于进入细胞内，溶解并释放胞内产物，具有强力、瞬时、高效等特点，是目前颇具发展潜力的一种新型提取技术。自1986年Ganzler等首次报道了微波用于天然产物中化学成分的提取以来，该技术已在食品、环境、制药和天然产物等领域得到了广泛的应用。微波辅助提取技术应用于荷叶等中生物碱的提取，与传统提取方法相比，总生物碱提取率获得明显提高。4.3 超声辅助提取技术超声辅助提取技术主要是靠超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体瞬间破裂，同时超声波产生振动作用加强了细胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的有效成分渗透进入溶剂而使提取效率获得提高。代宏哲11以苦豆子生物碱的浸取过程为研究对象，研究了超声场介入对固液扩散的影响，并与常规浸提法的动力学方程进行了比较，发现超声条件下的平衡常数是常规条件下的27.4倍，其传质系数也高出将近2个数量级。郭孝武12等研究了超声和热回流浸泡法提取益母草中生物碱的过程，发现超声提取可损伤益母草茎内组织细胞，提取40min比回流法提取2h的产率还高出42.86%。超声辅助提取大大缩短了提取周期，有效成分的收率明显提高，同时全过程无需加温，减少了杂质的进入和能源的消耗。4.4 双水相萃取技术双水相萃取技术是由2种聚合物或聚合物与无机盐在水中在适当的浓度等条件下形成互不相溶的两相体系，利用待分离物在两水相中分配系数的不同而实现提取分离的方法。目前最常用的双水相体系有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖体系、PEG/无机盐体系、表面活性剂/表面活性剂体系、普通有机溶剂/无机盐体系、双水相胶束体系、温敏性双水相体系、热分离双水相体系、离子液体/无机盐体系等。双水相萃取技术具有分离条件温和、能耗较小、传质和平衡速度快、回收效率高、且设备简单、易于放大和实现连续化操作等特点。所以，尽管目前该技术在生物碱的提取方面报道不多，但应用前景十分良好。5 生物碱纯化技术根据生物碱溶解性、极性、成本等因素，生物碱的分离方法可以灵活运用。可采用经典的分离方法，如有机溶剂萃取法、沉淀法、盐析法、结晶法等，也有较为现代、先进的分离方法，如树脂吸附法、色谱分离等方法。5.1 有机溶剂萃取有机溶剂萃取用提取物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同达到分离的方法，萃取时组分在两相溶剂中的分配系数越大分离效率越高，分离效果越好。对于亲脂性生物碱，利用非极性和低极性有机溶剂如苯、乙醚、氯仿等与水进行液液萃取；对于水溶性生物碱，利用极性较大的有机溶剂如乙酸乙酯、丁醇等与水溶液萃取。有时可用多种溶剂配置成两相互不相溶的溶剂进行萃取13。有机溶剂萃取是生物碱纯化的经典技术，应用广泛，具有操作简单、容易放大的优点，但分离效率和纯度较低，使用大量有机溶剂，操作安全性不佳。5.2 色谱色谱法也称层析法，是一种物理分离方法，可以用于分离纯化和鉴定中药有效成分。色谱法包括纸色谱、薄层色谱和柱色谱，其中常用吸附柱色谱纯化生物碱成分，一般使用吸附剂为硅胶和氧化铝。5.2.1 硅胶柱色谱主要是利用二氧化硅作为填料，是较为常用的柱色谱分离方法。硅胶是中性无色颗粒，其性能稳定，分离效率与其粒度、孔径及表面积等因素有关14。硅胶层析柱适用范围广，既能用于非极性生物碱也能用于极性生物碱，且成本低，操作方便，是常见的生物碱的分离方法。5.2.2 氧化铝柱色谱以Al2O3作为填料的层析分离法，适合于酸性大、活化温度较高的生物碱的分离。需要注意的是Al2O3的粒度对分离效率有显著影响，一般粒度范围100160目，低于100目则分离效果差，高于160目则溶液流速太慢。5.3 树脂吸附树脂吸附包括离子交换树脂和大孔树脂。树脂吸附摆脱了传统纯化法得到的制剂大、黑、粗，使用不方便且溶剂用量大的缺点，因其具有的诸多优势而成为应用日益广泛的纯化技术。5.3.1 离子交换树脂离子交换树脂对吸附质的作用是通过静电引力和范德华力达到分离和纯化的目的。在生物碱的纯化中使用的是阳离子交换树脂。生物碱盐阳离子交换到树脂上从而与非碱性的化合物分离，再用碱水洗脱得到生物碱。由于离子交换树脂提取分离技术设备简单、操作方便、生产连续化程度高，而且得到的产品往往纯度高、成本低，因而离子交换树脂在天然产物提取分离研究与生产中的应用日益广泛。5.3.2 大孔树脂大孔树脂是在离子交换树脂基础上利用树脂的吸附性和分子筛结合的原理，选择性吸附中药提取液中有效成分，去除杂质。树脂经过洗脱、浸泡、冲洗等过程处理后再生可重复使用。由于其溶剂用量少、产品质量高、稳定性好、生产周期短、设备简单近年来倍受关注15。5.4 分子印迹分子印迹技术是20世纪末出现的一种高选择性分离技术，通过印迹、聚合、去除印迹分子3步制备分子印迹聚合物(MIPs)，以其特定的分离机理而具有极高的选择性，可以作为高度专一的固相萃取材料16。黄晓冬等17制备了辛可宁分子印迹聚合物手性整体柱，可在2min内实现非对映异构体辛可宁和辛可尼丁分离。目前MIT分离生物碱的技术尚属研究阶段，需要在热力学及动力学性质、MIPs制备、降低成本等方面作进一步探索。5.5 高速逆流色谱分离法高速逆流色谱技术是一种较新型的液-液分配技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离。已在分离纯化生物碱、黄酮、萜类、木脂素、香豆素等成分的研究中获得成功18。袁黎明等19利用高速逆流色谱对传统中药黄柏中的生物碱类活性成分进行了制备分离： 两相溶剂分离系统采用氯仿甲醇0.5mol/L HCl(体积比为211)，通过一次分离得到6种单一的生物碱/一种含有两个成分的生物碱。高速逆流色谱有两大突出优点：一是由于其固定相是液体，无需固体支持作载体，因此完全消除了气、液色谱中常见的吸附现象，特别适用于分离极性大的组分以及一些生物大分子；二是由于它独特的分离原理，使其在制备分离上显示出很大的优势。最近的研究表明，利用高速逆流色谱仪可以一次进样几十毫升，的样品e除此之外，它不需升温加热也不需要精密的恒流泵。高速逆流色谱分离法具有两大突出优点:(1)线圈中固定相不需要载体，因而清除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象；(2)特别运用于制备性的分离，每次进样体积较大，进样量也较多。5.6 分子蒸馏技术 分子蒸馏技术是我国于20世纪80年代末从国外引进的一种新型液-液分离精制技术。与许多常规蒸馏技术相比，分子蒸馏可在远离沸点下操作、蒸馏压强低、受热时间短、浓缩效率高、无沸腾和鼓泡现象、能节省大量溶剂减少环境污染等特点，现已广泛应用于天然产物中高沸点、热敏性、易氧化物质的分离。分子蒸馏的核心是分子蒸发器，其种类主要有3种：即降膜式、刮膜式及离心式。应安国20等应用刮膜式分子蒸馏设备对帕罗西汀碱原料进行分离提纯试验，通过对该生产过程技术经济的初步分析，以年产1000kg帕罗西汀计算，可产生直接经济效益约7000万元，具有巨大的利润空间。但目前该技术在我国尚处于起步阶段，随着分子蒸馏设备的国产化，必将加快其推广和应用。5.7 膜分离技术 膜分离技术是20世纪60年代后迅速崛起的一项新兴的高效分离技术，它采用半透膜作为选择障碍层，以膜两侧的能量差为推动力，根据各组分透过膜的迁移率不同，而允许某些组分透过而保留混合物中其他组分，从而实现混合物中各组分的分离。该技术具有操作条件温和、不存在相转移、分离效率高、不必添加化学试剂、不损坏热敏性物质、可极大的减少纯化工序实现连续和自动化操作、使用范围广等优点，有着传统法无可比拟的优势21。近年来，膜分离技术在生物碱的分分离与纯化过程中的应用研究十分活跃。梁锋22等采用W/O 型乳状液膜分离技术成功分离出荷叶粗提物3种生物碱：荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱，萃取率分别达到了95.6%、100%和97.9%，充分显示出了该技术良好的应用前景。6 结语生物碱作为中草药中具有生理和药理活性的重要组分，极有可能成为我国将来具有自主知识产权的新药，其提取与分离纯化技术的研究将日趋活跃。目前较为常用的提取与纯化技术比较成熟，但存在溶剂、能源消耗大且效率不高等问题，合理使用一些新技术可以有效改善提取与纯化效果，使生物碱制备向高效节能的方向发展。实际生产时应根据生物碱特有的理化性质，选择合适的提取与纯化技术，为了能够扬长避短，还可以多种技术联合使用，探寻最佳的工艺条件与作用机理。不断探索和完善的提取与纯化技术，将会使生物碱制备向具有绿色、现代化的方向发展。参考文献1 吴志平,陈雨,冯煦.石蒜科药用植物生物碱的药理学研究 J.中国野生植物资源, 2008, 27(5): 26- 31.2 刘丽敏,刘华钢,毛俐.苦参碱和氧化苦参碱体外对肿瘤细胞增殖的影响J.中国实验方剂学杂志, 2008, 14( 11): 35-36.3 肖崇厚,杨松松,洪筱坤.中药化学M.上海：上海技术出版社,1997:84-85.4 朱舟,赵倩,朱祯禄.复方三生口服液中总生物碱提取工艺的实验研究J.儿科药学杂志，2005,11(6):14-15.5 秦学功,元英进.苦豆子种子中生物碱的冷浸提取实验研究J.中草药2001,32(7):604-606.6 陈月圆,李典鹏,高江林.黄柏中总生物碱的提取及测定方法研究J.广西植物，2003，23(6):565-567.7 杨翓,钱捷,郝青春. 清热通淋栓中黄连提取工艺的考察J. 北京中医药大学学报2004,27(6): 56-57.8 李卫民,金波,冯毅凡.中药现代化与超临界流体萃取技术M.北京:中国医药科技出版社,2002:95-96.9 朱自强.超临界流体技术原理和应用M.北京:化学工业出版社2000,18-20.10 张立伟,毛建明,杨频. 超临界二氧化碳流体萃取中药苦参的生物总碱J.化学研究与应用，2003,15（1）:129-130.11 代宏哲.苦豆子中生物碱提取纯化及动力学研究D.西安:西北大学,2007.12 郭孝武.超声对益母草茎内组织损伤与总碱产率关系研究J.陕西师范大学学报，2004，32(4):56-58.13 卢艳花.中药有效成分提取分离技术M. 北京:化学工业出版社，2005：32-33.14 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This paper discusses the properties of alkaloids, alkaloid, briefly introduces the traditional method of extracting alkaloids, emphatically elaborated the modern extraction technology of alkaloids, such as supercritical fluid extraction, microwave assisted extraction, aqueous two-phase extraction technology, from the molecular imprinting technology, membrane separation technology, organic solvent extraction, chromatography and adsorption resin such aspects of the purification of alkaloid.Keywords：alkaloids;extraction;separation