实验一外周血淋巴细胞的分离课件.ppt
实验一外周血淋巴细胞的分离,PBMC:peripherial blood mononuclear cell(T cell,B cell and monocyte),原 理,外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。,原 理,外周血,红细胞,粒细胞,单个核细胞,血小板,淋巴细胞,单核细胞,1.093,1.0301.035,1.0751.090,Ficoll：1.0770.001,(PBMC),1.092,1500rpm,20,30min,PBMC,红细胞粒细胞,Ficoll,稀释外周血,Ficoll,稀释的血浆、血小板,实验步骤,1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）,实验步骤,3.18，1500r/min，离心30min4.轻轻吸取PBMC层移入另一试管中5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心5min，弃上清。,注意事项,每毫升外周血液大约可获1106单个核细胞 Ficoll应适量，外周血应充分稀释 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染,细胞计数,1、准备计数板：2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4、计数：在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数,实验步骤,5、计算：细胞数/毫升=（4大格细胞数之和/4）104,注意事项,1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数,Enzyme-linked immunoabsobant assays(ELISA),酶联免疫吸附试验,原理:antigen+antibody必需条件:specificity visibility,Ag-Ab complex,使用抗体的诊断检测技术,目的原理,本法是指用酶标记抗体进行抗原抗体反应，从而将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断实验结果，可经酶标测定仪作定量分析，灵敏度可达微微克（pg）水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP），它们与抗体结合不影响抗体活性，这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。,酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA），简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术。基本的方法有三类，即间接法、双抗夹心法和抗原竞争法。,Enzyme-linked immunoabsobant assays,双抗夹心法,1st Ab,substrates,Colored products,Enzyme,2nd Ab,Ag,1st Ab,capture antibody,labeled/detective Ab,实验步骤,1.包被：取羊抗鼠IgG包被单抗20ug,用0.01M Tris-HCl稀释至10ml,加入96孔板中,每孔100ul,4过夜；2.封闭：用洗涤液(含0.01%Tween-20的0.01M PBS)洗涤两次,然后加入封闭液(含15%小牛血清的0.01M PBS),每孔300ul,37,孵育2h；3.加样品：洗涤两次,加入标准品鼠IgG 1ug/ml,每孔100ul,37,孵育2h；4.加羊抗鼠IgG-Fc-HRP:洗涤两次,加羊抗鼠IgG-Fc-HRP每孔100ul(5ug/ml),37孵育1h；,5.加底物显色：洗涤两次，加底物OPD反应液每孔100ul，置于室温510min；6.终止：加终止液2M H2SO4 50ul每孔；7.检测及绘制标准曲线：于490nm处检测OD值，标准曲线的斜率：bXY/X2,标准曲线YbX(其中，X：浓度（标准品）；Y：比色OD值的均值)。.绘制标准曲线后，通过各孔的OD值在标准曲线上相应位置计算出相应浓度,实验目的,1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。,B淋巴细胞杂交,实验四,杂交瘤的目的-制备单克隆抗体,杂交瘤技术的基本原理具有分泌抗体功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞.（Hybridoma）该细胞的特点：,选择动物The mouse is usually the animal of choice.Suitable mouse myeloma cell lines are widely available,and grown of hybridomas in mice is usually no problem.All of the currently available mouse myeloma lines,which are suitable for fusion,are of BALB/C origin,6-8 week,female mouse is usually used.,1wk 抗原50g/只，溶于300l 生理盐水中，加入等量福氏完全 佐剂（CFA）充分乳化，分颈、部皮下多点及腹腔注射；3wk 抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐改为半佐（IFA）；5wk 抗原50g/只，溶于300l 生理盐水中，腹腔注射；加强 融合前35天，抗原2030g/只，溶于50l 生理盐水中 小鼠尾静脉注射以加强免疫（抗原冲击）,动物免疫,一、可溶性抗原,1wk 细胞数量8106/只，洗涤三遍，用0.30.4ml的生理 盐水重悬，腹腔注射；3wk 细胞数量6106/只，细胞的预处理及注射的部位同上；5wk 细胞数量5106/只，细胞的预处理及注射的部位同上；加强 融合前的45天，细胞数量3106/只，加强免疫 在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿瘤而死亡，故用丝裂霉素（MMC）处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经MMC处理。,二、细胞抗原,动物免疫,PEG：亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞融合。分子量：1500-2000,融合剂,HAT:次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶（thymidine,T）,细胞的DNA生物合成有两条途径：,HAT选择性培养,TK,H、T,HGPRT,脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞类型,未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体：其DNA合成的主要途径被A阻断后，由于缺乏HGPRT而不能利用培养液中的H，虽TK可利用T，但不能完成完整的DNA合成过程；未发生融合的脾细胞及其同核融合体：培养液中不能长期生长，7天左右即死亡脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能在HAT选择培养液中生存下来。,处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取1ml细胞悬液（约5106细胞）,与骨髓瘤细胞SP2/0（5105细胞）混合，离心后弃上清骨髓瘤细胞:脾细胞为1:10一个脾脏可获约108个细胞,实验步骤：免疫脾细胞的制备,1、取 PEG溶液1.0ml 缓慢加入混合细胞中,边加边搅拌；2、静止1分钟；3、加HAT培养基4ml；4、取融合细胞悬液1ml,滴加在96孔培养板中，每孔1滴（约50l）；5、显微镜下观察融合细胞的状态,实验步骤：细胞的融合,实验目的：1、了解细胞杂交及单抗制备的基本原理；2、掌握细胞融合的基本操作。,实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的 剪刀、镊子、试管及培养板等冲洗干净，放回原 处，谢谢合作！,免疫学实验2-免疫荧光技术,原理:antigen+antibody必需条件:specificity visibility,Ag-Ab complex,使用抗体的诊断检测技术,一、原理 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）-将抗体（或抗原）经荧光素标记，然后再与相应的抗原（或抗体）结合，在一定波长光波的照射下，被标记的荧光素放出可见光（称为荧光），借助荧光显微镜或流式细胞仪可对待测抗体或抗原进行定性和定量分析。,目前用于免疫荧光分析的荧光素,异硫氢酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC)；藻红蛋白（R-PE）,由于这些荧光素经激发光照射后可发射出不同波长的荧光，因而可对细胞的一种或多种蛋白进行示踪。免疫荧光技术主要用于分析的标本有：外周血新鲜细胞、培养细胞、组织切片等,二、用于抗原分析的免疫荧光法 1、直接法-将荧光素标记在单抗后直接对抗原进行分析的方法；,第一抗体,激发,检测相应抗原,2、间接法-将荧光素标记在第二抗体(抗抗体，通常为抗鼠Ig)的分析方法。,第一抗体（鼠抗人）,第二抗体（羊抗鼠）,特异性高、敏感性低,特异性低敏感性高,直接免疫荧光染色,1.取分离好的待测细胞，调整细胞浓度到1106/50l每管；2.再加10l FITC标记的鼠抗人CD40单克隆抗体（1g），震荡使之充分混匀，同时设阴性对照管，加入10l PBS或Hanks；3.置于430分钟，每10分钟混匀；4.加入2ml PBS（含2%FCS）混匀，1500rpm/5min,4离心，弃上清；5.重复步骤4；6.加入0.5ml PBS，上荧光显微镜观察。,Principle of flow cytometry,实验目的 通过此实验，初步掌握免疫荧光技术的原理、一般操作步骤及结果的观察方法。,
