流式细胞仪BD-FACSCanto-II课件.ppt
总览,流式细胞术基本知识 流式细胞仪的组成 数据采集与分析,流式细胞技术是什么？,流式细胞术在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞，微生物,Flow CytometryFlow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement,流式细胞术检测样本,0.4um,40um,流式细胞术检测指标,流式细胞术提供的信息：-相对细胞大小-相对细胞颗粒密度和内部复杂度-染色过细胞的相对荧光强度,细胞结构细胞大小细胞粒度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡,在上述信号基础上的细胞分选,流式细胞术的应用,流式细胞仪组成,液流系统：形成层流系统，聚焦细胞光学系统：产生和收集光学信号电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理,Fluidics Diagram,Sheath Flow,sheath tank,Sample Flow,sheathinterior reservoir,wasteinterior reservoir,sheath filter,sample injection,tube(SIT),test tubeor plate,flow cell,interrogation point,bubble filter,waste tank,液流系统,光学系统,激发光学系统包括:-激光器-透镜和反射镜，将激光引导到检测区域收集光学系统包括:滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器,光学系统,光学系统-滤光片,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,LongpassShortpassBandpass,电子系统,电子系统,电子系统,Review,悬浮状态的细胞单个流过流动室细胞被激发产生散射光和荧光 信号信号被采集转换成数字信号存储于电脑上,液流系统,光学系统,电子系统,回顾,流式细胞仪的三大组成部分？滤光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？,数据采集,三种数据：-前向散射光FSC-侧向散射光SSC-各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4,当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的,数据采集-前向散射光,当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生，可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密切相关,数据采集-侧向散射光,外周全血细胞散射光双参数点图,颗粒杂质、气泡对检测的影响,细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的,数据采集-荧光信号,荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关,数据采集,电压,信号放大方式：log、lin信号类型：A,W,H电压的调节:根据阴性对照管来调节,阈值,可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值大多数样本都可以设定FSC/SSC阈值以下的信号不存储根据阴性对照管来调节目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号,补偿,补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动补偿。补偿的调节:根据单染对照管来调节,1.)Compensation-Too Little;Too Much,2.)Basic Principles of Compensation-%Compensation is independent of fluorescence intensity,3.)Compensation-Too Dim,Too Bright Compensation Controls,Small errors in compensation of a dim control(A)can result in large compensation errors with bright reagents(B&C).,数据分析,流式数据直方图散点图等高线图密度图三维图统计数据,直方图,直方图(Distribution Histogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。,散点图,散点图(Dot Plot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,等高线图和密度图,三维图,统计数据,Events百分比平均荧光强度荧光中位值CVSD,数据获取与分析,电压阈值补偿,获得数据,画图设门统计,精品课件！,精品课件！,Thanks!,
