发酵过程的染菌.ppt

http:/,第六节 染菌的防治,什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,一、染菌的影响,发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（一）染菌对发酵的影响,生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,1、发酵染菌对不同品种的影响,放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。,不同菌,不同产品,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。,不同产品,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。,不同产品,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,2、污染不同种类和性质的微生物的影响,（1）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,3、不同时间染菌对发酵的影响,污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有一定的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（1）种子培养期染菌,由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（2）发酵前期染菌,发酵前期最易染菌，且危害最大。原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（3）发酵中期染菌,发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（4）发酵后期染菌,发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响,1、发酵染菌对过滤的影响,染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,2、发酵染菌对提炼的影响,染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,二、染菌的原因,（一）发酵染菌率计算基准总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法。总染菌率%=,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象大多数是由于工作中“明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理”所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终。现将我们收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶 0.48夹套穿孔 12.36盘管穿孔 5.89接种管穿孔 0.39阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏 1.54其它设备渗漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,上海第三制药厂染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌 14.15盘管穿孔 14.20阀门渗漏 23.30空气系统有菌 10.0管理不善 25.80其它 7.49原因不明 5.78,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08经分析有下表所列原因：项目 百分率%进罐前未做设备严密度检查 25.8接种违反操作规程 25.8检修质量缺乏验收制度 19.35操作不熟练 19.35配料违反工艺规程 6.45调度不当 3.25,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析 项目 百分率%外界带入杂菌（取样、补料）8.20设备穿孔 7.60空气系统有菌 26.00停电罐压跌零 1.60接种 11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足 0.60管理问题 7.80 操作违反规程 1.60种子带菌 0.60原因不明 35.00,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,造成染菌的主要原因总结,1、设备渗漏,设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85，上海三厂的分析这类染菌为37.5。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,2、空气带菌,从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96和 26%。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,3、种子带菌,种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,4、灭菌不彻底,灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间产生过多泡沫蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变化。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料杂菌的数量发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,5、技术管理不善,技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,三、无菌状况的检测,1、环境无菌的检查尘埃粒子检测无菌平板检测,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,2、种子及发酵液无菌状况检测,酚红肉汤培养基检测平板划线显微镜观察,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,四、染菌情况分析,染菌的原因有多种，对于实际情况如何分析呢？,1、单罐染菌不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,2、多罐染菌系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底,3、前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,4、中后期染菌补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,五、染菌的防止,1、防止种子带菌,制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,无菌室要求,在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,2、防止设备渗漏,发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,试漏方法可采用水压试漏法。即被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。阀门渗漏可以用集气桶来试漏。方法是先在集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气，使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,3、防止培养基灭菌不彻底,培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌分批灭菌 1210C，30分钟连续灭菌 罐温1251300C，3045分钟,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,蒸汽下进上出,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,连续灭菌设备流程,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,连 消 塔,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,4、防止空气引起的染菌,空气过滤除菌设备流程,空压机,储罐,二级冷却,加热器,空气过滤,粗过滤,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。棉花-活性炭过滤器长期使用后，棉花和活性炭的体积被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失效。过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相接，要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,5、发酵染菌后的措施,染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,六、染噬菌体的防治,（一）染噬菌体对发酵的影响,发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,染噬菌体表现为：1、镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。2、发酵pH值逐渐上升，48小时之内可达8.0以上，不再下降。3、发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。4、生产量甚少或增长缓慢或停止有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（二）产生噬菌体的原因,通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害，经过12年以后，主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也携带着噬菌体到处传播，使噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（三）染噬菌体的检测在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入2030培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基表面，培养过夜，观察有无透明圈出现。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,（三）噬菌体的防治,1、必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面 3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,4、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放。5、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。6、发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,小 结,染菌对发酵的危害：干扰生产菌的正常代谢，降低产量改变pH，降解某些产物污染不同的微生物，不同阶段染菌危害,染菌对提炼的危害：过滤困难而大幅度降低过滤收率有机溶剂萃取时发生乳化,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,染菌原因,设备渗漏空气带菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善,染菌后的措施,染菌防治,发酵液必须灭菌后才可放下水道寻找染菌的原因染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,产生噬菌体的原因活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源,噬菌体的防治,危害：造成断种，无法生产,建立工厂环境清洁卫生制度感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。环境用漂白粉消毒选育抗噬菌体的菌种,发酵过程控制,染菌的防治,http:/,思考题1.染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？2.有哪些原因会引起染菌？3.染菌以后应采取什么措施？4.为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些措施？,发酵过程控制,染菌的防治,灭菌与空气净化,发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。,1.生物反应的基质因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。2.杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。3.有些杂菌会分解产物，使生产失败。4.杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。5.如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。,染菌危害,染菌对不同发酵过程的影响1、青霉素等抗生素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。2、核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。,3、柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。4、谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。5、疫苗发酵：全部废弃,谷氨酸,1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。,工业上具体措施,灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。消毒:一般指杀死营养细胞而不包括芽孢。牢固树立无菌观念!强调无菌操作!,第一节 灭 菌,(一)灭菌的方法1）干热灭菌法：160170，11.5h2）火焰灭菌法：范围有限3）电磁波、射线灭菌法：表面和空间的灭菌4）湿热灭菌法：121，30min,5）化学药剂灭菌法：车间环境等 高锰酸钾、漂白粉、75酒精等6）过滤除菌法：液体、气体,（二）培养基的灭菌,目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创 造无菌的条件。要求：达到要求的无菌程度（10-3）尽量减少营养成分的破坏,致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间。热阻:微生物在某一特定条件下(主要是温度)的致死时间，用于表示微生物对热的抵抗力。相对热阻：某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。微生物相对热阻,1.微生物热阻,湿热灭菌,2.对数残留定律,对数残留定律：湿热灭菌时，微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。,dN,dt,=,-kN,N:培养基中残留活菌数,个t:受热时间,minK:反应速率常数也称比死亡速率常数,min-1,若开始灭菌(t=0)时,培养基中活的微生物为N0,则上式积分以后可得:In,N,N0,-kt,2.303Lg=kt,N,N0,t=,2.303/kLg,N0,N,=,大肠杆菌在不同温度下的残留曲线,注：1、k越大，微生物越容易死亡 2、要达到彻底灭菌，即N=0，所需时间为无穷大，这在实际工作中是不可能的，因此常采用N=0.001，即灭菌的失败概率为千分之一。,例题：有一个发酵罐内装有40m3培养基，在121 进行实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2*105个耐热细菌芽孢，121 时灭菌速度常数为1.8 min-1。求灭菌失败几率为0.001时所需要的灭菌时间。解：N0=40*106*2*105=8*1012（个）Nt=0.001 k=1.8（min-1）灭菌时间：t=2.303/kLg=20.34min,N0,Nt,3.培养基灭菌温度的选择,杀死微生物 培养基营养破坏 如：高压加热情况下，仅20分钟，50%赖氨酸，精氨酸，其他碱性氨基酸被破坏；糖溶液焦化变色等。实践证明：“高温瞬时灭菌法”较好如：126 132，57min连续灭菌，所得培养基质量比采用120，30min 实罐灭菌好。,（三）培养基湿热灭菌方法,1、分批灭菌 2、连续灭菌3、固体培养基灭菌,1、分批灭 菌,又叫实罐灭菌，也叫实消（空消？），间歇灭菌，指将配置好的培养基放在发酵罐中，通入蒸气进行灭菌的过程。优点无需专门灭菌设备，投资少，设备简单，灭 菌效果可靠；蒸气要求较低，3*1054*105。缺点加热和冷却时间较长，营养成分有一定损失；罐利用低；蒸气用量变化大，造成锅炉负荷波 动大。适合中小型发酵罐及含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时适用,分 批 灭 菌,使物料溶胀并均匀受热，至90以上，通入蒸汽，达到121开始计算维持时间，生产中习惯采用30分钟。快速冷却，以减少营养物质的破坏，灭菌结束时，立即通入无菌空气，以维持罐压，然后开启冷却系统进行冷却。,升温,保温,冷却,灭菌,分 批 灭 菌,注：（1）为防止培养基因直接蒸汽加热而稀释，可先在蛇管或夹套通蒸汽加热至90100，然后再直接蒸汽加热保压。（2）实罐灭菌带入水分达820%，因此培养基灭菌时应留有余地。（3）实消前尽可能先空消。（4）有些设备也可采用SO2熏蒸灭菌，如葡萄酒发酵池、罐等。,2、连 续 灭 菌,连续灭菌：又叫连消，将配置好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温、保温、冷却的过程，进行灭菌的。,连续灭菌特点,优点可采用高温快速灭菌工艺，营养成分 破坏的少，有利于提高发酵产率；蒸气用量平稳，蒸汽压力高于5*105Pa；发酵罐利用率高；适于采用自动控制，劳动强度小；缺点设备比较复杂，投资较大；增加了连续灭菌设备及操作环节，增 加染菌几率。连续灭菌前要先空罐灭菌，管路灭菌 适于串连罐一起灭菌,配料罐 联消塔 维持罐 冷却器,连续灭菌流程,1、连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程,2、喷射加热-真空冷却流程,培养基从中间管进入，蒸汽从料管周围的环隙进入，在喷嘴处快速混合。国内大多数企业采用。,3、板式换热器灭菌流程,连续灭菌的设备,（1）预热 在配料罐或预热罐中进行，使培养基的温度升到70 左右，使得不溶性物料（如淀粉）发生糊化，不易沉淀，且进一步加热时震动噪音也大大减少。,连续灭菌的设备,(2)加热：在加热器中，培养基与蒸气混和，温度迅速上升到130 140。连消塔式连续灭菌设备有套管式和气液混合式。,套管式连消塔,气液混合式连消塔,喷射加热器可使料液和蒸汽迅速接触，充分混合，加热是在瞬时内完成的。,优点:结构简单,体积小,噪音低。,（3）保温：培养基被加热到预定温度后进入保温设备（也称维持设备），经过一段时间（57min）的保温，杀灭培养基中微生物。保温过程中，不通蒸汽，保温设备用保温材料包裹。常用保温设备有：罐式保温设备和管式保温设备。,（4）冷却：常用喷淋冷却器和套管冷却器。前者是将冷却水通过喷淋装置均匀的淋在水平 的排管上，以冷却管内的培养基。后者是一种内管走热培养基，内外管间的管隙 中走冷却水的冷却器。,3)固体培养基灭菌,固体培养基：流动性差，不易翻动，吸水加热易成团，冷却困难常用转鼓式灭菌机转鼓以0.51r/min徐徐转动，培养基得到翻动，蒸汽沿轴中心通入加热培养基，达到一定温度后，保温灭菌。适用于酒厂、酱油厂,污染杂菌的种类数量、灭菌温度时间等培养基成分：油脂、糖、一定浓度蛋白质pH值：pH68，微生物最耐热培养基的颗粒泡沫：泡沫中的空气形成隔热层,（四）影响培养基灭菌的因素：,（三）空气的净化,耗氧发酵和微生物繁殖培养都需要氧气，以空气为氧源。空气中含有杂菌较多，消耗营养物质，干扰甚至破坏预定发酵的 正常进行。例如：一个通气量40m3/min的发酵罐，一天所需要的空气量高达5.76*104m3，假如所用的空气中含菌量104个/m3，那么一天将有5.76*108个微生物进入发酵系统。,（1）空气中微生物的分布 空气中主要含有孢子和芽孢，细小而轻的菌体；随水分的蒸发、物料的移动被气流带入空气中或黏附在灰尘 上而漂浮在气流中。空气中微生物是附着在尘埃上的，有如下关系式：Y=0.003x-2.6 Y空气中微生物数量，个/m3 X空气中尘埃颗粒数量，个/m3 空气中含菌量随环境的不同而有很大的差异，选择良好的取风位置(如高空取风等)和提高空气除菌系统的除菌效率。,一、通风发酵对无菌空气的要求,（2）发酵对空气无菌程度的要求 不同的发酵过程，由于菌种生长能力强弱、生长速度快慢、它的分泌物的性质、发酵周期长短、培养物的营养成分和pH值的差异，对所用的无菌空气的无菌程度有不同的要求。如酵母培养没有氨基酸、液体曲、抗生素发酵那么严格。,（3）空气含菌量测定 难以准确测定，一般采用培养法和光学法。目前我国采用Y-091型粒子计数器，是利用微粒对光线散射作用来测量粒子大小和数量的。总菌数的测定；重叠细菌则难以测准。,发酵空气的标准-连续一定流量的压缩无菌空气。空气流量：单位时间（min）单位发酵液体积（m3）内通入的标准状态下的空气体积（m3），一般在0.1-2.0。压强：压力表显示0.2-0.4 MPa，克服下游阻力。空气质量：相对湿度小于70；温度比培养温度高1030；洁净度100级，或失败率103。,二、空气净化的方法,空气除菌就是除去或杀灭空气中的微生物。除去方法：静电吸附、介质过滤。杀灭方法：辐射、热杀菌、化学药物杀菌。,热灭菌法：经压缩机压缩后，200以上静电除菌法：静电除尘器除去空气中的水雾、油雾、尘埃、微生物介质过滤除菌法：经济实用，采用定期灭菌的介质来阻截空气中的微生物。,（一）、空气过滤除菌,1.空气过滤除菌原理 空气通过过滤介质时,由于阻碍导致气流出现无数次改变运动速度和方向，绕过纤维前进，存在五种作用机理。,不同于液体过滤,布朗扩散截留作用 惯性截留作用 拦截截留作用 重力沉降作用 静电吸引作用,惯性截留作用当微生物等颗粒随空气以一定的速度流动，在接近纤维时，气流碰到纤维而受阻，空气就改变运动方向绕过纤维继续前进。但微生物等颗粒由于具有一定的质量，在以一定速度运动时具有惯性，碰到纤维时，由于惯性作用而离开气流碰在纤维表面上，由于摩擦、粘附作用，被滞留在纤维表面上，这叫做惯性滞留作用当气流达到一定速度时，它是介质过滤除尘的主要作用。,布朗扩散截留作用 拦截截留作用在气流速度在临界速度以下，由于速度很低时，在纤维周边形成一层边界滞留区，在滞留区内气流速度更慢，在滞留区内的颗粒缓慢接近纤维，并与之接触，由于摩擦、粘着作用而被滞留。,重力沉降作用 静电吸引作用,当空气流过介质时，上述五种除菌机理同时起作用，不过气流速度不同，起主要作用的机理也就不同。当气流速度较大时，除菌效率随气流流度的增加而增加，此时惯性冲击起主要作用；当气流速度较小时，除菌效率随气流流度的增加而降低，此时扩散起主要作用；当气流速度中等时，可能是截留起主要作用。如果空气流速过大，除菌效率又下降，则是由于已被捕集的微粒又被湍动的气流夹带返回到空气中。,（二）、空气净化流程,提高空气的洁净度,冷却后除去空气中油和水,总过滤器和分过滤器除菌,获得无菌空气,经过空气压缩机,空气净化的一般流程,1、两级冷却、加热除菌流程 1）、比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，能充分地分离油水，使空气达到低的相对湿度下进入过滤器，以提高过滤效率。2）、特点：两次冷却、两次分离、适当加热。3）、尤其适用潮湿的地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。,介绍几种典型流程,2、冷热空气直接混合式空气除菌流程 1）、压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合。2）、特点是可省去第二次冷却后的分离设备和空气加热设备，流程比较简单，利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少等。3）、适用于中等含湿地区，但不适合于空气含湿量高的地区,3、高效前置过滤空气除菌流程 1、利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效 过滤后，再进入空气压缩机，这样就降低了主过滤 器的负荷。2、特点是采用了高效率的前置过滤设备，使空气 经过多次过滤，因而所得的空气无菌程度比较 高。,无菌空气制备的整个过程包括两部分内容：一是对进入空气过滤器的空气进行预处理，达到合适的空气状态（温度、湿度），二是对空气进行过滤处理，以除去微生物颗粒，满足生物细胞培养需要。,（三）、空气过滤设备,1粗过滤器 安装在空气压缩机前的粗过滤器，其主要作用：捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受损，同时也可减轻总过滤器负荷。粗过滤器一般要求过滤效率高，阻力小，否则会增加空气压缩机的吸入负荷和降低空气压缩机的排气量。常用的粗过滤器有：布袋过滤、填料式过滤、油浴洗涤和水雾除尘等。,粗过滤器,a 机械振动袋式除尘器,多采用毛质绒布或合成纤维滤布,过滤效率高，但阻力大,b 油浴洗涤装置,阻力不很大，耗油量较多,c 水雾除尘装置,空气流速限制在12m/s,2、空气压缩机 提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式空压机。,3空气贮罐 贮气罐的作用：（1）消除脉动维持罐压的稳定。（2）使部分液滴在罐内沉降。（3）保温灭菌。,（1）立式列管式热交换器（2）喷淋式热交换器（3）沉浸式热交换器,4空气冷却器,5气液分离器,空气除菌中除去水雾油雾的原因：否则：（1）导致传热系数降低，给空气冷却带来困难。（2）如果油雾的冷却分离不干净，带入过滤器会堵塞过滤介质的纤维空隙，增大空气压力损失。（3）黏附在纤维表面，可能成为微生物微粒穿透滤层的途径，降低过滤效率，严重时还会浸润介质而破坏过滤效果。,（1）旋风分离器:10m微粒（2）填料式分离器：5 m微粒,1过滤介质孔径大于微生物 其中一类如棉花、玻璃纤维、活性炭、烧结金属等介质填充；可作为总过滤器。另一类超细玻璃纤维纸为介质。可作为终端过滤器。,（四）空气过滤器,2、微孔膜过滤器 介质孔径小于细菌 可作前置空气预过滤器或终端过滤器.,以纤维状物（棉花、玻璃纤维、涤纶、微尼纶等）或颗粒状物质（如活性炭）为介质所构成的过滤器.特点：过滤层厚度大，体积大，压力降大，操作麻烦以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。特点：过滤层薄、体积小、压降小，操作简单，价格贵,过滤效率就是滤层所滤去的微粒数与原来微粒数的比值，它是衡量过滤设备过滤能力的指标。,（五）过滤介质效率,穿透率（P）为：,过滤效率：,：过滤前空气中的微粒数；,：过滤后空气中的微粒数；,：穿透率；,：过滤前空气中的微粒数；,将上式变形后积分：,或,这就是对数穿透定律，表示进入滤层的微粒数与穿透滤层的微粒数之比的对数是滤层厚度的函数，常数K的值与空气流速、纤维充填密度和直径、空气中微粒大小等因素有关。,L：滤层厚度,K：与气流速度、纤维直径、介质填充密度、颗粒大小等有关,影响介质过滤效率的因素,介质纤维直径越小介质滤层越厚、介质填充密度越大 过滤效率越高空气流速对过滤效果有影响 空气流速很低时,过滤效率随气流流速增加而降低,当气流流速增加至临界值后,过滤效率随气流流速增加而提高.,主要知识点,1、常用灭菌方法；2、热阻等概念，理解对数残留定律；3、掌握分批灭菌和连续灭菌的特点，比较优缺点.4、空气净化方法；介质除菌的原理。5、几种典型的空气过滤流程。6、空气除菌常用设备及各自特点。,