第四章免疫荧光细胞化学技术课件.ppt

第四章免疫荧光细胞化学技术,免疫荧光细胞化学技术(immunofluorescence cytochemistry)采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针，检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本，根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的性质并定位，以及利用定量技术测定含量。,荧光抗体法：用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。较常用荧光抗原法：用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。荧光抗体法+荧光抗原法=免疫荧光细胞（组织）技术,免疫荧光细胞化学技术,包括荧光抗体法和荧光抗原法,免疫荧光细胞化学方法：直接法、间接法、补体法免疫荧光染色标本制备：涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片 经适当固定后染色，或不固定直接染色。存档蜡块：不能再用以免疫荧光染色 存档的HE染色标本：褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。,主要内容一、荧光的特征二、荧光素三、荧光素标记抗体的方法四、荧光抗体的质量鉴定五、免疫荧光组化染色方法六、荧光显微镜七、非特异性荧光的消除方法 八、免疫荧光细胞化学的对照染色 九、激光扫描共聚焦显微镜,一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。,激发:当电子吸收能量跃迁到较高能级，这个过程叫激发。发射:以辐射方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。,荧光(fluorescence)跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。,即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止(一般持续lO-7lO-8s)。,二 荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。,1 具备用于标记抗体的荧光素条件(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未 结合的色素及其降解产物易排除。,(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。,(1)异硫氰酸荧光素(FITC)呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子,2 荧光素的种类：,最大吸收光谱：490495nm，最大发射光谱：520530nm。分子量：389.4KD,(2)四乙基罗达明(RB200)褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。,最大吸收光谱:570nm最大发射光谱:596600nm分子量：580KD,(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究。最大吸收光谱:550nm 最大发射光谱:620nm(4)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）-蓝色荧光(5)得克萨斯红（Texas red）(6)藻红素R(7)花青（Cyanine,Cy2绿色,Cy3红色,Cy5）,三、荧光素标记抗体的方法(一)FITC标记抗体的方法1 Marsshall法(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个。,荧光素FITC-NC N-蛋白质 FITC-N C N-蛋白质 S H H H S H,(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液）碳酸盐缓冲液为总量的1/10。荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC,结合（标记）：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4 透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4 过柱：葡萄糖凝胶G50或 G25柱 分离游离荧光素保存 4-40等量甘油分装保存。2 Chadwick法3 改良法4 透析标记法,四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1 特异性染色效价测定-与相应抗原标本染色 直接染色：倍比稀释荧光抗体1:2，1:4,1:8,“+”的最大稀释度为染色滴度，实际染色可取低1-2稀释度，如染色滴度1:64，实际为1:32或1:16；间接染色：“+”的最大稀释度为染色滴度。2 非特异性染色测定-与相类似抗原标本染色3 吸收试验-在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原阳性 标本染色，结果无明显阳性荧光。4 F/P比值的测定方法F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，F/P=1-2，过高-非特异染色增强；过低-荧光很弱，降低敏感性。,荧光抗体的保存,0-4或-20低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性；加入防腐剂：硫柳汞或叠氮钠；小量分装；真空干燥后更易长期保存。,1 直接法（1）基本原理 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较低,五、荧光抗体染色方法适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定；方法：直接法、间接法、补体法,（2）器材 荧光显微镜，恒冷箱切片机，剪刀，镊子，载玻片。（3）材料和试剂 FITCsIg；0.01MPBS(Ph7.2)；100%丙酮；甘油缓冲液。（4）操作步骤 1）恒冷箱切片，厚5m，风吹干燥30min。2）100冷丙酮固定lOmin。3）0.01M PBS漂洗3次，5min/次。4）滴加1：50100的FITCsIg，室温或37湿盒内染色30min。5）0.01M PBS漂洗3次，5min/次。6）封片，镜检。7）阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。（5）结果 荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光部分为阳性细胞。,2 间接法（1）基本原理先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自身抗体和感染病人血清的检验。缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。,（2）操作步骤：1）切片或涂片固定后，置于染色湿盒内；2）滴加未标记的特异性抗原作用切片于37，30min；3）PBS漂洗3次，5min/次；4）滴加FITCsIg再作用切片于37，30min；5）PBS漂洗3次，5min/次。6）缓冲甘油封固，镜检。7）封片，阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。,结果 黄绿色荧光处即阳性细胞分布部位。,3 补体法用特异性抗体和补体混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用荧光标记的抗补体的抗体与补体结合，从而形成抗原抗体补体抗补体荧光复合物。荧光显微镜下所见阳性荧光即为抗原所在部位。特点：很敏感，且不受特异性抗体种属的限制，适用于各种动物抗体的检查方法。方法：,1）涂片或冰冻切片固定，PBS水洗；2）滴加免疫血清和补体等量混合液，37，30min；3）PBS洗涤；4）滴加抗补体荧光抗体37，30min；5）水洗，缓冲甘油封固。适用：肾穿刺组织活检诊断等；形态小的立克体、病毒颗粒或低浓度抗原。,4 双重免疫荧光染色法适用：在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。方法：如A抗原的抗体-FITC 标记，B抗原的抗体-RB200标记。,(1)一步双染法 将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)；直接法进行染色反应。(2)二步双染法 先用RB200标记的B抗体,不必洗去；再用FITC标记的A抗体染色；按间接法进行。结果：A抗原呈黄绿色荧光；B抗原呈桔红色荧光。,5 膜抗原荧光抗体染色方法,原理和步骤：直接法或间接法；适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。结果：阳性荧光主要在细胞膜上。6 荧光抗体再染色法荧光抗原染色法抗原用荧光素标记，少用。,六、荧光显微镜检查方法1 荧光显微镜 超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。,（1）光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过515min，球内气压升至5070标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。（2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他中性滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。,荧光显微镜的滤片系统,2 标本制作要求(1)载玻片厚度应在0.61.2mm之间（有时需石英玻璃载玻片)(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右（有时需干涉盖玻片)(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发光；细胞重叠或杂质掩盖易非特异着色。(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂（室温过夜，待气泡消失可使用)。,荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸馏水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5)24ml,混合加热溶解，5000g离心，15min，最后加入DABcos，终浓度2.5，溶解后，分装存于-20中。(5)镜油:无荧光；可用甘油、液体石蜡替代。,3 使用荧光显微镜注意事项(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序；(2)应在暗室中进行检查。汞灯点燃5-15min，光源稳定后观察；(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜；(4)检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱；标本在紫外线照射3-5min后，荧光减弱；最多不超2-3h;,(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源；(6)标本染色后应立即观察。(7)荧光高度的判断标准，分四级“”为阴性，“”为仅能见明确可见的荧光；“”为可见有明亮的荧光；“”为可见耀眼的荧光。,4 荧光图像的记录方法,荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度荧光显微镜摄影：基本同普通显微镜摄影技术 高速感光胶片如ASA200以上或24 以上 半自动或全自动显微摄影系统装置，或CCD与计算机联接，将图像存在软盘上缺点：紫外光对荧光猝灭作用大（如FITC标记物，紫外光照射30s，荧光亮度降低50%），曝光速度要求高。,七、非特异性染色的产生及消除方法产生的原因：（1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。（4）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。（6）荧光素不纯，标本固定不当等。,非特异性染色的消除方法1 动物脏器粉末吸收法：常用：肝粉（猪、鼠）、骨髓粉、鼠脑粉、鸡胚粉 原理：对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特异着色 方法：每毫升荧光抗体中加入肝粉50-100mg混匀4过夜离 心取上清临用前加入荧光抗体进行吸收2 透析法 原理：荧光素如FITC分子可通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可 将未结合的荧光素透析除去。方法：将标记完毕的荧光蛋白液装入透析袋 浸入pH7.2-7.4的PBS中，4，每日更换3-4次PBS，约5-7天，透析液无荧光即可（荧光光源照射）,3 葡聚糖G-50柱层析法目的：除去游离荧光素方法：加入荧光抗体15-18ml-即将入柱时加PBS-关闭下口30-40min-游离荧光素进入分子筛孔氏加入洗脱液-荧光抗体向下移行并与游离荧光素拉开距离-荧光抗体流出-前、中、后三部分收集，测F/P比值，合并、浓缩、分装-继续加入洗脱液，直至洗脱液中无蛋白和荧光素止。,4 DEAE纤维素柱层析法 去除标记过多或过少荧光素的抗体分子5 荧光抗体稀释法6 纯化抗原方法7 纯化抗体方法8 伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝+0.01mol/LPH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色呈红色荧光，与特异性荧光成对比，减少非特异性荧光，宜作常规应用。9 胰酶消化或10%牛血清蛋白封闭,八、免疫荧光细胞化学的对照染色 为了排除某些非特异性染色，保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，必须在初次试验时进行以上对照试验，从而检测抗原与抗体的结合是否是特异的。常用对照如下：阳性对照 阴性对照 自发荧光对照,1 阳性对照用已知存在某相应抗原组织标本染色，结果为阳性2 阴性对照(1)吸收实验 用已知的相应抗原与标记的抗体反应，然后离心除去反应物，再用吸收过荧光抗体的液体与标本内抗原反应，结果应为阴性。,(2)抑制实验 用未标记荧光素的抗体与标本内相应靶抗原反应，然后再加入用荧光素标记的相同抗体进行染色反应，结果应为阴性。,二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体。一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色。效果较二步法好，并且简便。,(3)抗原对照 用确知不存在某相应抗原的标本染色。(4)抗体对照 用与特异性抗体种属相同的动物正常血清或同一动物免疫前血清标记荧光素代替免疫血清。3 自发荧光对照 标本只加PBS或不加PBS。,结 束,九、激光扫描共聚焦显微镜 LSCM 是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。,实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面的观察进行到立体，断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用。,1 仪器构成(1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。(2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。(5)XY平台(6)Z-轴步进马达,2 共聚焦成像原理 激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发出沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。,3 光信号接收和成像方式(1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：由光电倍增管（PMT）把光信号转变成电信号；利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。(2)成像方式 载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成像时间长；反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。,4 参数的选择基本参数：Confocal,pinhole,detector,PMT,Stepsize,X points,Y Points,scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom,Display,BRsubval,Samples/pt等,5 性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描速度快，扫描范围大，图像存取方便，可进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。,