第一章生物化学绪论.ppt

生物化学简明教程Biochemistry,课程介绍,课程性质：生物专业基础课总学时:72周学时：4考核方式:平时成绩 30%（作业+出勤）+期中成绩20%+期末成绩 50%,教材：张丽萍等主编，高等教育出版社生物化学简明教程参考书：沈同、王镜岩主编生物化学上下册；赵文恩等编著生物化学化学工业出版社；刘志国主编新编生物化学中国轻国业出版社；郭勇编著现代生化技术科学出版社；王镜岩等编译生物化学科学出版社。,生物化学的概念,生物化学是研究生物体分子组成及其变化规律的基础学科，是对生命现象最为基础，最为深入的分子水平的机制探讨。有”生命的化学”之称。,生物化学的研究内容,1.生物体物质的化学组成、结构、性质和功能2.生物分子的分解与合成，反应过程中的能量变化及新陈代谢的调节与控制 3.生物体遗传信息的储存、传递和表达,生物化学的产生与发展,十九世纪末至20世纪初，生物化学成为一门独立的学科。1903年德国人Neuberg（纽伯格）提出了“Biochemistry”。,生物化学发展史上的重大事件,1828,维勒从氰酸铵中合成出尿素,1897,Buchner 演示细胞提取物的发酵，活体外试验开始,1926,Sumner 分离出第一个酶的晶体脲酶.,1944,Avery,MacLeod,and McCarty 认为DNA是遗传物质.,1953,Watson and Crick 提出DNA双螺旋结构模型,1959,Perutz 确定了血红蛋白的空间结构.,1966,遗传密码被破译.,1937,Krebs 提出三羧酸循环.,1868,Miescher 从脓细胞中分离出核素,1925,阐明了糖的酵解途径,国内生物化学的发展,生物化学家和营养学家吴宪：国际著名生物化学家、中国近代生物化学事业的开拓者和奠基人。他一生共发表163篇研究论文，3部专著，在该学科的临床化学、气体与电解质的平衡、蛋白质化学、免疫化学、营养学以及氨基酸代谢等6个领域的研究居当时国际前沿地位。20世纪20年代后期建立了制备血滤液的方法以及测定血糖的方法（Folin-Wu法）；20世纪30年代，1931年蛋白质变性理论,2项突出成果：1965年合成了具有生物活性的牛胰岛素 1981年合成了具有生物活性的酵母丙氨酸tRNA最近二、三十年生物工程 目前已能用基因工程的方法生产许多产品如乙型肝炎疫苗、SOD（超氧化物歧化酶）、人生长激素、各种干扰素、各种白细胞介素等等。我国于1993年启动人类基因组计划（HGP,1%）,第二章 蛋白质化学,什么是蛋白质（Protein）？是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的生物大分子。,一、蛋白质的元素组成,元素组成：所有蛋白质都含有 C、H、O、N 四种元素，大多数蛋白质还含有少量的 S，有些蛋白质还含有一些其它元素，如 P、Fe、Zn、Cu、Mo、I等。各种蛋白质的含氮量都很接近，都在16%左右。蛋白质含量(总氮含量-无机氮含量)6.25,二、蛋白质的分类,按形状分为三种：球状蛋白质纤维状蛋白质膜蛋白质,纤维蛋白：结构有规律，分子极不对称，呈纤维状，溶解性能差，主要起保护、支持、结缔的功能。如角蛋白、胶原蛋白、各种纤维蛋白等。球状蛋白：结构复杂，球形或椭圆形，如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白、球蛋白等。膜蛋白：一般折叠成近球状，插入生物膜，或结合在生物膜的 表面,纤维状蛋白的构象 角蛋白（keratin）,按分子组成：简单蛋白：仅由肽链组成，不包含其他辅助成分的蛋白质结合蛋白：由简单蛋白和非蛋白组分两部分组成,结合蛋白,由简单蛋白和非蛋白组分两部分组成，非蛋白质部分称为辅基。根据辅基的不同，结合蛋白可以分为5类：核蛋白、糖蛋白与蛋白聚糖、脂蛋白、色蛋白、磷蛋白。,1.核蛋白（nucleoprotein）,由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成。存在于所有细胞里，细胞核里的核蛋白（染色体）是由DNA和组蛋白（His）结合而成。细胞质中的核糖体（ribosome）是由RNA和蛋白质组成的。病毒（virus）全部是核蛋白。,2.糖蛋白（glycoprotein）和聚糖蛋白,由蛋白质和糖通过共价键相连而成。连接方式：O-连接和N-连接。功能：催化、运载、免疫、激素、保护、信号传导。,生物膜上的糖蛋白,3.脂蛋白（lipoprotein）,由蛋白质和脂质通过非共价键相连而成，存在于生物膜和动物血浆中。蛋白质部分称为脱辅基蛋白，又称载脂蛋白。生物膜中的脂含量差异很大。血浆中的脂蛋白的主要功能是经过血液循环在各器官间运输不溶于水的脂类。,4.色蛋白（chromoprotein）,由蛋白质和色素组成的色蛋白种类很多，其中含卟啉类的色蛋白最为重要。如血红蛋白、细胞色素c、过氧化氢酶都是由蛋白质和铁卟啉组成的。血红素是由一种原卟啉与一个亚铁原子构成的化合物。,原卟啉（Protoporphyrin）,血红素（heme）,5.磷蛋白（phosphoprotein）,由蛋白质和磷酸组成，磷酸通常与Ser（丝）或Thr（苏）侧链的-OH结合。如胃蛋白酶，乳中的酪蛋白都含有许多Ser磷酸残基。,按功能分类,酶：具催化活性的蛋白质；调节蛋白；贮存蛋白；转运蛋白运动蛋白；防疫蛋白和毒蛋白；受体蛋白；支架蛋白；结构蛋白异常功能。,三、蛋白质的氨基酸组成,用酸、碱或酶将蛋白质彻底水解，可以得到许多种氨基酸的混合物，说明氨基酸是蛋白质的基本结构单位。,（一）氨基酸的结构通式,除脯氨酸（Pro）外，其他19种氨基酸均为-氨基酸。而脯氨酸为-亚氨基酸。,Pro,构型（configuration）：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,立体异构（enantiomers or stereoisomers）D,L system,L-(-)甘油醛L-glyceraldehyde,D-(+)甘油醛D-glyceraldehyde,参照物,组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“（-）”号表示，向右旋转的称右旋，用“（）”号表示。,外消旋,内消旋,消旋,氨基酸的立体异构与旋光异构没有直接的对应关系。各种-型氨基酸中有左旋也有右旋的。,除甘氨酸以外，蛋白质水解的其他-氨基酸均为-型。,（二）氨基酸的分类,1.根据侧链的化学结构脂肪族氨基酸（aliphatic Aa，15种）甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰氨（Asn）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）。,芳香族氨基酸（aromatic Aa)苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）杂环氨基酸（heterocyclic Aa）组氨酸（His）、色氨酸（Trp）杂环亚氨基酸（heterocyclic Aa）脯氨酸（Pro）,2.根据侧链R基团的极性和在中性条件下带电的情况，分为极性和非极性两大类，四小类,非极性氨基酸,甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸,亮氨酸 甲硫氨酸 异亮氨酸,非极性氨基酸,苯丙氨酸 脯氨酸 色氨酸,具有非极性或疏水性侧链的氨基酸，在水中的溶解度较极性氨基酸小，其疏水程度随着脂肪族侧链的长度增加而增大。,甘氨酸的特殊性,按理甘氨酸应属于极性氨基酸（侧链为H），介于极性和非极性之间，因此可以列为非极性氨基酸。,不带电荷的极性氨基酸,丝氨酸 苏氨酸 半胱氨酸,酪氨酸 天冬酰胺 谷氨酸,极性基团（R基）能够与水形成氢键。丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的极性与它们所含的羟基有关，天冬酰胺，谷氨酰胺的极性同其酰胺基有关。而半胱氨酸则因含有巯基，所以属于极性氨基酸,极性带正电荷的R氨基酸,赖氨酸 精氨酸 组氨酸,带正电荷侧链（在pH接近中性时）的氨基酸包括赖氨酸，精氨酸和组氨酸，它们分别具有-NH2，胍基和咪唑基（碱性）。这些基团的存在是使它们带有电荷的原因，组氨酸的咪唑基在pH7时，有10%被质子化，而 pH6时50%质子化。,极性带负电荷的R氨基酸,天冬氨酸 谷氨酸,带有负电荷侧链的氨基酸（pH接近中性时）包括天冬氨酸和谷氨酸。由于侧链为羧基（酸性），在中性pH条件下带一个净负电荷。,（三）氨基酸的重要理化性质,1.一般物理性质-氨基酸为晶体，熔点一般在200以上。不同氨基酸的味道有所不同。溶解度差别很大，溶于稀酸、碱，不溶于有机溶剂（可以用酒精沉淀分离）。,2.两性解离和等电点氨基酸是两性离子（Zwitterion），存在能够释放质子的-NH3+和接受质子的-COO-。,不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：,正离子,两性离子,负离子,氨基酸所带静电荷为0时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectric point），以pI表示。此时，溶解度最小，容易沉淀（等电点沉淀）。,当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。,等电点的计算,中性氨基酸：以Gly为例,pI=,2,pK1+pK2,酸性氨基酸，以Asp为例：,碱性氨基酸，以Lys为例：,氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值之和的二分之一。,羧基的解离度大于氨基（-羧基最大），所以中性氨基酸的pI在pH6.0左右，碱性氨基酸pI较大，酸性氨基酸较小。PI(碱性中性酸性）,3.氨基酸的化学性质,氨基酸的-氨基、-羧基以及侧链均可参加反应。,（1）与水合茚三酮的反应,除Pro以外，其他氨基酸与茚三酮反应均生成蓝紫色产物（570nm），Pro生成的产物为黄色（440nm）。茚三酮反应非常灵敏，可以用于氨基酸的定性和定量测定。多肽和蛋白质也可反应，但灵敏度差。此反应是-氨基和-羧基共同参与的反应。,（2）与甲醛的反应（-氨基）,羟甲基氨基酸,二羟甲基氨基酸,氨基酸的甲醛滴定,酚酞作指示剂，NaOH滴定，终点为紫色。可以测定蛋白质的水解或合成进度。,（3）与2,4-二硝基氟苯的反应,2,4-二硝基氟苯,DNP-氨基酸（黄色）,多肽或蛋白质N端氨基酸的-氨基也能与DNFB反应，生成DNP-多肽和DNP-蛋白质。DNP-氨基酸与其他氨基酸的溶解度不同，可以用乙醚将DNP-氨基酸抽提（extract，萃取）出来。上述方法曾用于胰岛素一级结构的测定（F.Sanger）,与5-二甲氨基萘磺酰氯（dansyl chloride,DNS-Cl）的反应,荧光光度计测定N-端氨基酸,（4）与异硫氰酸苯酯的反应,反应条件：弱碱性。此反应也可以用以测定多肽或蛋白质序列（Edman反应）。测定条件：酸水解，乙酸乙酯抽提。,（5）与荧光胺反应,反应非常灵敏，产物有荧光。可用荧光分光光度法测定氨基酸含量。,荧光胺Fluorescamine,（6）与5,5-双硫基-双-2-硝基苯甲酸反应,半胱氨酸的-SH参与的反应。产物在412nm有一个最大吸收峰，可测定半胱氨酸的含量。,+,PH8.0,+,四、肽（peptide）,氨基酸的-氨基和-羧基缩水而成的化合物称为肽。形成的键称为肽键，或酰胺键。,肽和肽键的形成,+,肽键,丙氨酸,甘氨酸,丙氨酰甘氨酸,二肽,二肽 三肽 四肽,多肽（Polypeptide）,肽的命名,命名：根据氨基酸组成，由N端C端命名,丙氨酰甘氨酰亮氨酸 AlaGlyLeu),氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链,N端,氨基酸残基,氨基酸残基,C端,肽链书写方式：N端C端,肽链有链状、环状和分支状。,天然的生物活性肽,（一）谷胱甘肽（glutathione，GSH）存在于动植物、微生物细胞中的重要三肽，由Glu、Cys和Gly组成。GSH的特殊性：具有一个-肽键，由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的-氨基缩合而成。,GSH含有一个活泼的-SH，很容易被氧化，两分子GSH脱H以二硫键相连形成氧化型的。GSH的巯基具有嗜核特性，能与嗜电子物质结合，阻断这些化合物与DNA、人、RNA结合，保护机体免受损害,（二）催产素和升压素,属于激素类（Hormone）。均由下丘脑神经细胞合成，最终释放到血液。都是9肽，分子中有环状结构。,功 能,催产素：使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产及使乳腺排乳的作用。加压素：促进血管平滑肌收缩，使血压升高，并具有减少排尿的功能。两者均与记忆有关，功能相反。,（三）促肾上腺皮质激素（ACTH）,由腺垂体分泌的一种由39个Aa组成的多肽。活性部位为第4-10的7肽：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。功能：促进肾上腺皮质的生长和肾上腺皮质激素的合成和分泌。其他部位如大脑和下丘脑也可以分泌ACTH。,（四）脑肽,种类很多，脑啡肽（enkephalin）是在高等动物大脑中发现的，具有镇痛功能，比吗啡的功能更强。1975年脑啡肽的结构被阐明，并分离出两种脑啡肽。1982年我国人工合成了Leu-脑啡肽。,甲硫氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPhe-Met,亮氨酸脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu,（五）胆囊收缩素,消化管分泌与消化机能相适应的活性肽。小肠：胃泌素，促进胃酸分泌。十二指肠、空肠：肠促胰泌素，可刺激胰脏分泌HCO3-，增强十二指肠对胆囊收缩素（33个Aa）的分泌。,（六）胰高血糖素,胰脏-细胞可分泌胰高血糖素，为29肽。可调节控制肝糖原降解产生葡萄糖，以维持血糖水平，还能够引起血管舒张，抑制肠的蠕动及分泌。,五、蛋白质结构,蛋白质是由各种氨基酸通过肽键连接而成的多肽链，再由一条或多条以上的多肽链按各自特殊方式组合成具有完整生物活性的分子。蛋白质与多肽的主要区别：分子量和空间结构。,蛋白质的结构层次,一级结构（primary structure）；二级结构（secondary structure）；超二级结构（super secondary structure）；结构域（domain）；三级结构（tertiary structure）；四级结构（quaternary structure）。,（一）蛋白质的一级结构,蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序（序列）就是蛋白质的一级结构。氨基酸残基：氨基酸的-氨基和-羧基缩水合形成的基团。多肽或蛋白质的书写方式：氨基末端或N末端写在左边（H），羧基末端或C末端写在右边（OH）。,二硫键,蛋白质分子的结构有链状、环状、分枝状等多种形式。二硫键是由两个Cys残基连接而成，是连接肽链内或肽链间的主要桥键。二硫键起着稳定肽链空间结构的作用，并与生物活性有关。,胰岛素（insulin）,是由动物胰脏中胰岛细胞分泌的一种分子量较小的蛋白质激素，可降低血糖含量。是第一个被阐明一级结构的蛋白质，由A（21）、B（30）两条链组成，有3个二硫键，二硫键被破坏将影响胰岛素的活性。,胰岛素的一级结构（1953）,不同结构层次间的关系,一级结构是最基本的，它包含着决定蛋白质高级结构的因素。,（二）蛋白质的空间结构,蛋白质分子的多肽链并不是线形伸展，而是按一定方式折叠盘绕成特有的空间结构。蛋白质的空间结构通常称为蛋白质的构象（又称高级结构），是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。,（二）稳定蛋白质空间结构的作用力,次级键（高级结构）：氢键、盐键、疏水键、范德华力、配位键。H键，由H同电负性大的原子形成的吸引作用力，键能较小。,疏水键是多肽链上疏水性较强的Aa的非极性侧链避开水相自相粘附聚集在一起形成的，对维持蛋白质的三级结构有重要作用。盐键是通过Pr中带正、负电荷的侧链基团互相接近，通过静电吸引而形成的。范德华力，实质是静电力，分为定向力、诱导力和分散力。,a 离子键 b 氢键 c 疏水键 d 范德华引力,蛋白质的二级结构,主要是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式。天然蛋白质一般均含有-螺旋、-折叠和-转角的结构。,（1）-螺旋（-helix）,1951年美国Pauling和Corey等人在研究纤维状蛋白质时，提出了-螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在-螺旋。,-螺旋结构要点,（1）每隔3.6个残基（residue），螺旋上升一圈，螺旋体的中心轴每上升一圈相当于向上平移0.54nm，每个残基上升0.15nm，每一圈每个残基旋转100（2）在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。（3）-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。(4)-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。,氢键（H-bond）的结构,除了上面这种典型的-螺旋外，还有一些不典型的-螺旋，所以规定了有关螺旋的写法，用“ns”来表示，n为螺旋上升一圈氨基酸的残基数。s为氢键封闭环内的原子数，典型的-螺旋用3.613表示，非典型的-螺旋有3.010，4.416（螺旋）等。,-螺旋的稳定性,在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，-螺旋就不稳定。在多肽链中只要出现Pro，-螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节（kink）。Gly的R基太小，难以形成-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成-螺旋。,（2）-折叠,也是Pauling等人提出来的，它是与-螺旋完全不同的一种结构。-折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。在两条相邻的肽链之间形成氢键。,-折叠,-折叠有平行和反平行的两种形式:,平行（parallel）,反平行（antiparallel）,平行和反平行,平行：所有肽链的N端处于同一端，为同方向，如-角蛋白。反平行：肽链的N端一顺一倒的排列，如丝心蛋白。反平行更稳定。每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是0.325nm，反平行的是0.347nm。反平行的链间氢键与肽链走向平行。,（3）-转角,-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180的回折，在回折角上的结构就称-转角，也称发夹结构，或称U形转折。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H之间形成氢键。,Gly的侧链为H，适合于充当多肽链大幅度转向的成员。Pro残基的环状侧链的固定取向有利于多肽链-转角的形成，它往往出现在转角部位。,（4）自由回转,又称无规卷曲、自由绕曲。无规卷曲是指没有规律性的肽链结构，但许多蛋白质（如酶）的功能部位常常埋伏在这里。,2.超二级结构和结构域,超二级结构是1973年Rossmann提出的，它是指由若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。主要有，等。,结构域,超二级结构在层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。结构域是球状蛋白的折叠单位和基本功能单位，多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球状的结构。在空间上彼此分隔，各自具有部分生物功能的结构。,对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链通常由两个或两个以上相对独立的结构域缔合成三级结构；对于较小的蛋白质或亚基，结构域和三级结构是等同的，即这些蛋白质是单结构域的。,肌红蛋白和血红蛋白-亚基,蛋白质的三级结构,三级结构是指多肽链上的所有原子（包括主链和残基侧链）在三维空间的分布。三级结构研究最早的是肌红蛋白，1963年Kendrew等用X射线衍射技术对抹香鲸肌红蛋白的研究中发现。,由153个A残基和血红素辅基组成的一条肽链。有8段-螺旋体。内部疏水，外部亲水。只有一个结构域。,蛋白质的四级结构,亚基（subunit）：大多数相对分子量大的蛋白质都是由几个多肽链组成一个活性单位。这些肽链相互以非共价键联结成一个相当稳定的单位，这种肽链就称为该蛋白质的亚基。,亚基与肽链的关系四级结构：指的是分子中亚基的种类、数量以及相互关系。,血红蛋白由2条和2条共4个亚基组成。和链的一级结构差异很大，但三级结构基本相同，与肌红蛋白很相似。四级结构由分子表面的次级键（疏水作用力、盐键和H键）结合而成。,六、蛋白质分子结构与功能的关系,蛋白质的生物功能是以其化学组成和结构为基础的。,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,1.种属差异不同有机体中执行同一功能的蛋白质的氨基酸排列顺序存在十分明显的种属差异。,例1 胰岛素,来自哺乳动物、鸟类和鱼类的胰岛素一级结构都是由51个氨基酸组成，但排列顺序有差异。主要差异在A链小环的8、9、10和B链30位氨基酸残基。这4个氨基酸的改变不影响胰岛素的功能，但所有来源的胰岛素中二硫键的位置是固定不变的，说明其对胰岛素的功能十分重要。,表1-5 不同哺乳动物的胰岛素分子中的氨基酸差异,例2 细胞色素C（cytC）,广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中，是一种与血红素辅基相结合的单链蛋白质，在生物氧化中起重要作用。亲缘关系越近cytC组成和结构的相似性越大，从而为生物的进化提供了证据。与功能密切相关的氨基酸序列是不变的。,表1-6 不同生物与人的细胞色素c相比较的氨基酸差异数目,2.分子病,蛋白质一级结构中的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。如非洲人中流行的一种镰刀型贫血病，是由于病人的血红蛋白（Hb-Val）与正常人的血红蛋白（Hb-Glu）差异引起的。,正常红细胞呈双凹型，无氧状态下仍然分散；异常呈镰刀型，无氧状态下呈聚集分布。,（二）蛋白质构象与功能的关系,别构现象：蛋白质的构象并不是固定不变的，当有些蛋白质表现其生物活性时，其构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象就称为别构现象（别构效应、变构效应）。具有这种现象的蛋白质叫别构蛋白。,血红蛋白是由两个-亚基和两个-亚基组合而成的四聚体。随着氧浓度的增加，当氧首先与其中一个-亚基结合以后，该亚基的构象发生变化，又引起另外3个亚基的构象发生变化，亚基间的次级键破坏，分子的空间构象发生改变。所有亚基血红素铁更容易与氧结合，因而Hb与氧的结合速率大大加快。,七、蛋白质的性质,（一）蛋白质的相对分子量蛋白质的相对分子量很大，一般在1,00001,000,000之间。,（二）蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质也是两性电解质。能解离的基团除-氨基和-羧基以外，还有侧链的-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基、胍基、酚基、巯基等。,蛋白质的两性解离,pH=pI,pHpI,pHpI,蛋白质的等电点与其氨基酸的种类和数量有关。如鱼精蛋白（12-12.4）、胃蛋白酶（1-2.5）。等电点时蛋白质溶解度最小，容易聚集而沉淀。因此，可利用此特性进行分离、提纯。,电泳,带电的颗粒在电场中可以向电荷相反的电极移动，利用这一性质分离带电荷分子的实验技术称为电泳。蛋白质分子电泳的方向和速度取决于其带电性、电荷多少、分子量以及颗粒大小。电泳法常用于混合蛋白质的分离和提纯。,（五）蛋白质的变性,变性：天然蛋白质因受物理或化学的因素影响，其分子内部原有的高度规律性结构发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质有所改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象称变性作用。,蛋白质变性的实质：高级结构被破坏，共价键不变，生物活性丧失。引起蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇；加热、紫外线、X射线、超声波等。,变性蛋白质的特性,（1）生物活性全部或部分丧失；（2）一些理化性质的改变（3）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加(4)生化性质的改变,蛋白质的复性,巯基乙醇作为巯基的保护剂,RNA水解酶的变性和复性,（三）蛋白质的胶体性质,蛋白质相对分子量大，在水溶液中的形成的颗粒具有胶体溶液的特征（布朗运动、丁道尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等）。,（四）蛋白质的沉淀反应,1.加高浓度盐类（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）盐析：加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称盐析。高浓度盐可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀。,2.加有机溶剂破坏蛋白质分子周围的水膜。3.加重金属盐碱性溶液中与重金属离子作用而沉淀。4.加某些酸类能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。5.加热,（六）蛋白质的颜色反应,1.双缩脲反应,紫红色,2.酚试剂蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基在碱性条件下能将酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（生成钼蓝和钨蓝的混合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。,3.乙醛酸反应蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁缓缓加入浓硫酸，在两液层之间会了现紫色环。凡含有吲哚基（色氨酸）的化合物均有此反应。,4.坂口反应精氨酸分子中的胍基，能与次氯酸钠及-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。,2.米伦氏反应米伦试剂：硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。蛋白质加入米伦试剂后产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。含有酚基的化合物都有此反应。,一级结构的测定,一级结构测定的原则：（1）测定蛋白质中氨基酸组成；（2）蛋白质的N端和C端的测定；（3）应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各自得到一系列大小不同的肽段。（4）分离提纯所产生的肽，并测出它们的序列。（5）从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序。,序列测定前的准备工作,样品的纯度相对分子质量肽链的数目氨基酸组成一级结构的测定主要用小片段重叠的原理,二硫键位置的确定,用过甲酸氧化二硫键，使胱氨酸生成两个半胱氨磺酸。然后采用电泳法可分离由二硫键断裂产生的肽链。,