拟南芥原生质体转化.docx

拟南芥原生质体转化2.2.7 拟南芥原生质体制备 制备酶解液10 ml 1取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。 2材料侵入10 ml酶解液中，暗培养3 h-4 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。 3酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。 4使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。 5100×g，4，离心2 min，收集原生质体。 6重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，。 7重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。 8100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积MMg中。 9取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4保存一周内使用。 2.2.8 原生质体转化 1在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl，大小在5 Kb之内)，100 µl原生质体，充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。 2上述混合物室温放置10-30 min。 3反应结束后加入440 µl W5液体培养基，充分混匀。 4100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。 5加入500 µl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，。 6重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24黑暗培养。 7取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。 2. 酶解液10ml 在一个10ml试管中分别加入下列组分 Cellulase R10 0.15 g Macerozyme R10 0.04 g 200mM MES pH5.7 1 ml 200mM KCl 1 ml D- Mannitol 0.728 g 1 M CaCl2 100 µl 加ddH2O至 10 ml Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的 能买到sigma 最好了，其他药品都是sigma 3. W5培养基 50 ml 在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分 2M NaCl 3.85 ml 200mM KCl 1.25 ml 200mM MES 0.5 ml 1M CaCl2 6.25 ml 加ddH2O至 50 ml 4. MMg培养基 10 ml 在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分 D-Mannitol 0.728 g 150mM MgCl2 1 ml 200mM MES pH5.7 200 µl 加ddH2O至 10 ml 5. PEG/Ca2+溶液 在一个10 ml离心管中分别加入下列组分 PEG4000 4 g D-Mannitol 0.364 g 1M CaCl2 1 ml 加ddH2O至 10 ml