外源基因的原核表达课件.ppt

08.03.2023,1,外源基因的原核表达,08.03.2023,2,外源基因表达的作用：外源基因表达泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制、编码蛋白质的结构与功能的重要方法，也是制备和生产新型蛋白质药物、诊断试剂必不可少的手段。通过外源基因的表达可由宿主细胞产生大量的目的蛋白。,08.03.2023,3,常用的原核外源表达系统,大肠杆菌表达系统,芽孢杆菌表达系统,链霉菌表达系统,蓝藻表达系统,08.03.2023,4,原核生物基因表达系统的特点：,1、原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。,2、基因组结构简单，便于基因操作和分析。,3、多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。,08.03.2023,5,原核生物基因表达系统的特点：,4、不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。,5、内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。由于以上特点，近年来真核生物表达系统发展很快，并构建了相应的基因表达载体。,08.03.2023,6,大肠杆菌表达系统,大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最为广泛的经典表达系统。属革兰氏阴性细菌。其特点是：,遗传背景清楚,目的基因表达水平高,培养时间短,08.03.2023,7,大肠杆菌表达系统的主要不足,1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程。2、表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复杂。,08.03.2023,8,大肠杆菌基因表达载体,理想的大肠杆菌表达载体的特征,1、稳定的遗传和复制能力，在无选择压力下保存于大肠杆菌细胞内,2、具有显性的转化筛选标记,3、转录可以调控，抑制时本底转录水平较低,4、转录的mRNA能够在适当的位置终止且转录不影响载体的复制,5、具备适用于外源基因插入酶切位点,08.03.2023,9,大肠杆菌基因表达载体构成,1、复制子：是一段包含起始位点和反式因子作用区在内的DNA片段。其功能是通过复制使载体稳定存在于大肠杆菌细胞。,08.03.2023,10,大肠杆菌基因表达载体,2、筛选标记：大肠杆菌经过转化后，仅有少数细菌能获得携带外源基因的质粒并稳定地传代，筛选标记可有效地筛选出转化有外源基因的阳性重组。,08.03.2023,11,大肠杆菌基因表达载体,3、启动子：是与DNA依赖的RNA聚合酶相结合的一段DNA序列。启动子是调控外源基因转录的重要顺式作用元件，与mRNA的合成有很大关系，是表达载体不可缺少的元件。,08.03.2023,12,大肠杆菌基因表达载体,4、终止子：在转录过程中能在特异位点将转录终止的DNA序列。有两种类型1、因子型终止子2、转录产物二级结构,08.03.2023,13,08.03.2023,14,大肠杆菌基因表达载体,4、终止子：能在特异位点终止转录的DNA序列。终止子有两种类型1、因子2、转录产物二级结构,08.03.2023,15,08.03.2023,16,08.03.2023,17,终止子的功能（1）、能能有效控制目的基因mRNA的长度（2）、提高mRNA的稳定性（3）、避免载体上其他基因的异常表达,08.03.2023,18,大肠杆菌基因表达载体,5、核糖体结合位点：原核细胞mRNA蛋白合成起始点上游的一段非编码序列。能与30S小亚基中16S rRNA3末端的一段序列特异结合。此序列富含嘌呤，核心序列为SD序列。,08.03.2023,19,大肠杆菌基因表达载体,6、密码子：密码子有简并性，多个密码子为一个氨基酸进行编码，不同生物在利用这些密码子时其利用频率不同，不同的密码子会影响到大肠杆菌的翻译速度。,08.03.2023,20,基因表达的机制,基因工程技术的核心是基因表达技术。迄今为止，已构件建了不同类型的表达系统，可根据需要合理地选择适当的表达系统。,外源基因在受体细胞中的表达包括：1、转录2、翻译,两个环节,08.03.2023,21,基因表达的机制,基因工程的核心问题：有效表达外源基因表达的关键步骤：起始转录基因表达的限速步骤：转录起始的速率构建表达系统时首先要考虑的问题是：1、选择可调控的启动子2、相关的调控序列,08.03.2023,22,目的：在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖到一定的密度时，在某种特定的诱导因子的诱导下启动转录合成mRNA。,08.03.2023,23,mRNA的延伸与稳定性：有效表达的关键是：保持mRNA的1、有效延伸2、正确终止3、mRNA在细胞中的稳定存在,08.03.2023,24,mRNA的有效延伸：导致mRNA转录提前终止的可能原因有和解决办法1、衰减子：类似于简单的终止子，在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间。在构建表达载体时应避免该序列的存在。,08.03.2023,25,2、非特异终止：防止非特异性终止的方法是在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。,08.03.2023,26,转录的正确终止也是外源基因有效表达的重要因素，可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。,原核生物解决办法,真核生物解决办法,08.03.2023,27,mRNA在细胞中的稳定存在：mRNA在受体细胞中的稳定存在直接决定翻译产物的多少。解决办法1、原核生物：选择一个RNase缺失的工程菌株。2、真核生物：提高mRNA的正确加工,08.03.2023,28,外源基因mRNA的有效翻译,为使外源基因有效翻译，在构建表达体系时应考虑以下问题：,1、AUG为首选起始密码子,2、SD序列为与核糖体结合位点,3、SD序列与起始密码子之间的距离为39个碱基,4、在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构,5、选择合适的终止密码子,08.03.2023,29,表达蛋白在细胞中的稳定性,常用的措施有：,1、构建融合蛋白表达系统,2、构建分泌蛋白表达系统,3、构建包涵体表达系统,4、选择蛋白水解酶基因缺陷受体系统,08.03.2023,30,外源基因在大肠杆菌中表达产物在细胞的位置：外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中。其表达形式包括形成：1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白,08.03.2023,31,大肠杆菌载体的表达方式,非融合表达载体,融合表达载体,带纯化标签表达载体,分泌型表达载体,表面展示表达载体,带分子伴侣表达载体,08.03.2023,32,1、非融合表达载体：应用此种载体表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋白质在结构、功能和免疫原性等方面基本或完全一致。目前上市的细胞因子类产品多采用此类表达载体。,2、融合表达载体：分子量较小的蛋白质常用此类载体进行表达。将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框。,08.03.2023,33,在进行融合表达时，一般将受体菌蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋白的方式表达后其稳定性大大增加。其原因为：外源小分子蛋白上的酶切位点暴露于分子的表面。当以融合蛋白的形式表达后，外源蛋白部分在菌体自身蛋白的引导下正确折叠，可最大程度上封闭酶切位点。,08.03.2023,34,带纯化标签的表达载体：载体上具有一段特殊序列，该序列表达后可作为纯化标签。目的基因与该序列融合表达后，用亲和层析的方法很方便的将目的蛋白分离，切除标签序列后可得到纯化的目的蛋白。,08.03.2023,35,分泌型表达载体：将目的基因与信号肽融合表达，表达蛋白在信号肽的引导下成为分泌蛋白。,表面展示载体：将目的基因克隆到细菌表面蛋白的结构基因中，从而达到细菌表面表达。,带分子伴侣的表达载体：,08.03.2023,36,08.03.2023,37,08.03.2023,38,08.03.2023,39,宿主菌,大肠杆菌表达系统表达的基因一般都是异源基因，甚至是真核生物基因，而在细胞内积累大量的异源蛋白极易被降解。造成重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因有：,1、大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统；,08.03.2023,40,2、大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子；,3、大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。由于以上原因，为使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的工程菌株。,08.03.2023,41,常见的大肠杆菌表达系统,Lac和Tac表达系统：以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。通过对大肠杆菌tac I 基因诱变，获得能过量表达lac I 阻遏蛋白的基因突变体lac Iq，使外源基因的表达调控在一定的水平。此外，目前还构建了阻遏蛋白温度敏感型突变体lac Iq(ts)宿主菌和载体，使lac和tac启动子的转录受温度的控制，在低温(30oC)下基因的转录受到抑制，在(42oC)下基因的转录保持开放。,08.03.2023,42,常见的大肠杆菌表达系统,PL和PR启动子表达系统：以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。在野生型噬菌体中，PL和PR启动子的转录与否决定噬菌体进入裂解循环或溶原循环。噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞中含量的途径很难操作，因此在构建表达体系时，选用温度敏感突变体cl1857(ts)的基因产物调控PL和PR启动子的转录。,08.03.2023,43,常见的大肠杆菌表达系统,T7表达体系：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的，具有很高表达能力的表达系统。T7噬菌体RNA聚合酶能选择性地激活T7噬菌体启动子的转录，这是一种活性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。在大肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体启动子控制的基因在T7噬菌体RNA聚合酶存在下进行高表达。,08.03.2023,44,常见的大肠杆菌基因表达受体菌株,菌株 基因型 启动子,BL 21 hsd S gal T 7噬菌体,HMS174 recA1 hsdR rif T 7噬菌体,M5279 lacZ trpA rpsL 噬菌体PL,RB791 W3110 lacIq L8 lac,tac,08.03.2023,45,大肠杆菌高效表达目的基因策略,对表达相关元件进行优化,提高稀有密码子tRNA的表达作用,提高外源基因表达产物的稳定性,优化发酵过程,提高外源基因mRNA的稳定性,08.03.2023,46,表达相关元件的优化,主要包括与表达相关的启动子序列和决定mRNA翻译的SD序列。具体方法为组合强启动子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配对的碱基序列；调整SD序列与起始密码ATG之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成发卡结构。,08.03.2023,47,表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。,08.03.2023,48,核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要比 AAGGA 高36倍 翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是 68 个碱基长度，与 AAGAA 的最适距离是57 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 4个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5 个碱基；mRNA 的翻译才能进行 ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。,08.03.2023,49,核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5 端的二级结构，研究表明讨 mRNA 5端形成的“茎环”结构阻碍了 mRNA 与核糖体 30S 亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。,08.03.2023,50,尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5 端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏 mRNA 5 端的“茎环”结构。,08.03.2023,51,把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个 SD 序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5 端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下,08.03.2023,52,表达质粒的优化和设计,在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列 能提高 mRNA 翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子。,08.03.2023,53,提高稀有密码子tRNA的表达作用,简并密码子的使用频率不同与相应tRNA在细胞中的丰度有关。过多使用低丰度tRNA时，会因tRNA耗尽而影响翻译。可将外源基因中同义密码子进行点突变，成为受体菌中常用密码子而提高表达能力。,08.03.2023,54,共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因。现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有：编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC;编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 Ile 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA,四、高效表达目标基因的战略和技术,08.03.2023,55,共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的 tRNA 的丰度有正比关系稀有密码子对应的 tRNA 的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。,08.03.2023,56,解决这一问题的办法：1、通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子。2、在表达系统中共表达稀有密码子 tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度,08.03.2023,57,提高外源基因表达产物的稳定性：大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，其蛋白水解酶的活性可能会增加。因此必需提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法有：1、将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中；2、选用某些蛋白水解酶缺陷株；3、对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；4、在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子。,08.03.2023,58,提高外源基因mRNA的稳定性：大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。为了保持外源mRNA在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施：1、尽可能减少核酸外切酶对外源基因mRNA的降解；2、改变外源基因mRNA的结构，使之不易被酶降解。,08.03.2023,59,提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性 由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。,08.03.2023,60,提高目标蛋白的稳定性的措施主要有：1、利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中2、采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。3、对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达。4、共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因。5、对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造。6、在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。,08.03.2023,61,但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要表现为：大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的较运和分泌效率一般比较低，不能满足大规馍制备的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速率慢，使高密度发酵比较困难。融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致生物比活力降低，甚至没有活性。融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学的方法切割出单体目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数据，而目前这方面的数据库还不完整。,08.03.2023,62,优化发酵过程：,工艺的优化,生物学因素的优化,08.03.2023,63,工艺的优化,扩大培养的条件优化,反应器的优化,08.03.2023,64,生物学因素的优化,溶氧量,pH值,温度,培养基成分,培养基的混合情况,08.03.2023,65,四、高效表达目标基因的战略和技术,高密度发酵和工程化宿主细胞 大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种,08.03.2023,66,构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从恨本上解决问题的途径之一。,08.03.2023,67,芽孢杆菌表达系统,芽孢杆菌是对人畜无害的革兰氏阳性土壤微生物。细菌细胞壁内不含内毒素，能分泌大量蛋白到胞外，目前已成为一些重要工业酶制剂的生产菌种。,08.03.2023,68,1、多为非致病性微生物,2、培养条件简单，生长迅速,3、表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构象和生物学活性,4、遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作,5、培养发酵技术比较成熟,08.03.2023,69,芽孢杆菌表达系统的不足,1、芽孢杆菌分泌的蛋白酶量大、种类多，对外源基因表达产物的稳定性形成很大威胁,2、载体不稳定，易造成外源基因的丢失,08.03.2023,70,芽孢杆菌表达载体,复制子：目前广泛应用于芽孢杆菌表达载体的复制子有：1、来源于金色葡萄球菌的复制子如pUB110、pC194和pE194等质粒表达载体。2、来源于小芽孢杆菌的复制子如pHY481、pWT481等。,08.03.2023,71,芽孢杆菌表达载体,启动子：在利用芽孢杆菌表达体系时，必需使用芽孢杆菌能够识别的启动子。芽孢杆菌含有多种转录起始识别因子()，在芽孢杆菌中已鉴定的 已达十种。启动子可被特异的 因子识别。芽孢杆菌启动表达具有明显的时序性，与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。,08.03.2023,72,表达载体：1、自主复制质粒芽孢杆菌的自主复制质粒大多为无抗性标志的隐蔽质粒。带有抗性标志的自主复制质粒主要来自其它革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194，并在这些质粒的基础上构建了双标记质粒等载体。自主复制质粒不稳定，在复制过程中易发生丢失。,08.03.2023,73,2、整合质粒：在大肠杆菌质粒的基础上增加一个芽孢杆菌的抗性标志，以及待整合的目的基因。因其没有芽孢杆菌的复制子，不能自主复制，整合到芽孢杆菌染色体后，随细胞复制而复制。,3、噬菌体：105、SP及其它噬菌体均可作为芽孢杆菌的表达载体。其中105是一种温和噬菌体。,08.03.2023,74,宿主菌：野生型芽孢杆菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影响外源基因表达产物的稳定性，因此在构建芽孢杆菌表达系统宿主菌时要将蛋白酶基因进行突变，使其灭活或将活性降低。目前应用较多的宿主菌主要有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。,08.03.2023,75,枯草芽孢杆菌能分泌6种不同的胞外蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金属蛋白酶、杆菌肽酶及中性蛋白酶A和B。对其中35种胞外蛋白酶基因进行突变，可将胞外蛋白酶的活性降低至原来的1；若将6种胞外蛋白酶基因全部突变，则胞外蛋白酶活性可降至原来的0.3%左右。,08.03.2023,76,短小芽孢杆菌表达体系的优点：,1、能对许多蛋白质进行分泌表达,2、胞外蛋白酶活性较低,3、短小芽孢杆菌分泌胞外蛋白酶的同时还能产生蛋白酶抑制剂，不同短小芽孢杆菌分泌抑制剂的能力不同，使胞外蛋白酶的活性差异很大,08.03.2023,77,4、细胞壁的结构由三层组成，最外两层为蛋白层，内层为肽聚糖。细胞壁的结构与细胞的生长周期有关。在生长稳定前期，细胞壁的外层和中层蛋白开始从细胞表面脱落，分泌型蛋白开始表达；进入稳定期后，细胞壁的蛋白层全部脱落，细胞壁蛋白仍然表达导致细胞壁蛋白在培养基中大量累积。,08.03.2023,78,5、利用细胞壁蛋白基因的启动区、操纵区、翻译起始区和蛋白质信号肽序列等元件表达外源基因，可使 外源基因在小芽孢杆菌表达系统中获得高效分泌表达。,08.03.2023,79,芽孢杆菌中高效表达的策略,1、提高表达质粒在细胞中的稳定性：以金黄色葡萄球菌为基础构建的一系列质粒在进行滚环复制时会产生许多单链DNA，这些单链DNA的存在会对质粒DNA造成影响，在没有选择压力的情况下易发生丢失；某些表达质粒载体还含有染色体DNA同源序列，在细胞分裂的过程中可发生同源交换，导致质粒的消失。,08.03.2023,80,2、构建新型的表达质粒：通过消除表达载体中与宿主菌染色体DNA的同源序列,3、构建整合型质粒：利用质粒中与染色体的同源序列构建整合型质粒，使目的基因整合到染色体上,4、灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶,08.03.2023,81,链霉菌表达系统,链霉菌是一类好氧、丝状的革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤中，能够产生多种生理活性物质。链霉菌的染色体为线状结构，在中间含有复制起始点和共价结合的末端蛋白，DNA不稳定，有时会出现缺失而环化，但对细菌生长没有严重影响。,08.03.2023,82,链霉菌表达系统的特点；,1、为非致病性细菌，不产生内毒素,2、可进行外源蛋白的分泌表达,3、可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长,4、链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础,08.03.2023,83,链霉菌表达载体,启动子：链霉菌基因启动子的结构表现为多样性，至少存在三类链霉菌基因启动子：,1、与大肠杆菌基因10区和35区类似的启动子，10区碱基序列通常为5TAGPuPuT3，35区碱基序列 为5TTGCPu3，这种启动子序列可被大肠杆菌RNA聚合酶识别，这类启动子一般在细菌对数生长期启动相关基因的转录。,08.03.2023,84,2、仅与大肠杆菌基因10区类似的启动子。,3、与大肠杆菌基因10区与35区序列均不相同的启动子。,终止子：链霉菌基因终止子结构具有较长的不完全互补反向重复序列，能形成发卡结构，在多数情况下不含寡聚T序列，转录终止位点位于终止子结构下游的邻近区域,08.03.2023,85,核糖体结合位点：链霉菌基因核糖体结合位点的序列类似于其他原核生物的SD序列：5(a/g)GGAGG3相对于其他革兰氏阳性细菌而言，链霉菌基因中核糖体序列的保守性略低，与起始密码之间的距离为512个碱基。链霉菌基因转录起始位点与编码区之间的距离变化也较大，从数个bp到几百个不等。,08.03.2023,86,密码子：链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性。对数十种链霉菌蛋白质的密码子进行统计发现，编码蛋白质的碱基序列中GC的平均含量高达73，密码子的第一、第二和第三位碱基的GC含量分别为66、53和93。有些简并密码子的使用频率不足2。,08.03.2023,87,链霉菌表达载体,1、高拷贝载体：普遍采用的是pIJ101，在链霉菌中的拷贝数为40800。通常加入硫链丝霉素、红霉素、紫霉素和新霉素作为抗性选择性标记。pIJ702是pIJ101的衍生质粒，含有mel(酪氨酸酶)和tsr基因作为选择性标记。外源基因可插入灭活mel基因，因不产生黑色素而非常方便使用。,08.03.2023,88,2、低拷贝载体：由SCP2*衍生的质粒pIJ922和940等，可接受较大的外源基因，但只有12个拷贝。,3、穿梭质粒载体：可在大肠杆菌中完成构建和复制，在链霉菌细胞中进行表达。,4、噬菌体载体,08.03.2023,89,宿主菌：链霉菌基因表达系统的宿主菌主要有变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌。天蓝色链霉菌是整个霉菌中分子遗传学研究最清楚的菌株，但有较强的修饰系统，因而在实际应用中都是以变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体菌系统。,08.03.2023,90,变铅青链霉菌表达外源基因的优点,1、遗传背景清楚，不含内源性质粒,2、对外源DNA无明显的修饰作用,3、能够高效表达链霉菌基因以外的其他基因；,4、具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。,08.03.2023,91,在链霉菌中高效表达外源基因的策略,影响外源基因在链霉菌中表达的因素包括：,启动子的特性,信号肽的序列,基因的结构,和发酵条件等,08.03.2023,92,启动子的影响：链霉菌RNA聚合酶能识别某些原核生物的启动子，但不能识别真核生物基因的启动子，因此表达真核生物基因时要采用链霉菌的启动子。为高效表达要对其进行适当的修饰和改造。如在启动子的10区和35区内插入GC碱基对可明显提高外源基因的转录效率；将ermE启动子中缺失3个碱基对，可使基因启动转录的效率大大增加。,08.03.2023,93,信号肽序列：针对要表达的外源蛋白对信号肽序列进行优化是实现外源蛋白高效分泌表达的重要途径。在信号肽N区的电荷数增加或减少可使分泌表达的效率成倍的增加或降低；信号肽与目的蛋白的距离也影响到外源蛋白的分泌。信号肽只影响分泌与否而不影响表达的效率。,08.03.2023,94,基因结构的影响：,1、密码子的影响：应尽可能不出现链霉菌中的稀有密码子。链霉菌中翻译的起始密码子一般为ATC或GTC,终止密码为TAA或TAG。,2、SD序列：不同的宿主其SD序列不同，针对不同的链霉菌对SD序列进行改造或修饰以提高外源基因的表达。,08.03.2023,95,3、终止子：选择合适的终止子可提高RNA聚合酶的利用率和增加mRNA的稳定性,发酵条件：包括发酵工艺、培养基组分、各种环境因素如温度、pH值和溶氧等一系列相关条件，这些条件的确定须经实验反复摸索。,08.03.2023,96,蓝藻表达系统,蓝藻是近年来迅速发展起来的一种很好的表达系统，蓝藻含有叶绿素和藻胆色素，具有光合系统，进行光合作用。蓝藻还具有原核生物的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体DNA裸露，是典型的原核生物。,08.03.2023,97,蓝藻表达系统的特点,作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，表现为：,1、基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA检测；,2、细胞壁为革兰氏阴性，便于外源DNA的转化；,08.03.2023,98,3、营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度；,4、多种蓝藻含有内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件；,5、蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，经常作为食品或保健品的添加剂。,08.03.2023,99,蓝藻外源基因表达载体,为使外源目的基因的有效转化及表达，已构建了一系列穿棱质粒表达载体和基因整合平台系统，如：pZL、pPKE2、pPKET等。在这些表达载体上组装了多种含有不同启动子的基因表达盒。应用较多的有噬菌体PL和PR启动子及蓝藻藻蓝蛋白cpcB2A2操纵子启动子和热休克基因groESL等。,08.03.2023,100,在蓝藻细胞中高效表达外源目的基因的策略,1、构建在蓝藻细胞中稳定性好的表达载体系统：现已构建了松驰质粒复制起始点的穿梭质粒，在细胞中有较高的基因拷贝数，提高了目的基因高效表达的可能性。,08.03.2023,101,2、重组穿梭质粒在蓝藻细胞中通常是很不稳定的，在缺选择压力的培养条件下很容易丢失，导致目的基因表达的不稳定性。近年来以蓝藻染色体DNA的非必需序列区为基因整合平台，构建相应的供体质粒表达载体，通过同源重组将目的基因整合到蓝藻染色体上保证其稳定。,08.03.2023,102,3、组装含强启动子的外源表达盒。,4、外源基因融合表达：近年来开发了泛素融合表达系统。经蓝藻、大肠杆菌及酵母细胞的实验证明，目的基因泛素基因融合表达可大大提高目的基因的表达量，并且几乎所有泛素融合形式产生的蛋白质都是具有活性的，同时，泛素还可被作为分离标签。,08.03.2023,103,基因表达产物的检测与分离纯化,外源基因的表达包括转录和翻译两个阶段。因此，外源基因表达产物的检测过程就是对特异性mRNA和蛋白质的检测。对mRNA检测的主要方法为Northern杂交法，检测特异性蛋白质的方法包括生化反应检测法、免疫学检测法和生物学活性检测法等。,08.03.2023,104,外源基因转录产物的检测,外源基因转移到受体细胞后可能有的命运是：,1、外源基因与表达载体一起游离于染色体外进行转录2、外源基因整合到染色体上并进行转录3、外源基因整合到染色体上后不转录，表现为基因沉默,08.03.2023,105,Northern杂交检测mRNA步骤：1、提取总RNA2、分离mRNA(利用亲和层析的原理纯化)3、制备RNA探针。(根据mRNA序列合成同源DNA探针或以cDNA探针)4、Northern杂交,08.03.2023,106,报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。,报告基因的酶法检测,08.03.2023,107,08.03.2023,108,作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。,08.03.2023,109,报告基因的特点1、表达产物及其功能在未转化的受体细胞中不存在2、报告基因的表达产物便于检测,08.03.2023,110,基因工程中使用的报告基因：,1、氯霉素乙酰转移酶(CAT)：催化乙酰辅酶A中的乙酰基团转移到氯霉素分子上而使氯霉素失活。真核生物细胞中不含CAT，重组后细胞产生氯霉素抗性。CAT的活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或乙氯霉素的增加表示。,08.03.2023,111,基因工程中使用的报告基因：,2、-葡萄糖苷酯酶基因(GUS)编码产物催化-葡萄糖苷酯类物质的水解。大多数植物细胞、细菌细胞和真菌中都不存在内源GUS活性而广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因。,08.03.2023,112,以邻硝基苯D半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红D半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。,08.03.2023,113,3、荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达78个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。,08.03.2023,114,荧光素酶报告基因有许多优点：,非放射性；,比CAT及其他报告基因速度快；,比CAT灵敏100倍；,荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为35小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。,08.03.2023,115,4、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)：SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。,08.03.2023,116,5、荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 00030 000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母(AequoreaVictoria)中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。,08.03.2023,117,免疫学检测：是基因表达产物检测中最常用的方法之一。以表达产物作为抗原，通过与特异性抗体发生反应来确定基因表达的情况。主要方法有1、免疫沉淀法 2、酶联免疫吸附法 3、Westhern印迹法 4、固相放射免疫法等,08.03.2023,118,免疫沉淀法的过程 1、对靶细胞进行放射性标记：通常以同位素35S标记靶蛋白，在培养基中加入35S的蛋氨酸和半胱氨酸的混合物，通过代谢过程使哺乳动物培养细胞标记上放射性同位素。2、细胞裂解释放靶抗原 3、靶蛋白的免疫沉淀 将抗靶蛋白的特异性抗体加入到细胞裂解液中形成抗原-抗体复合物并回收。,08.03.2023,119,4、将回收的靶蛋白在反应试管中与蛋白抗体，使之与靶蛋白结合并形成沉淀。5、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,08.03.2023,120,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)1、抗体制备：ELISA检测中的抗体包括普通抗体和酶标记抗体，其中酶标记的抗体又分为针对特异抗原的酶标一抗和针对一抗的酶标二抗 2、抗体或抗原的包被：通过物理吸附法和共价交联法等将抗原或抗体固定在固相载体的表面,08.03.2023,121,3、免疫反应：特异性抗原与固相抗体结合形成抗原-抗体复合物，再与酶标抗体反应形成抗原-抗体-酶标抗体复合物 4、特异性表达产物的检测：洗去未发生反应的抗体，加入显色剂或荧光底物，通过酶促反应发生颜色或荧光强度变化以确定抗原的量。,08.03.2023,122,Westhern印迹法1、总蛋白质的提取 2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、蛋白质印迹 4、探针的制备(针对目的蛋白的抗体一抗它一般不进行标记，而与一抗结合的二抗带特定的标记)5、杂交检出,生物学活性检测,08.03.2023,123,基因表达产物的分离纯化,1、细胞破碎 2、离心 3、特异性表达蛋白的初步分离 4、柱层析 5、电泳分离 6、高效液相层析,08.03.2023,124,包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。包涵体主要存在于细胞质中，主要由蛋白质组成，并且大部分蛋白质为外源基因的表达产物，他们具有正确的氨基酸序列，但没有正确的空间结构，因此包涵体不具备生