通过对LB培养基的配制课件.ppt
2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,1,分子生物学实验,三峡大学化学与生命科学学院 湖北省生物学实验教学示范中心 2014年3月,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,2,实验内容,实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌实验二 质粒DNA的提取实验三 琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验五 DNA重组（连接反应）实验六 植物DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测实验七 PCR基因扩增,2,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,3,1.实验准备：器皿清洗、试剂配制、灭菌分装、取用保存2.离心机的使用打开离心机电源开关，进入待机状态。选择合适的转头离心管平衡误差应在0.1克以内。选择离心参数：,主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用机及实验操作注意事项,实验一 实验准备及培养基制备与灭菌,【实验准备内容】,【实验目的】,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,4,将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）应等离心速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机有异常（如不平衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应立即按STOP键，必要时直接按电源开关切断电源，停止继续离心，并找出原因。机器如发现故障，请及时与有关人员联系。使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利于湿气蒸发。使用结束后必须登记，注明使用情况。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,5,离心机的摆放位置,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,6,3.移液器的使用,移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移液器能否正确是用，直接关系到实验的准确性与重复性，同时关系到移液器的使用寿命。移液器由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量有20ul,200ul,1ml等规格。微量移液器的操作步骤：将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头）将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,7,垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少；等一秒钟后将吸嘴提离液面平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体；提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦过；然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,8,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,9,量液操作注意事项,a.连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程；b.在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置移液器于架上；c.吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部；d.在吸取不同的液体时，要更换吸头；e.移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,10,4.手提式高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项,首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，务使漏气。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,11,用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.11MPa,121.5,20min灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才能关上排气阀，维持所需压力。灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,12,将取出的灭菌培养基放入37温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。5.实验室安全与卫生6.分组：5人一大组，23人一小组，一个实验桌1套移液枪7.准备：每组蓝枪头和黄枪头各1盒，全班另加2包，EP管1盒或1包，30ml离心管12个，培养皿10个，全班1000ml的LB固体和液体培养基8.实验报告与成绩评定平时成绩50：考勤，实验操作，实验结果，预习报告考核成绩50：实验报告,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,13,【思考题】,1.高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2.移液操作应注意哪些事项？,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,14,【LB培养基的制备及灭菌】,【实验目的】通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。【实验原理】,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,15,LB培养基,是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,16,LB培养基,由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖 LB固体培养基的配方如下：胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 琼脂 1520g 水 1000mL pH 7.0,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,17,【试剂】,酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂；mol/L NaOH，1mol/L HCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.59.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,18,【培养基配制】,LB液体培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g摇动容器直至完全溶解，加入200l 5mol/L NaOH调节pH至7.0，定容1L。LB固体培养基：每升培养基加入15克琼脂，0.11MPa,121.5,20min灭菌。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,19,【操作步骤】,1称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,20,【操作步骤】,3调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,21,【操作步骤】,4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,22,【操作步骤】,5加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,23,【操作步骤】,7灭菌 将上述培养基以1.1kg/cm2，121，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。8搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。9无菌检查 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,24,【思考题】,1.培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,25,实验二 质粒DNA的提取,【实验目的与意义】质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法。碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,26,【实验原理】,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,27,细菌裂解的方法,碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于 质粒大量提取。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,28,DNA抽提原理,DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,29,DNA抽提原理,SDS是一种阴离子表面活性剂，既可使细菌细胞裂解，又可使一些蛋白质变性，因此用SDS处理细菌，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA在强碱性（NaOH）条件下发生变性。再用酸性乙酸钾来中和，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA因分子较大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,30,【仪器、材料与试剂】,（一）仪器1.恒温培养箱2.台式离心机3.恒温摇床4.高压灭菌锅（二）材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷（Tris)3.乙二胺四乙酸（EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠（SDS)6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,31,【仪器、材料与试剂】,9.乙酸10.胰RNA酶11.氨卞青霉素12.蔗糖13.溴酚蓝14.酚15.8羟基喹啉16.巯基乙醇17.盐酸18.含pUC19质粒的大肠杆菌19.EcoR酶20.吸头、小指管,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,32,【仪器、材料与试剂】,（三）试剂1.溶液50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mM Tris-HCl pH8.0。2.溶液 0.4mol/L NaOH,2%SDS，用前等体积混合3.溶液60mL的5mol/L KAc11.5ml冰乙酸28.5mL H2O4.TE缓冲液或水（+20g/ml RNase）:10mmol/L，Tris-HCl pH8.01mmol/L，EDTA pH8.0,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,33,【仪器、材料与试剂】,5.70乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）6.胰RNA酶将RNA酶溶于10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min,缓慢冷却至室温，保存于20。7.凝胶加样缓冲液（6）40蔗糖、0.25溴酚蓝,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,34,质粒(plasmid),Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,35,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,36,质粒的结构,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,37,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,38,【操作步骤】,一、菌种的活化1.用接种环挑取 1 环冷冻保存的含质粒 DNA 大肠杆菌工程菌（本实验是 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5），划线接种于含有 Amp 的 LB 固体培养基平板上，37 倒置培养约 12h(过夜)。2.用接种针或消毒牙签从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于2ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。3.取0.5ml菌液转接于50ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养23h（OD600nm 0.5，细胞数 108）。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,39,二、提取步骤1.将2ml含相应抗生素（Amp:50g/ml)de LB培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37培养过夜。2.取2.0ml培养液在4、4000rpm离心2min，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥，3.加100l的溶液I，使菌体充分悬浮，室温静置10min。4.加200l新配置的溶液II，温和上下颠倒2-3次，冰浴静置5min。5.加150l的溶液III，上下颠倒混匀数次，冰浴静置15min。6.4，12000 rpm离心15min。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,40,7.取上清转至另一离心管中，加等体积（400l）的酚：氯仿（1：1），充分混匀，室温，12000rpm离心5min。吸上清液至另一离心管中。8.向上清液中加入2倍体积（约1ml）预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置510min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。9.加1 ml 预冷的70%乙醇，4，12000rpm离心5min，洗涤沉淀。10.弃上清，沉淀自然干燥后，加20l TE缓冲液溶解沉淀。11.加2l 10 mg/ml的RNaseA酶，-20保存。,40,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,41,Karroten Plasmid DNA Extraction kit 质粒DNA提取试剂盒组成,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,42,Karroten Plasmid DNA Extraction kit 质粒DNA提取试剂盒,1.将带有目的质粒的E.coli 接种于裝有5 ml LB/适当抗生素的10-20 ml 的培养管中，37搖床培养20-24h，以扩增质粒。用一个10-20 ml 培养管或培养瓶，其体积至少有培养液的3-4 倍。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,43,2.取一KarrotenTM Mini Column 柱裝在一个2 ml 收集试管上(已备)。加入500 l Buffer KB平衡液至柱子內，室温下10,000 rpm 离心1 min，使平衡液完全流过柱子。弃去收集管中的平衡液.（保留空的收集管，继续往下使用）。特别注意：柱子不平衡，将导致质粒产率和纯度的减少。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,44,3.取1.55.0 ml 的菌液，于室温下12,000 rpm 离心3min 以沉淀菌体。,4.倒出或吸出培养基。往沉淀中加入250 l Buffer K1，振荡使细胞完全悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高产量是十分重要的。5.往重悬混和液中加入250 l Buffer K2，轻轻颠倒混匀5-10 次。室温静置2-5 分钟。避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA 断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5 min。（当使用完Buffer K2以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空气中的CO2 反应。）,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,45,6.往上述混和液中加入350 l Buffer K3(可以预冷至4，也可以在常温)，并温和地上下颠倒离心管10-20 混匀，直至形成白色絮狀沉淀。,7.在4，12000 rpm 离心10 min,或者在常温12000 rpm 离心3-4 min.(提高离心速度和时间有利于沉淀贴壁更加紧密，但是常温长时间的离心会造成质粒DNA 降解)8.小心将细胞离心的上清液转至已平衡的柱子內，室温下10,000 rpm 离心1 min，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液.9.把柱子重新装入2ml 收集管中，加入700 l Buffer KW(用70%乙醇溶解)至柱子，室温10,000 rpm 离心1min，弃去洗涤液。注意：冻干的Buffer KW在使用之前必须按标签的提示用70%乙醇溶解。如果 Buffer KW 在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,46,10.（可选）重复用700 l 70%乙醇（室温）洗涤柱子。室温下10,000 rpm离心1min。注意：这一步对需要提取细胞转染用途的质粒来说是必要的。其它的分子生物学实验不需要。,11.弃收集管中的滤液，将空柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 rpm离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。（注意：省去这一步将导致残留乙醇于质粒中）。12.把柱子装在一个干凈的1.5 ml离心管上，加入30-50 l（具体取决于预期的终产物浓度，如果需要高浓度，可以用15 l）的Buffer KE(可用灭过菌的超纯水或TE缓冲液代替)到柱基质膜的中央，室温放置0.5-1min,13,000 rpm离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出80%左右的结合DNA。如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来(不推荐),2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,47,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,48,【思考题】,1.在质粒DNA提取过程中，Buffer K1Buffer K2 Buffer K3各起什么作用？2.碱裂解法提取质粒DNA的原理是什么？3.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？4.在Buffer KE中为什么要加入EDTA？,【实验安排】一个上午,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,49,溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0);葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去。其实作用不大，葡萄糖可用水来代替。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,50,实验三琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA,【实验目的】通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【实验原理】DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片断泳动速度不一样，可进行分离。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,51,【实验原理】,DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA,简称CCCDNA),开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（open circular DNA,简称OCDNA),线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA,简称LDNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,52,影响琼脂糖电泳迁移的主要因素,DNA的大小DNA的构象琼脂糖浓度 缓冲液,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,53,【仪器、材料与试剂】,（一）仪器1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3.台式离心机4.高压灭菌锅 5.凝胶成像系统（二）材料1.三羟甲基氨基甲烷（Tris)2.乙二胺四乙酸（EDTA)3.溴化乙锭 4.硼酸5.溴酚兰 6.蔗糖7.琼脂糖 8.DNA marker 9.pUC19质粒,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,54,【仪器、材料与试剂】,（三）试剂1.5TBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000ml 5TBE:Tris 54g硼酸 27.5g0.5 mol/L EDTA 20mlpH8.02.凝胶加样缓冲液（6）溴酚蓝 0.25蔗糖 403.琼脂糖4.EB 0.5g/ml 5.EcoR酶,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,55,【实验步骤】,1.取5l质粒DNA溶液，加1l酶切缓冲液，EcoR酶1l（2U),无菌水补至总体积10l，37保温3小时，加凝胶上样缓冲液（6）2l，准备电泳。酶切溶液：EcoR酶切位点 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-3,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,56,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,57,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,58,2.制备琼脂糖凝胶 称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1琼脂糖凝胶。3.胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。将冷却到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）,【实验步骤】,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,59,【实验步骤】,待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。加入电泳缓冲也至电泳槽中。4.加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录电样顺序及点样量）。5.电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片断从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝燃料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。6.染色 将电泳后的凝胶浸入EB溶液中，染色15min,以观察在琼脂糖凝胶中的质粒DNA带（戴手套操作）。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,60,【凝胶电泳操作注意事项】,1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,61,【凝胶电泳操作注意事项】,5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,62,【实验结果】,在凝胶成像系统中紫外灯观察拍照（戴手套操作）。DNA存在处显出桔红色荧光条带。,1 2 3 4,结果照片图,1.DNA相对分子质量标准物（marker)2.pUC19质粒DNA经EcoR完全酶解3.pUC19质粒DNA经EcoR部分酶解4.自提的pUC19质粒DNA（此结果提得较好，为1条带，以超螺旋质粒DNA为主。有时结果是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时结果为2条带）,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,63,【思考题】,1.如何提高琼脂糖凝胶电泳的分辨率？2.EB染色的特点和注意事项是什么？3.酶切缓冲液的功能是什么？4.凝胶加样缓冲液的两种成分的作用是什么？5.如果电泳图谱出现连续模糊的带纹，原因是什么？,【实验安排】,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,64,实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化,【实验目的】学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和将外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术及转化体筛选的技术方法。【实验原理】感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,65,【实验原理】,转化（transformation）：是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,66,【实验原理】,转化的方法：1.化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,67,【实验原理】,克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,68,【影响转化率的因素】,细胞生长状态和密度。转化的质粒 DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,69,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,70,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,71,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,72,【仪器、材料和试剂】,（一）仪器1.无菌超净台 2.离心机3.电热恒温水浴锅 4.分光光度计5.恒温摇床 6.恒温箱 7.超低温冰箱（二）材料和试剂1.菌株：E.coli DH52.质粒：PUC19质粒3.LB培养基4.含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度 50-100gml5.预冷CaCl2溶液（0.1molL）,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,73,【实验步骤】,（一）菌种活化 1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时。2.挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37培养35小时3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,74,【实验步骤】,（二）感受态大肠杆菌的制备1.从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于2ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。2.取1.5ml菌液转接于30ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养23h（OD600nm 0.4-0.5，细胞数 108,此为实验成功关键）。3.将菌液转到30ml离心管中，冰上冷却 10min；,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,75,【实验步骤】,4.于4，4000rmin离心10min；5.倒净上清培养液，将管倒置10min以便培养液流尽；6.用6ml冰冷的0.1mo1LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min；7.04，4000rmin离心10min，回收细胞；8.弃上清，加1.2ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶 液，小心悬浮细胞，分装，200l一份，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液。9.制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,76,（三）细胞转化,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,77,【实验步骤】,（三）细胞转化1.取200l感受态细胞悬液加入pUC19质粒DNA 10 l(10-100ng),轻轻摇匀，冰上放置20-30min。同时设置两管对照：受体菌对照：200l感受态细胞10lTE buffer质粒对照：200l0.1mo1L GaCl2溶液10l质粒DNA溶液阳性对照：200l感受态细胞10l纯质粒2.42水浴中保温12min，然后迅速冰上冷却2min。3.立即向上述管中加入0.8ml LB液体培养基，（即得转化反应原液），摇匀后于37振荡培养约60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,78,【实验步骤】,（四）平板培养1.取各样品培养液0.1ml，涂在含100 g/ml Amp的LB平板培养基上。2.菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于 37恒温培养箱内培养12-16小时，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,79,【实验结果】,在含氨卞青霉素的琼脂平板上生长的菌落即为含有pUC19质粒的大肠杆菌,含有pUC19质粒的大肠杆菌,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,80,【实验结果】,表3.1 培养皿内各实验组菌落的生长状况及结果分析,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,81,【计算转化率】,统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,82,【思考题】,1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量2.为什么要设置阴性对照？3.如阴性对照中长出菌，原因？4.在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是 Amps的，原因？5.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？,【实验安排】从制备感受态细胞到转化一天可完成,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,83,实验五 重组DNA（连接反应）,【试验目的】通过本实验学会重组DNA连接及鉴定重组子的方法【实验原理】外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经过酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。连接酶有两种：E.coli 和T4 DNA连接酶。两种连接酶都有将具黏性末端的DNA片段之间的连接在一起的功能。T4 DNA连接酶还能使两个具平末端的双链DNA连接在一起。,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,84,【实验原理】,为防止载体本身的自连，可通过牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理克服：牛肠道分离，切除DNA、RNA和dNTP上的5磷酸基团,从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接。DNA重组的方法主要有：具互补黏性末端片段之间的连接和具平末端DNA片段之间的连接重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。,84,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,85,【实验原理】,利用互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法:载体：含有-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个aa的编码序列（肽链）宿主：缺失了lacZ基因，可编码-半乳糖苷酶C端序列-互补：宿主lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与质粒载体带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。在这样的系统中，转化质粒的细菌获得了amp抗性，自连质粒可以合成正常的酶，而重组质粒的细菌不能合成正常的酶。在培养基中添加酶的诱导物IPTG，乳糖的类似物X-gal乳糖酶作用下显示蓝色，蓝斑是载体自连产物，而白色克隆是重组质粒。,85,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,86,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,87,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,88,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,89,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,90,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,91,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,92,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,93,质粒 pUC19,93,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,94,质粒 pUC19示意简图,94,2023/3/29,三峡大学李晓玲编写与制作,95,多克隆位点,启动子,裂开的N端,裂开的N端,外源DNA,半乳糖苷酶N端编码序列,pUC192686bp,pUC19
