第八章 核酸化学与代谢课件.ppt
第八章、核酸化学,核酸的组成成分,DNA的结构,DNA和基因组,RNA的结构,核酸生物合成,核酸的生物学功能,核酸的分子生物学,2,一、核酸的生物学功能,（一）核酸与遗传信息的传递,DNA是基本遗传物质 一定结构的DNA产生一定结构的蛋白质，才有一定形态和生理特征，所以DNA的特定遗传密码产生的蛋白质就代表特定生物的遗传性。在遗传过程中DNA的具体作用：（1）在细胞分裂时按照自己的结构精确复制传给后代；（2）作为模板将所贮遗传信息传给mRNA。,3,RNA在传递遗传信息上的作用 1)mRNA是蛋白质合成的模板；2)tRNA识别mRNA上的遗传密码，转运特定氨基酸到核糖体上合成肽链；3)rRNA是核糖体的主要成分，是翻译工作的场所。,（二）核酸与蛋白质的生物合成,DNA转录为mRNA是有选择的，tRNA和rRNA也是DNA的转录产物。,（三）核酸结构改变与生物变异,一切生物的变异和进化都可以说是由于DNA的结构改变而引起蛋白质改变的结果。,4,生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。）有的由于DNA碱基的颠倒（如TA被颠倒为AT）或被调换（如GC被换为TA）；）有的由于在DNA复制过程中被遗漏了一对或多了一对核苷酸，）或者在转译时发生了差误，如氨酰tRNA合成酶错将一个结构与正常氨基酸十分相似的物质交给tRNA。）还有一些生物的遗传性状发生了突变。,5,（四）DNA与细菌转化,一种细菌的遗传性状因吸收了另一种细菌的DNA而发生改变的现象，称为细菌的转化。,（五）核酸与病变,遗传性疾病是由于遗传缺陷而产生的，也就是DNA结构改变的结果。镰刀型红细胞贫血和白化病(albinism)。病毒对活细胞的侵染是寄主发生疾病，主要是由于核酸的作用。如流感、肝炎、带状疱疹、脊髓灰质炎、白血病、烟草斑纹病。,6,（六）遗传工程,遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育新型生物品种的技术。实验室中将细菌作材料研究遗传工程过程可分为：（1）重组DNA分子（基因重组）；（2）将重组DNA引入受体细胞（转化或转导）。,有利：（1）改良微生物品种使产生人工难以制得的生物活性物质如胰岛素、干扰素等；（2）解决某些疾病病因和控制这些疾病。,（一）核糖和脱氧核糖,-D-2-核糖,-D-2-脱氧核糖,核糖+H+,糠醛,甲基间苯二酚,FeCl3,绿色产物,脱氧核糖+H+,-羟基-酮戊醛,二苯胺,蓝色产物,RNA和DNA定性、定量测定,（二）嘌呤碱和嘧啶碱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（A）,鸟嘌呤 guanine,（G）,1,2,3,6,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶 uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶 thymine,（T）,H,H,烯醇式,（三）核苷,胸 苷,尿苷,OH,假尿苷（）,（四）核苷酸,P,-O,胸苷-5-磷酸,各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。,在体内能量代谢中的作用：,ATP能量“货币”,UTP参加糖的互相转化与合成,CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,第二信使cAMP,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,三、DNA的结构,（一）DNA的一级结构,1)因为DNA的脱氧核苷酸只在它们所携带的碱基上有区别，所以脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列（base sequence)。2)通常碱基序列由DNA链的53方向写。3)DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。,1.双螺旋结构的主要依据,（）DNA中AT、CG。后发现：与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。,（）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。,（二）DNA的双螺旋结构,1953年，Watson 和Crick 提出。,20,21,鸟嘌呤胞嘧啶碱基对,腺嘌呤胸腺嘧啶碱基对,22,磷酸二酯键,23,2.双螺旋结构模型要点,（1）两条多核苷酸链反向平行。（2）碱基内侧，A与T、G与C配对，分别形成3和2个氢键。（3）双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。,3.双螺旋结构的稳定因素,（1）氢键（太弱）；（2）碱基堆积力（base stacking force，由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。,24,25,26,（三）DNA的三级结构,线形分子、双链环状(dcDNA)超螺旋,染色体包装,染色体包装的结构模型,多级螺旋模型压缩倍数 7 6 40 5 DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级包装 三级包装 四级包装,四、DNA与基因组织,DNA,Transcription,RNA（mRNA、tRNA、rRNA）,Translation,Protein,基因,基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。,结构基因,调节基因,基因组,30,五、RNA结构,、其基本结构同DNA，主要区别：）核糖为：RNA；）含氮碱基中有，没有。、RNA主要有三种：）结构 RNA（rRNA)；）信使 RNA(mRNA)；）转运 RNA（tRNA).,31,32,33,主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶(D)；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TC环含有T和；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。,34,35,六 核酸的生物合成,一）DNA的生物合成,二）RNA的生物合成,36,一）DNA的生物合成,（一）DNA的半保留复制,37,1、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式复制,5,3,5,3,一）DNA的生物合成-半保留,DNA复制的起点和方向,38,2、真核生物DNA的多起点复制,n,39,（三）原核细胞的DNA复制,1.DNA聚合酶（Pol）,（dNMP）n+dNTP,Mg2+,（dNMP）n+1+PPi,特点,（1）不能催化从无到有的聚合反应。,（2）催化的反应只能在引物的3延伸。,（3）3接上的核苷酸决定于模板链。,（4）具有53和35外切酶活性。,40,2.Pol和Pol,PCR（多聚酶链式反应）,1 热变性,2 退火,3 DNA聚合酶,重复1，2，3,PCR反应全过程,41,3.双链DNA复制的分子机制,（1）冈崎片段和半不连续复制,复制叉上DNA合成的三种可行性,42,（2）冈崎片段的RNA引物,利福酶素对RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素对蛋白质合成有抑制作用。,引物RNA在复制过程中暂时存在，最后通过Pol的53外切酶活力水解。,（3）DNA连接酶,催化一条DNA链的3末端与相邻的另一条DNA链的5末端之间的磷酸二酯键的合成。,43,其它功能：（1）修补双螺旋DNA中单股的缺口；（2）连接线状双螺旋DNA以产生环状DNA；（3）重组过程中将几段DNA链连接起来。,（4）母本DNA双链的分离,DNA解螺旋酶（DNAhelicase）,拓扑异构酶（type topoisomerase）,44,（5）DNA聚合酶的“校对”作用,DNA聚合酶的35外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成“错配”的一种手段。,4.真核细胞DNA的复制,（1）真核细胞DNA复制有多个起始点。,（2）至少有5种DNA聚合酶，即、。,（3）端粒由端粒酶催化复制。,生物细胞DNA复制分子机制的基本特点,45,5.反转录作用,利用反转录酶可制造与任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互补DNA（cDNA）。,6.DNA的损伤与修复,（1）DNA损伤的各种结构变化,碱基缺失或插入,碱基改变,46,（2）修复机制,光复活；切除修复；重组修复；SOS修复,（3）修复缺陷和疾病,癌症；着色性干皮病；贫血病。,47,重组修复,5,重组,修复,48,7.细菌的限制修饰系统,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端。,平头末端,Hpa,49,粘性末端,EcoR,50,二 RNA的生物合成,（一）转录,转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。,1.原核细胞的转录,E.coli 的RNA聚合酶中，2称为核心酶。,因子辨认模板DNA的起始位点。,51,2.真核细胞的转录,真核细胞RNA聚合酶有、三类。,3.转录过程的选择性抑制,放线菌素D是原核和真核细胞RNA聚合酶的专一抑制剂。,利福平是原核细胞RNA聚合酶的抑制剂。,-鹅膏蕈碱是真核细胞RNA聚合酶的抑制剂。,4.转录产物的加工,（1）rRNA前体的转录后加工,原核细胞,52,真核细胞,（2）tRNA前体的加工,（3）真核细胞mRNA的加工,53,7、DNA的分子生物学技术(后面我来讲）,54,1.变形梯度凝胶电泳,1）变性梯度凝胶电泳(DGGE)原理：在碱基序列上存在差异的不同DNA 双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA 双链解链后，在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降。将PCR 扩增得到的等长的DNA 片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同的DNA 序列。该技术可以分辨具有相同大小片段的序列差异，可以用于检测单一碱基的变化，微生物群落遗传多样性以及 PCR 扩增 DNA 片段的多态性。该技术主要操作过程如下（图1）:,55,DGGE技术主要操作过程如下:,样品预处理;样品DNA(或RNA)提取及纯化;16S rDNA 或基因片段的PCR(或RT-PCR)扩增;预实验(DGGE 条件优化);制胶;样品的DGGE 分析;图谱分析;条带序列分析。,56,DGGE过程示意图,57,DGGE特点：,GC 夹板(GCclamp)使用。为取得好的分离效果，常在 DNA 片段上连接一段长为3050 碱基富含 GC 的核苷酸序列GC 夹板(GCclamp)，可分辨相差一个碱基的序列。DGGE 技术快速简便、分离效果好。从理论上讲，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE 技术对于DNA 片段的分辨率可以达到一个碱基差异水平，DGGE 法只能对微生物群落中数量上大于1%的优势种群进行分析。DGGE 技术无法提供代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。,58,应用举例：-变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析生化反应器微生物,一、取样与预处理,1、微生物取样 稳定运行条件下，不同温度条件（冬季、夏季）的生物强化一体化反应器的厌氧区、好氧区填料上生物膜，HPES生物滤塔填料上的生物膜。2、样品的预处理 高速离心处理生物膜样品，用PBS（磷酸盐缓冲液）洗脱与固定生物膜。,59,二、总DNA提取,土壤基因组提取试剂盒快速提取生物膜中的总DNA。,60,Marker,61,1、反应体系：,三、PCR扩增,62,62,引物序列,63,变性延伸，25-35个循环；,2、PCR反应条件：,64,3、琼脂糖电泳后紫外成像。,65,三、PCR扩增,DGGE 紫外成像 DGGE 成像切胶,四、测序过程与结果,一）测序过程1、对回收的DGGE条带进行二次PCR扩增二 及产物回收；2、目的片断TA克隆；3、蓝白斑筛选；4、质粒提取5、M13+/-测序（见测序图谱）,66,二）测序结果,67,68,五、结论,1、生物强化一体化反应器、HPES反应生物滤塔中的微生物优势种类相同；但前者中的生物多样性要高一些，约高20%。2、生化反应器中的微生物以耐盐性菌类为主。如，新鞘氨醇杆菌属、-变形菌纲的红螺菌、纤发菌属等；3、生物中存在着一些硝化细菌，如：甲基球菌属、亚硝化单胞菌等。4、在冬季取样中发现有耐寒性微生物，如单胞菌属一种Sphingomonas aurantiaca。,69,
