川麦42不同逆境生长情况研究开题报告.doc

XX农业大学本科生毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目不同逆境对川麦42的生理影响选题类型基础型课题来源自选项目学 院专 业化学生物学指导教师职 称姓 名XX年 级2009级学 号1 研究背景及立题依据小麦是单子叶植物，有禾本科的特征：叶脉平行，茎中空有节，穗状花絮，每朵小花无花瓣但有颖片。因此小麦又称为颖花植物。小麦颖片上有芒刺，是区别小麦品种的特点之一。小麦作为一种人类主要的食物来源更是经济来源，在中国也广泛的种植，主要产区为：河北、山西、河南、山东、安徽、湖北、江苏、四川以及陕西。小麦是全世界种植面积最大的粮食作物1，也是人们生活当中必不可少的食物之一，但是各种自然灾害影响着小麦的产量。植物在自然界受到的胁迫并不只有一种，不同胁迫导致小麦生理生化指标的变化也不相同。因此使用单一胁迫处理来评价小麦的抗逆性具有一定的局限性，且各项指标存在着一定的相关性，因此需要检测小麦的抗逆性需要评价其多个胁迫下各项指标参数。四川省有很多小麦品种，其中川麦42是四川省区试以来第一个平均每公顷突破6000KG的小麦新品种，先后通过四川省和国家审定2。该小麦综合了四倍体小麦与节节麦的优良性状，其遗传变异类型丰富，蕴藏丰富的抗病、抗逆、优质和高产基因。为了对川麦42的抗逆性做出鉴定，对小麦在不同的逆境（干旱、低温、盐渍）生理生化指标进行测定。植物在遭受逆境（干旱、盐渍、低温等）胁迫时，其内部会发生一系列的变化，以此来适应各种逆境生理生化的变化可以反映其受环境胁迫的状态和程度3-5。小麦的抗旱性是一个复杂的生物学性状，是多个因素共同作用的结果。有的学者在小麦幼苗期进行抗旱性研究5,7，提出生理生化指标的变化可以作为小麦抗旱性鉴定的依据。干旱作为一种自然灾害严重影响着农业生产，对植物造成多种伤害，包括损伤膜系统及细胞器，破坏正常的物质代谢，改变酶活性，使呼吸作用增强，光合作用增强等6,7。研究干旱对植物的伤害机制有助于进一步了解植物的抗旱适应性机理，从而可为物种选育与栽培，以及新品种的推广种植提供科学依据。干旱胁迫会导致植物产生大量的活性氧（·ROS），过量的·ROS的清除对于维持植物正常的功能具有重要意义。因此测定植物抗氧能力可以了解植物防御体系受干旱影响的状况。盐渍是世界范围内影响农作物产量的非生物胁迫因子之一8，开展小麦耐盐生理的研究和实践，已经引起人们的广泛重视，耐盐性已经成为我国小麦生产有关研究的重要课题。国内外的小麦育种、栽培和生理学家们在小麦耐盐性方面做了大量工作，如对氯化钠胁迫下小麦品种对钾吸收运输的选择性、幼苗叶片细胞中绳头调节的积累及抗氧化物酶活性的变化、氯化钠胁迫对小麦光合作用的影响等。氯化钠胁迫下小麦减产的主要原因是出苗难，植株生长变缓，最终影响产量9,10。低温寒害也是农业生产中造成严重损失的自然灾害一，会对包括小麦在内的许多作物的产量造成巨大的损失11,12，关于冬小麦研究已经有不少报道13，植物的抗寒性与活性氧代谢关系密切，低温胁迫下植物体内产生大量的H2O2、O2-、OH等活性氧自由基，这些活性氧能造成膜脂过氧化，进而造成膜系统的损伤。植物体内存在着一系列酶促的和非酶促的抗氧化剂以清除活性氧自由基，保护植物细胞免受活性氧的伤害，维持膜系统的稳定性，以增强植株的抗寒性14。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶体（POD）、过氧化氢酶（CAT）被认为是清除活性氧过程中最主要的抗氧化酶类，使植物在一定程度上忍耐、减缓或者抵抗低温胁迫。小麦经过低温胁迫后会发生一系列的变化，其中一些指标，如超氧化物歧化酶的活性及丙二醛的含量可以作为小麦抗冻性的生理生化指标14。低温胁迫下植物可积累更多的可溶性糖、可溶性蛋白质。叶绿素是植物进行光合作用的重要物质。植物体的碳素营养中主要是可溶性糖和淀粉，它们在营养中的作用无法替代（如合成细胞壁、转换合成其他有机物等）。丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，丙二醛的产生数量多少能代表细胞膜脂过氧化的程度，可以间接反映植物组织抗氧化能力的大小。高等植物在逆境下脯氨酸的含量也引起了人们的广泛重视。因此可以通过测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT）酶活性，可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛、叶绿素及脯氨酸的含量，以此来衡量小麦的抗逆性。2 研究的主要内容与预期目标选取萌发一致的川麦42种子植于消过毒的石英砂中，置于25±1 、12 h / 12h光/暗周期、中等光强（光流密度100 mol m-2 s-1）的恒温室中培养，待长直三叶期，选取长势相似小麦幼苗进行不同的胁迫处理（盐胁迫、干旱胁、低温胁迫）24 h和72 h，对胁迫前后小麦中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶体（POD）、过氧化氢酶（CAT）、可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖、丙二醛、叶绿素含量进行测定，通过对实验数据的分析从而对小麦抗旱性、抗旱性及耐盐性做出评价，并对小麦的抗逆性研究提供依据。3 研究方案3.1 实验流程种子萌发移植入石英砂盐胁迫干旱胁迫【哦低温胁迫空白萌发后测量分析培植至三叶期3.2 实验仪器与材料3.2.1 仪器分管光度计，电子天平，研钵，容量瓶，烧杯，恒温水浴锅，试管，离心机，漏斗。3.2.2 试剂95%乙醇，丙酮，氮蓝四唑（NBT），硫代巴比妥（TBA），三氯乙酸，冰乙酸，甲苯，茚三酮，考马斯亮蓝G-250，蒽酮，浓硫酸，牛血清蛋白，L-脯氨酸，葡萄糖，磷酸缓冲液（以上溶液均为分析纯）3.2.3 材料川麦42（来自四川省农科院）3.3 实验方法3.3.1 样品的预处理将生长到3叶期的川麦42幼苗，洗净根部营养液，分别进行盐渍胁迫（0.3 mol/L氯化钠溶液）、干旱胁迫（20% PEG6000）、低温胁迫培养（4 ），以上胁迫处理均设两组分别标注为1天和3天。待胁迫处理完毕之后根据测定项目采样3.3.2 叶绿素的测定称取小麦叶片0.2 g剪碎置于研钵中，加少许CaCO3，石英砂、95%乙醇（AR）丙酮（AR）1:1充分研磨，过滤，将滤液移入25 mL容量瓶，用95%乙醇（AR）丙酮（AR）1:1反复洗涤残渣、滤纸至无绿色，合并滤液，定容。取上述提取液1 mL稀释至10 mL，摇匀。用95%乙醇（AR）丙酮（AR）1:1为参照，在分光光度计665 / 649 nm下测其光密度。Chla含量（mg/g）=(13.95D6656.88D649)×V/(W×1000)Chlb含量（mg/g）=（24.96D6497.32D665）×V/(W×1000)3.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）的测定3.3.3.1 酶液制备取小麦叶片(去叶脉) 0.5 g于预冷的研钵中，加1 mL磷酸缓冲液在冰浴下研磨成匀浆，倒入10 mL刻度试管中，加缓冲液定容为5 mL。取2 mL于离心管离心20 min，上清液即为SOD粗提液。3.3.3.2 酶活力测定：用NBT光还原法15。每个样品取8个洁净干燥的微烧杯(透明度好)编号，按表加入各试剂，反应系统总体积为3 mL。其中48号管中磷酸缓冲液和酶液的加入量依样品中的酶活性进行调整，如果酶活性强时，可适当减少酶液用量。试剂全部加入后混匀，将1号杯置于暗处，其余各杯均于25 、4000 lx日光灯下反应20 min，各管受光情况要一致。温度高时，时间缩短；温度低时，时间延长，然后立即遮光停止反应。反应中各试剂用量如下表所示：130 mmol/LMet（mL）750 mol/LNBT（mL）100 mol/LEDTA二钠（mL）20 mol/L核黄素（mL）酶液(L)蒸馏水(mL)123456780.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30005101520251.81.81.81.7951.791.7851.781.775在560 nm波长下，以1号杯调零，测定其余各杯反应体系的光密度。以2、3号杯吸光度的平均值作为还原率的100，分别计算不同酶液量抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以NBT光化还原的抑制率()为纵坐标绘制二者相关曲线，NBT光化还原被抑制50的酶液量为一个酶活单位。SOD总活性U/g= SOD比活性U/mg=3.3.4 过氧化物酶体（POD）的测定3.3.4.1 酶液制备称取新鲜小麦叶片0.1 g，剪碎，放入预冷的研钵中，加入适量预冷的磷酸缓冲液冰浴研磨成匀浆。残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，合并两次匀浆液，以4000 r/min低温离心15 min，上清液即为粗酶液，定容至25 mL，酶液贮于低温下备用。3.3.4.2 酶活力测定：采用愈创木酚法测定15取2支试管，于1支中加入反应混合液3 mL。和磷酸缓冲液1 mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL，和上述酶液1 mL。(如酶活性过高可稀释之)。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒人比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm处测定光密度，每隔30 s读数一次。3.3.5 过氧化氢酶（CAT）的测定3.3.5.1 酶液制备称剪碎混匀的小麦叶片1.00 g置于预冷的研钵中，加适量磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆，转移至25 mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次(每次l-2 mL)，合并冲洗液于容量瓶中，定容至25 mL，摇匀。取提取液5 mL于离心管中，在4 、15000 r/min下离心15 min，上清液即为酶提取液，4 下保存备用。3.3.5.2 CAT活性的测定：采用紫外分光光度法15 取10 mL具塞试管，加2 mL酶提取液于沸水浴中加热煮致失活，冷却备用。取10 mL试管4支，3支为测定(3个重复)，1支为对照，按下表加入试剂。1234Tris-HCl酶提取液蒸馏水1.00.11.71.00.11.71.00.11.71.00.1（高温失活）1.7将上述4支试管于25 水浴中预热3 min后，逐管加入0.2 mL 100 mmol/L H2O2溶液，每加一管立即在紫外分光光度计上测定A240(蒸馏水调零)，每隔30 s读数一次，共测4 min，记录4支试管的测定值。3.3.6 总蛋白含量的测定3.3.6.1 可溶性蛋白质的提取取0.750 g小麦幼苗叶片，放入研钵，加10 mL蒸馏水在冰浴中研成匀浆，再在4000 r/min离心10 min，将上清液倒入10 mL容量瓶，再向残渣中加4 mL蒸馏水，悬浮，4000 r/min离心10 min并合并上清液，定容至刻度。3.3.6.2蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝G-250法测定16标准曲线的制作取6支试管，编号，按下表加入试剂。123456蛋白质标准溶液/mL蒸馏水/mL考马斯亮蓝试剂/mL蛋白质含量/g 01.0500.20.85200.40.65400.60.45600.80.25801.005100混匀，各管震荡程度应该尽量一致。放置10 min，在595 nm波长下比色测定，比色应在1 h内完成。以牛血清蛋白含量(g)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。样品中蛋白质含量的测定另取2根试管，分别准确加入0.1 mL样品提取液，0.9 mL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝G-250试剂,其余操作与标准曲线绘制相同，测其吸光值。3.3.7 脯氨酸含量的测定3.3.7.1 脯氨酸提取取0.050.5 g小麦叶片，用3磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸的最终体积为5 mL。匀浆液转入玻璃离心管中，在沸水浴中浸提10 min。冷却后，以3000 r/min，离心10 min，取上清液待测。3.3.7.2 脯氨酸标准曲线的制作及样品的测定：采用茚三酮比色法15脯氨酸标准曲线的制作及样品的测定：取7个25 mL容量瓶编号17，分别加入0 mL、05 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL和3.0 mL脯氨酸标准溶液水定容到25 mL。取8支具塞试管，分别编号1-8号，1-7号取上述容量瓶的脯氨酸液，8号为样品测定管。按下表操作：1.2345678脯氨酸标准液、样液（mL）水（mL）冰乙酸（mL）茚三酮（mL）脯氨酸浓度（g/mL）02220202222022420226202282022102022122022X上述8支管沸水浴30 min后冷却至室温，各加4 mL甲苯，萃取0.5 min后静置，分层后用注射器吸取上层红色溶液，520 nm波长下读A值，制作标准曲线，并查出X值。计算公式：脯氨酸含量（）=3.3.8 可溶性糖的测定3.3.8.1 可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10-0.30 g，共3份，分别放人3支刻度试管中，加入5-10 mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)，提取液过滤人25 mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3.3.8.2 标准曲线的制作取20 mL刻度试管6支，从0-5分别编号，按下表加入标葡萄糖溶液，然后按顺序向试管内加人试剂，充分振荡，立即将试管放人沸水浴中，逐管准确保温l min，取出后自然冷却至室温，以空白作对照，在625 nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。012345100g/mL葡萄糖溶液蒸馏水蒽酮试剂蔗糖含量(g/管）01500.20.85200.40.65400.60.45600.80.25801.0051003.3.8.3显色及数据处理显色测定吸取样品提取液0.5 mL于20 mL刻度试管中(重复两次)，加蒸馏水1.5 mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度A625。对照曲线求的未知溶液的可溶性糖含量。可溶性糖的含量(%)=3.3.9 丙二醛含量的测定3.3.9.1 样品提取取叶片1 g将其剪碎，加入10%三氯乙酸(TCA)2 mL和少量石英砂，研磨；进一步加入8 mL TCA充分研磨，匀浆液以4000 r/min离心10 min，上清液即为样品提取液。3.3.9.2 显色及测定：采用TBA比色法17吸取2 mL提取液，加入2 mL0.6TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮10-15 min（不得超过此时间）迅速冷却，离心。取上清液测定532 nm和450 nm，600 nm处的光密度。MDA浓度=6.45×(A532-A600)-0.56×A450MDA含量（mol/g）=4 论文进度安排第一阶段：2011年12月-2012年2月，确定研究课题，查阅相关参考文献为撰写开题报告做准备。第二阶段：2012年3月-2012年4月，撰写开题报告，制作PPT准备开题报告答辩。第三阶段：2012年5月，准备实验材料，做预实验，根据预实验进一步修改实验方案。第四阶段：2012年6月-2012年7月，按照修改好的实验方案，进行相关的实验。第五阶段：2012年9月，对本实验结果进行整理、分析并撰写论文。5 主要参考文献：1 刘艳丽, 许海霞, 刘桂珍. 小麦耐盐性研究进展J. 中国农学通报, 2008, 24(11):202-2062 张知仪, 李朝苏, 郭大明, 川麦42等人工合成小麦衍生品种的示范推广及成效J. 西南农业学报, 2009, 22(4):11643 张秋芳. 作物硫素营养的生理作用及其胁迫研究J.江西农业大学学报, 2001, 23(5):136-1394 祁葆滋. 硫营养对小麦、玉米碳、氮低代谢中几项生理参数的影响J. 作物学报, 1989, 15(1):31-355 卢从明, 张其德, 匡庭云, 等. 水分胁迫抑制水稻光合作用的机理J. 作物学报, 1994, 20(50):601-6066 Wilmams J G, Kubelika U R, Livak K J, et al. 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