第13章DNA的生物合成课件.ppt

第13章 DNA的生物合成-复制,基因Gene,1909年、约翰逊（丹麦）Johannsen提出,1944年（1877-1955），美国O.T.Avery(艾弗里）证明了DNA是遗传物质。,1953年Watson and Crick，发现DNA的双螺旋结构。,基因是DNA大分子中的各个功能片段，含有控制生物性状、发育的全部遗传信息。,人类的基因 约3.5万个。基因分类：结构基因：编码蛋白质 1%调节基因：调节基因表达。插入序列、重复序列：,中心法则（1958年）,美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授Howard Temin和加州理工学院的教授David Baltimore于1970年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中心法则。于1975年获得诺贝尔奖。,中心法则 Central Dogma,RNA,DNA,蛋白质,转录,翻译,复制,逆转录,少数病毒复制,翻译,蛋白质（病毒）,1.以DNA为模板指导合成DNA的过程 复制,2.以DNA为模板指导合成RNA的过程 转录,3.以mRNA为模板指导合成蛋白质的过程 翻译,4.以RNA为模板指导合成DNA的过程 反转录,5.以RNA为模板指导合成RNA的过程 复制,要点：,甲流病毒结构图片,禽流感？猪流感？从1918到2009新流感的秘密,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,本章主要内容：,复制的基本规律DNA复制酶学和拓扑学变化DNA的复制过程反转录和其他的复制方式DNA的损伤和修复,第一节 复制的基本规律,一、半保留复制(semiconservative replication)二、双向复制(bidirectional replication)三、半不连续复制(semi-discontinuous replication),四、复制的高保真性,一、半保留复制,1.概念：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板，按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整接受过来，另一股单链是新合成的，两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致，这种复制方式为半保留复制。,归纳：半新半旧,2.实验依据：密度梯度实验（Meselson and Stahl）,1958 Matthew Meselson和Franklin Stahl,美国科学家马修.梅塞尔(Matthew Keelson),福兰克林.斯塔尔(Franklin Stahl),1957年，梅塞尔和斯塔尔在加州工学院工作期间，利用大肠杆菌研究遗传物质DNA。他们先将大肠杆菌放入含有N15的培养基中标培养，然后将这些大肠杆菌转移到N14的培养基中培养，最后把大肠杆菌经密度梯度离心。他们发现提取的DNA有三条带。,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想,含重氮-DNA的细菌（15代),第一代(20min，杂合体),第二代,梯度离心结果,重DNA,普通 DNA,电镜观察DNA复制,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制(bidirectional replication),A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点,原核生物DNA双向复制,归纳：,1个复制点2个复制叉4条链同时合成,原核生物约3106个bp，每秒合成2500个bp，才能20分钟繁殖一代。人是6109个bp，每秒合成100个bp，实际时间约8个小时。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。人类约1000个bp即有1个复制起点。,真核生物多复制子的复制,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,真核生物DNA多复制子复制,多个起始点,三、复制的半不连续性,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),岡崎片段(okazaki fragment),1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,四、DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,第二节,参与DNA复制的 主要酶类和蛋白因子,1.模板：解开成单链的DNA母链3-5,3.DNA聚合酶，DNA-pol,2.底物dNTP：dATP，dGTP，dCTP，dTTP,4.引物（primer）：RNA引物 NTP,5.其他酶和蛋白质因子,一、参与DNA复制的物质,二、复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,生成磷酸二酯键,+dN2TP,+PPi,DNA pol,3TAGAAGACCTATTGGCC5,5ATCTTCTGGATAACCGG3,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。,三、参与DNA复制的酶类,E.Coli 基因图,1、解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。,ATP,dnaA、B、C,DnaA、B、C,2、单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB),复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整,作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解,（1）拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA 分子中存在打结，缠绕、连环的现象。,3.拓扑异构酶（DNA topoisomerase）,DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑异构酶,超螺旋,螺旋,解链过程中正超螺旋的形成,（2）拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,（3）分 类,DNA拓扑异构酶动画.mov,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；切口的3端可通过自由转动一周再与5端磷酸连接，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,（4）作用机制,Topo酶：切割DNA链，使其松弛后再连接,Topo（DNA Gyrase）,解螺旋酶,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,Topo酶：切割DNA链，使其松弛后再连接,Topo（DNA Gyrase）,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,TOPO,ATP ATP,TOPO,解链酶,DNA拓朴异构酶,单链DNA结合蛋白 SSB,解开、理顺 DNA链、维持DNA单链状,特殊的RNA 聚合酶复制起始时催化生成RNA引物的酶引物长短：原核生物 50-100bp 真核生物 10-20bp,4、引物酶(primase)：,引物酶,催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶,DNA合成需在RNA引物的基础上进行,5、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：1.53 的聚合活性：以DNA为模板合成DNA 2.核酸外切酶活性：53 35,DNA聚合酶的特点：,1.底物是dNTP。有高度亲和力。2.催化3-5磷酸二酯键。3.不可以使两个游离的单核苷酸形成3-5磷酸二酯键。4.催化子链与母链之间以碱基互补的形式形成氢键。5.外切酶的活性。,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,切除引物和突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,？,（1）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,原核生物的DNA聚合酶,功能：53聚合酶活性、53 和35外切酶活性 复制中的错误校读，复制和修复中的空隙填补。,DNA-pol（109kD）,美国科学家,科恩伯格 Kornberg 1955年从E.Cole 中发现了DNA 聚合酶，为DNA的复制打下了基础。为此，Kornberg 1959年获得诺贝尔奖。,Arthur Kornberg(亚瑟.科恩伯格),美国生物化学家美国斯坦福大学结构生物学教授2006年，因对“真核转录的分子基础所作的研究”，独享诺贝尔化学奖。,罗杰科恩伯格（Roger D.Kornberg，1947-）,亚瑟.科恩伯格的长子。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,有关研究,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol II对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合，因此认为它可能参与DNA损伤的应急状态修复。,功能：原核生物复制延长中真正起催化作用的酶,DNA-pol(250kD),多亚基、不对称、二聚体,为核心酶：53聚合活性：35外切酶活性（辨别碱基）：维系二聚体作用,：夹稳模板链并使酶沿模板滑动复合物：促进全酶组装到模板上，增强核心酶的活性,（2）常见真核生物的DNA聚合酶（五种）,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，解螺旋酶活性,参与低保真性度复制,在复制过程中起校读、修复和填补空隙的作用（DNA-pol)。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,真核生物的DNA聚合酶,目 录,断端的3-OH末端，5-P末端连接的是双链中的单链缺口需要ATP,（1）DNA连接酶作用条件：,复制中起最后接合缺口作用。DNA修复、重组及剪接中起缝合缺口作用。基因工程的重要工具酶之一。,（2）DNA连接酶功能,第三节,DNA的复制过程,一、原核生物的DNA生物合成,1.复制的起始：,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,复制,倒Y,E.coli复制起始点 oriC,（1）.DNA解链:有固定的复制起点OriC,反向重复序列,复制起始点的识别,解螺旋酶解开双链,SSB参与维持DNA的单链结构的稳定,DNA拓扑异构酶(可能主要是II型酶的作用)，在将要打结或已打结处作切口。,3,5,3,5,引物,引物酶,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,SSB,含有解螺旋酶(Dna B)、DnaC、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,（2）引发体和引物,DnaA,引发体（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域,3,5,3,5,引物,引物酶,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。主要作用是提供3-OH,引物,复制叉-DNA双链解开分成两股，各自作为模板进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。,复制叉的形成,Dna B、Dna C,Dna A,3,5,3,5,（3）起始的过程,辨认并结合起始位点,打开双螺旋,防止复螺旋,单链结合蛋白,解链酶,引物,引物酶,DnaA,合成,2.复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,（1）领头链的合成,领头链：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。,（2.）随从链的合成,随从链：复制方向与解链方向相反，为不连续复制，这股不连续复制的链称为随从链。复制中位于随从链上的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。,岡崎片段的大小：真核生物：100135bp原核生物：10002000bp,目 录,同一复制叉上领头连和随从链有相同的DNA-pol催化延长,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,目 录,延 长,冈崎片断,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA,50,0,3.复制的终止,原核生物DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点,领头链上的RNA引物被RNA酶水解后，由DNA pol I 催化，由新合成链提供-OH补齐,RNA酶,DNA pol I,连接酶,随从链上不连续性片段的连接,DNA复制.mov,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,二、真核生物的DNA生物合成,多复制子 复制子(replicon)：相邻两个复制起点之间的距离。复制子是独立完成复制的功能单位。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,1.复制的起始,参与者：DNA-pol(引物酶活性)pol(聚合酶、解螺旋酶活性)拓扑酶 复制因子(replication factor,RF)增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)(是一种蛋白质，相当于原核生物DNA-pol 亚基，即形成闭合环形沿DNA滑动的夹子，使pol 获得持续复制能力。PCNA的水平也是检验细胞增殖的重要指标),目 录,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,2.复制的延长,DNA-pol DNA-pol,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。复制时间：真核生物：812h 原核生物：20min,3.复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,若干个复制子,结构特点:,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短 序列(精子9000bp，体细胞4000bp)。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒就像DNA的帽子，保护DNA重要信息不丢失,生命的时钟?,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒RNA由成百个6个核苷酸的重复序列所组成（人TTAGGG，四膜虫为TTGGGG）。端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目 录,结合长链末端3-OH,逆转录延长,反摺连接,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目 录,（1）端粒酶正常体细胞活性较低，癌细胞的活性强。通过抑制癌细胞的端粒酶活性来治疗癌症。（2）体外实验端粒因细胞分裂次数增加而变短到一定程度时，细胞就会死亡。（3）端粒破损会导致DNA变得脆弱、容易发生变异，可能导致一些与衰老有关的疾病，如动脉硬化和某些癌症。,说明：,逆转录合成DNA,第四节,一、概念,逆转录指遗传信息从RNA流向DNA，是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的DNA单链。,逆转录酶的发现美国加州理工学院的教授戴维和美国癌症学会传染性肿瘤学和细胞生物学教授侯活于1970年在鸡肉瘤中发现了逆转录酶，发展了中心法则。于1975年获得诺贝尔奖。,戴维.巴尔的摩(David Baltimore),侯活.特明(Howard temin),二、逆转录酶(reverse transcriptase),催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中含有此酶。具有三种酶活性：RNA指导的DNA聚合酶 RNA水解酶的活性 DNA指导的DNA聚合酶反转录酶没有35核酸外切酶活性，因此它无校对功能.,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,反转录过程动画.mov,四、逆转录研究的意义,1.逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。2.在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。3.逆转录病毒的研究，拓宽了病毒致癌理论。4.在基因工程中获得目的基因的重要方法。,某些病毒的生存方式。如 HIV病毒,人类免役缺陷病毒,1.病毒进入细胞,2.病毒逆转录,3.异源重组,4.病毒转录,治疗原理（鸡尾酒疗法）,阻止逆转录DNA阻止病毒蛋白原切割,洁身自好预防为主,甲流特效药物达菲（奥司他韦）口服后经肝脏和肠道酯酶迅速催化转化奥司他韦羧酸，奥司他韦羧酸的构型与神经氨酸相似，能够竞争性地与流感病毒神经氨酸酶的位点结合。抑制成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞,遗传包内有人类流感病毒基因,遗传包内有猪流感病毒基因,遗传包内有禽类流感病毒基因,第五节,其他类型的复制方式,滚环复制和D环复制 原核生物：复制 滚环复制（DNA病毒）真核生物：多个复制起点 D环复制（线粒体）,滚环复制,D环复制(D-loop replication),线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,D-环复制需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环延伸，至第二个复制起始点时，又合成第二个反向引物，以外环为模板反向延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。D-环复制的特点是复制起始点不在DNA双链的同一个位点，内、外环复制有时序差别。,特别指出：,DNA损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)and Repair,第六节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变在自然界普遍存在,（一）突变是进化、分化的分子基础,从长远的生物史看，进化过程是突变的不断发生造成的。大量突变都是属于这一类型，只是目前还未能认识其发生的真正原因，因而名为自发突变或自然突变。,（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性,这种突变没有可察觉的表型改变，例如：在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等，这种现象也相当普遍。多态性一词用来描述个体之间的基因型差别现象。,（三）致死性突变可导致个体、细胞死亡。（四）突变是某些疾病的发病基础,二、多种化学因素和物理因素可诱发突变,大量突变属于自发突变，发生频率只在10-9左右，但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。生活环境的物理和化学因素的改变所引起的突变应更加重视。,1.物理因素 紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射,胸腺嘧啶二聚体,2.化学因素,（5-溴尿嘧啶）,三、突变的分子改变类型,指DNA分子上一个碱基的变异,指DNA分子上一个碱基或一段核苷酸的丢失,指DNA分子上一个碱基或一段核苷酸的增加,指DNA分子内发生核苷酸片段的交换或顺序颠倒,DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,1.自发突变和化学诱变都能因引起DNA上某一碱基的置换。,2.点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,例如：正常成人Hb(HbA)亚基,谷氨酸,缬氨酸,镰形红细胞贫血病基因和血红蛋白的改变,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,缺失引起框移突变,缺失使阅读框前移插入使阅读框后移缺失或插入点以后的密码全部改变,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,重排可引起遗传和肿瘤等疾病。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,目 录,四、DNA损伤的修复,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型,光修复酶(photolyase),UV,光修复过程是通过光修复酶催化而完成的，需300600nm波长照射激活,（一）光修复,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制。其过程是去除损伤的DNA，填补空隙和链接。主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,目 录,UvrA、B、C修复蛋白,切除修复.avi,（三）重组修复,这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。,1.重组修复只修复子链，母链不能修复。2.随细胞增殖损伤部位逐渐被稀释。,重组修复动画,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。（SOS国际海难信号）,附 录,E.Coli中的DNA聚合酶,本章结束,