星点设计效应面法优化槐花米中总黄酮提取工艺毕业论文.doc

毕业设计（论文）题 目 星点设计-效应面法优化槐花米 中总黄酮提取工艺学院(部) 生物产业学院 专 业 学生姓名 学 号 20061 年级2006级 指导教师 职称 2010 年 6 月 5 日星点设计-效应面法优化槐花米中总黄酮提取工艺摘要： 目的：建立采用碱水冷浸法从槐米中提取总黄酮的优化工艺。方法：首先采用单因素法确定因素水平范围，再以料液比、浸提时间、提取pH值为考察因素，以产量和纯度为指标，应用星点设计效应面优化法优化工艺。结果：总黄酮的最佳提取工艺为pH12.0，料液比25，提取时间10 h。结论：优化的提取工艺简单易行，未使用有机溶剂，能耗低，可为工业化生产提供参考。关键词：星点设计- 效应面法；总黄酮；含量测定;提取工艺; 槐米Optimization of the Extraction of Flavanoid from Buds by Central Composite Designresponse Surface MethodologyAbstract: objective: Found the optimization process of extracted flavonoids from bud by soaked formulation alkaline. Method: First, the single factor method to determine the scope of factor levels, and then to liquid ratio, extraction time, extraction pH values investigated factors to yield and purity index, application design - response surface methodology optimization process.Result:The optimum extraction of total flavonoids was pH12.0, liquid ratio of 25, extraction time 10 h.Conclusion:Optimizing the extraction process is simple, does not use organic solvents, low energy consumption, can provide a reference for industrial production.Key words: Central composite design - response surface methodology ; Flavanoid; Content determinationg; Extraction technology; Bud目 录绪论11.材料与设备2 1.1实验材料21.2实验仪器22.方法与结果 32.1提取工艺3 2.2芦丁含量测定32.2.1 色谱条件32.2.2 测定方法3 2.3总黄酮含量测定32.3.1 对照品溶液的制备32.3.2 供试品溶液的制备32.3.3含量检测方法32.3.4 空白干扰试验42.3.5 线性关系考察42.3.6 稳定性试验2.3.7 重现性实验2.3.8 加样回收率实验 2.4 单因素试验确定因素水平范围2.5星点优化试验2.5.1方案设计及安排2.5.2 实验结果、模型拟合及预测2.5.3 最佳取值范围的预测2.5.4 验证实验.3讨论4 结论.致谢参考文献绪论总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。 近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有：抗炎症、抗过敏、抑制细菌、抑制寄生虫、抑制病毒、防治肝病、防治血管疾病、防治血管栓塞、防治心与脑血管疾病、抗肿瘤、抗化学毒物等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老1。槐米是自然界中含黄酮类成分最高的植物，含芸香甙-芦丁、三萜皂甙、白桦脂醇、槐花二醇、葡萄糖、葡萄糖酸醛等不同的黄酮类化合物,国外每年从我国进口大量槐米用于保健品研发,目前槐米的研究备受关注2。目前从槐米中提取总黄酮主要有碱水热提法，主要操作：称取20克槐花米粉末，加约120ml的水和15克硼砂，煮沸，在搅拌下，缓缓加入石灰乳使溶液的pH=89，保持此pH值的条件下，微沸293O分钟，随时补充失去的水分，趁热抽滤，药渣加80毫升水，同法再提取一次；乙醇提取法：称取5克槐花粉末，加入1：1012的食用酒精，在沸腾(7275)的情况下，按不同的提取时间进行加热回流提取、用真空泵进行过滤、分离。所得滤渣同法进行第二、第三次蒸馏提取。由于在强碱性加热环境中，会破坏黄酮类化合物的母核；乙醇提取法第一次的提取率能达到55 以上，随着提取时间的增长，总提取率逐渐增大，但达到一定时间后，提取率反而下降，这可能是在高温的条件下，黄酮类物质分解或氧化造成的。用乙醇进行黄酮类物质的提取，45分钟提取率最高。但用乙醇进行黄酮类物质的提取，对设备要求较高，由于乙醇(或食用酒精)价格较贵，回收率只有70左右，因此费用和成本高3-5。本实验选择以槐花米为原料，使用低能耗的冷浸提取法。与传统的热提法和有机溶剂浸提法相比，本法有效降低了能源消耗和溶剂使用的成本，减少了杂质的浸出，提高了总黄酮的纯度。目前本法未见文献报道。在优化试验设计中，均匀设计和正交设计两种方法存在试验精度不够、建立的数学模型预测性较差等缺点。星点设计效应面法是近来国外工艺优化常用的一种方法，具有试验次数少,精确度高,应用方便的特点6。本文选用星点设计效应面法，建立了总黄酮收率、纯度与工艺参数间的数学模型，由此确定了槐花米中总黄酮提取的优化工艺，大幅度提高了总黄酮的纯度，为规模化总黄酮的生产提供参考。由于在强碱性加热环境中，会破坏黄酮类化合物的母核；乙醇提取法第一次的提取率能达到55 以上，随着提取时间的增长，总提取率逐渐增大，但达到一定时间后，提取率反而下降，这可能是在高温的条件下，黄酮类物质分解或氧化造成的。用乙醇进行黄酮类物质的提取，45分钟提取率最高。但用乙醇进行黄酮类物质的提取，对设备要求较高，由于乙醇(或食用酒精)价格较贵，回收率只有70左右，因此费用和成本高3-5。本实验选择以槐花米为原料，使用低能耗的冷浸提取法。与传统的热提法和有机溶剂浸提法相比，本法有效降低了能源消耗和溶剂使用的成本，减少了杂质的浸出，提高了总黄酮的纯度。目前本法未见文献报道。在优化试验设计中，均匀设计和正交设计两种方法存在试验精度不够、建立的数学模型预测性较差等缺点。星点设计效应面法是近来国外工艺优化常用的一种方法，具有试验次数少,精确度高,应用方便的特点6。本文选用星点设计效应面法，建立了总黄酮收率、纯度与工艺参数间的数学模型，由此确定了槐花米中总黄酮提取的优化工艺，大幅度提高了总黄酮的纯度，为规模化总黄酮的生产提供参考。一、 材料与设备1.1 实验材料槐花米，购买于成都五块石中药材批发市场；芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所，批号100081-200406)；甲醇(成都科龙化工试剂厂 A.R级)；盐酸(成都科龙化工试剂厂A.R级)；氢氧化钙(成都科龙化工试剂厂A.R级)；氧化钙(成都科龙化工试剂厂A.R级)；硝酸铝（上海市奉贤奉城试剂厂A.R级）；亚硝酸钠（上海市奉贤奉城试剂厂A.R级）；四硼酸钠(天津市塘沽鹏达化工厂A.R级)，氢氧化钠 (成都科龙化工试剂厂A.R级)偏重亚硫酸钠(天津市塘沽鹏达化工厂A.R级)1.2 实验仪器pHS-25型酸度计（成都方舟科技开发公司）；WHJ7200型可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；BP121S型电子天平；DB-210SCB电热鼓风干燥箱（成都天宇实验设备有限责任公司）；BCD-216YH型海尔冰箱；二、方法与结果2.1 提取工艺取干燥槐花米，粉碎，过4号筛，取10g，加入稳定剂0.15g硼砂与0.3g偏重亚硫酸钠，加一定比例的澄清石灰水，石灰乳调节pH值至规定值，室温避光放置一定时间，抽滤，取上清液，用盐酸调pH值至4，4冰箱中冷藏静置过夜，抽滤，得黄色沉淀，用水洗涤沉淀至中性，置4050鼓风干燥箱中干燥至恒重。2.2 芦丁含量测定2.2.1 色谱条件高效液相系统：TD680 DIONEX色谱柱：C18（100A，250×4.6mm pc1025）流动相：甲醇0.1%醋酸水溶液（1:1）进样量：20uL流速：1mL/min波长：257nm2.2.2测定法取芦丁对照品约10mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1mL，置50mL量瓶中，加甲醇5mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取芦丁样品约10mg，同法制备供试品溶液。精密量取对照品溶液与供试品溶液各20L，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，按外标法计算含量。2.3 总黄酮含量测定2.3.1 对照品溶液的制备精密称取在120干燥至恒重的芦丁对照品0.0115g，置50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声2分钟，放冷，加入甲醇至刻度，摇匀，即得。2.3.2 供试品溶液的制备精密称取按提取工艺制备的供试品12mg，置10mL容量瓶中，加甲醇适量，超声2分钟，放冷，加入无水甲醇至刻度，摇匀，即得。2.3.3含量检测方法精密量取供试品溶液1mL，对照品溶液0mL、1mL分别置25mL容量瓶中，同时各加水至6.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加10%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以加入0mL对照品为空白，在500nm波长处测定吸光度，计算供试品总黄酮含量7。2.3.4 空白干扰试验按“2.3.1”项下法制备对照品溶液，分别取1mL蒸馏水、1mL 对照品溶液分别置25mL容量瓶中，同时各加水至6.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加10%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟。以蒸馏水为空白建立基线，在290800nm波长范围内，对上法制备的两个溶液进行扫描，绘制他们的吸收光谱图。(见图1、图2)图1 空白显色溶液扫描图2 总黄酮显色溶液扫描图1、图2可以看出在500nm处总黄酮显色溶液有最大吸收峰而空白显色溶液在500nm处无吸收。说明溶剂对测定无干扰。2.3.5 线性关系考察精密量取对照品溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、与6mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加4%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以加入0mL对照品为空白，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线4。按最小二乘法计算线性回归方程为y=0.0109x-0.0011(r=0.9995)结果表明，以芦丁为标准的总黄酮量在9.255.2g/mL内与吸光度值呈良好的线性关系。（见图3）（数据见表1）表1 标准曲线实验原始数据实验编号1234567加样量（mL）0123456加样浓度（g/mL)09.218.427.636.84655.2吸光度00.1010.2020.2960.3870.510.601回归方程y=0.0109x-0.0011相关系数（r）0.9995 图3 总黄酮含量测定标准曲线2.3.6 稳定性试验取星点设计试验下四号样储备液按“2.2.2”项下方法，在第0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、120分钟分别进行测定，结果RSD=1.07%，表明该检测方法在较长时间内稳定，便于实验操作且实验误差小。（实验数据见表2）表2 不同时间点测得吸光度值实验编号123456T(min)010203060120吸光度值0.5120.5080.5130.5130.5120.4992.3.7 重复性实验取同一批样品6份，按“2.3.3项”下测定总黄酮含量(结果见表3)。可见，方法有较好的重复性。表3 星点设计五号供试品重现性实验实验编号123456RSD总黄酮%79.6580.9479.2881.3077.6379.471.6%2.3.8 加样回收率实验按“2.1”法在星点设计-效应面法优化出的最优提取条件下提取出的样品，同“2.3.1、2.3.2”法制备供试品和对照品溶液。精密称取供试品0.0121g，对照品芦丁0.0117g，分别置于10mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声2分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，即得。从中取1mL供试品溶液，以加入0mL对照品为空白，按“2.2.4”法测出吸光度值。带入线性回归方程计算出供试品浓度。低浓度回收率实验：取0.4mL供试品溶液、0.4mL对照品溶液于同一25mL容量瓶中，加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加4%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以加入0mL对照品为空白，测出吸光度值。带入线性回归方程计算出此混合供试品的总黄酮质量m总。由已知的供试品、对照品浓度可求出加入对照品质量m对及加入供试品质量m供试品，低浓度回收率=（m总-m样）/m对照品计算出低浓度回收率。中浓度回收率实验：取0.5mL供试品溶液、0.5mL对照品溶液于同一25mL容量瓶中，与低浓度回收率实验同法计算出中浓度回收率。高浓度回收率实验：取0.6mL供试品溶液、0.6mL对照品溶液于同一25mL容量瓶中，与低浓度回收率实验同法计算出中浓度回收率。（实验数据见表4）表4 回收率实验数据表实验名称测定量（mg）已知量（mg）加入量（mg）回收率（%）RSD(%)低浓度回收率实验0.9131 0.4680.4478 99.420.68中浓度回收率实验1.1356 0.5850.5598 98.43高浓度回收率实验1.3718 0.7020.6717 99.732.4单因素试验确定因素水平范围由于芦丁是槐米中总黄酮的主要部分，因此预实验采用芦丁的测定作为总黄酮的重要指标来探索实验条件。检测方法采用“2.2”HPLC法测定芦丁含量。本实验主要考察提取液pH值、提取时间、料液比三个因素对提取物产量和纯度的影响，从而确定出这三个因素对提取物产量和纯度存在影响的范围，为星点设计的准确度提供保障。预实验采用单因素实验法，固定提取液pH值、提取时间，改变提取料液比；固定提取时间、提取料液比，改变提取pH；固定提取料液比、提取液pH，改变提取时间，称定提取物质量，检测提取物纯度确定条件的粗略范围。通过实验，由于pH计测定范围的限制，最大pH设定为12，最小pH为9；料液比最大为1：40，增大不能再增加提取物产量，出于经济的目的设定为此值，从产量考虑最小料液比为1：10；最大提取时间为32小时，最短提取时间为4小时。（实验数据见表5）表5 条件探索实验数据提取条件未稀释浓度（mg/mL)芦丁（面积）槲皮素（面积）纯度(%)质量（g）对照品1.2921.36 0.00 100.00 ph9-4 1:20 4h 1.2614.69 0.00 70.43 0.0426 ph14-4 1:20 8h 1.2418.14 0.00 88.35 0.7223 ph9-4 1:10 4h 1.2817.04 0.00 80.41 0.9655 ph9-5 1:20 4h 1.232.51 10.27 12.33 0.1045 ph10-1 1:20 32h1.2414.29 0.00 69.59 0.2395 ph9-3 1:20 4h1.2514.86 1.06 71.82 0.3903 ph14-4 1:20 4h 1.2518.19 0.00 87.89 1.0239 ph9-3.2 1:20 4h 1.2416.71 0.00 81.40 0.7200 标准品1.3319.42 0.54 100.00 ph10-4 1:20 32h 1.2314.93 1.71 83.16 0.5833 ph12-4 1:5 4h 1.2716.65 0.00 89.77 0.3024 ph12-4 1:30 4h1.2316.28 0.00 90.66 1.1186 ph12-4 1:40 4h 1.2819.01 0.00 101.73 1.1291 2.5 星点优化实验2.5.1 方案设计及安排由于提取试验影响较大的因素是料液比，pH值，提取时间和温度等因素，而实验在室温是25左右的条件下进行，所以仅考虑其余三个因素，即料液比、pH值与提取时间，根据预实验的结果选取5个水平的试验参数8（见表6），星点试验设计（见表7）。表6 因素-水平表因素-1.732-1011.732pH（X1）99.610.511.412料液比(X2)1016.32533.740提取时间(X3)49.9182632表7 实验安排表实验号X1X2X31-1-1-12+1-1-13-1+1-14+1+1-15-1-1+16+1-1+17-1+1+18+1+1+19-1.73200101.73200110-1.73201201.73201300-1.73214001.732150002.5.2 实验结果、模型拟合及预测星点设计方案参照“2.1”法进行提取实验，供试品按照“2.3.4”法进行含量测定。（实验结果见表8）表8 黄酮提取实验结果表实验号pH（X1）料液比（X2）提取时间（X3）提取物干重（g）（Y1）总黄酮含量（%）（Y2）19.616.39.91.078793.08211.416.39.91.056192.1239.633.79.90.287071.10411.433.79.91.071492.8659.616.3260.552463.63611.416.3260.688187.3379.633.7260.149058.26811.433.7260.673688.849925180.166263.63101225180.895691.901110.510180.409690.961210.540180.488383.331310.52540.901991.711410.525320.061948.001510.525180.876081.98实验所得数据，采用SPSS15.0统计分析软件进行回归分析，并对回归模型显着性进行检验，确定简化回归模型方程。利用origin6.0软件绘出3D曲面图，分析各因素水平对冷浸提法取总黄酮效果的影响。（1）多元线性回归方程拟合结果Y1 = -0.9684+0.2162X1-0.0087X2-0.02559X3 (r = 0.8249，P = 0.004542)Y2 = 2.838+10.02X1-0.3153X2-1.124X3(r = 0.8664，P = 0.001207)（2）一、二项式方程拟合结果（a）Y1的拟合结果Y1 = -6.690+1.619X1-0.1567X2+0.02378X3-0.08802X12-0.00128X22-0.00132 X32+0.01909X1X2-0.00174X1X3+0.000646X2X3 (r = 0.9112, P = 0.1399)去除P值较大的X3及X1X3项，重新进行拟合，结果为：Y1=-5.593+1.457X1-0.1608X2-0.08183X12-0.00122X22-0.0012X32 +0.01909X1X2+0.000702X2X3 (r = 0.9112, P = 0.02638)（b）Y2的拟合结果Y2 = 132.2+10.87X1-7.3477X2-6.0275X3-1.097X12+0.03025X22-0.05384 X32+0.4725X1X2+0.5773X1X3+0.03106X2X3 (r = 0.9693, P = 0.01439)去除P值较大的X1及X12项，重新进行拟合，以达到简化模型的目的，结果为：Y2=130.6-4.645X23.754X3+0.03725X22-0.04579X32+0.1819X1X2 +0.3333X1X3+0.03106X2X3 (r = 0.9570, P = 0.002709) 可见，Y1、Y2与各因素间的关系采用二项式方程拟合效果更为理想。2.5.3 最佳取值范围的预测由方程可知，X1、X3对指标的影响相对较大，故固定X2为中值，采用origin6.0绘图软件分别绘制Y1与X1、X3及Y2与X1、X3的三维效应面图和等高线图，由图确定Y1与Y2的最佳取值范围(结果见图2-4、2-5和表2-9) 图2-4 Y1与X1、X3的三维效应面图和等高线图图2-5 Y2与X1、X3的三维效应面图和等高线图表2-9 最佳取值范围表因素X1X3Y11112012.5Y211.7512715最后确定的最佳工艺为：pH12.0，料液比25，提取时间10 h，理论产量为1.1075g，总黄酮理论含量为97.97%。2.5.4验证试验为检验预测的可靠性，采用上述最优提取条件进行两组平行实验。精密称取10g已过4号筛的槐米粉，加入稳定剂0.15g硼砂与0.3g偏重亚硫酸钠，加入250mL澄清石灰水，石灰乳调节pH值至12.0，室温避光放置10h，抽滤，取上清液，用盐酸调pH值至4.0，4冰箱中冷藏静置过夜，抽滤，得黄色沉淀，用水洗涤沉淀至中性，置4050鼓风干燥箱中干燥至恒重。称重，并按照“2.3.4”法进行总黄酮含量测定。两组数据分别为产量1.0439g，总黄酮含量99.08%，产量1.0160g，总黄酮含量100.98%。三 讨论验证性试验结果与预测的最佳工艺条件结果有所差距。原因可能为：星点设计的实验在8月份完成，根据实验结果确定了最佳提取条件，而验证实验在9月份完成，温度有较大差异，导致收率的结果与理论预测值相差较大。验证性实验黄酮含量超过100%，是由于作为对照品的纯度达不到100%。试验过程中在调节好pH的澄清石灰水溶液中加入槐米及保护剂后溶液pH值会持续下降，需要每隔几分钟补充一定量的石灰乳，控制pH值在设计试验条件下。本实验表明采用星点设计效应面法获得的模型准确可靠，预测性好，可用于工艺参数的优化。四、 结论本实验中采用的石灰水冷浸提取法从槐米中提取总黄酮得到的总黄酮产率较高，且含有的其他成分非黄酮类成分极少。从工业生产工艺上来看不仅操作简便，溶剂价廉，能耗低，还较大幅度提高了槐米中黄酮的提取率，对工业生产具有一定的参考价值。致谢参考文献1 2 李飞,李秋红，李廷利.槐米有效成分含量测定方法研究进展J.中医药信息，2008,25( 4):19-213 王永宁，卢挺，石玉平，等.槐花中黄酮类物质提取研究J.青海师范大学学报（自然科学版）,2003(4):49-51.4 郭玉，唐国涛，陈淑娴，等.槐花米中芦丁提取方法的比较研究J.中成药,2007, 29(11):1675-1677.5 孟祥颖,郭良,李玉新,等.芦丁的来源、用途及提取纯化方法J.长春中医学院学报.2003, 19 (2) : 61 - 64.6 刘艳杰,项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用J.中国现代应用药学杂志.2007, 24(6): 455-457.7 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