SD大鼠肝癌模型建立及病理分析论文.doc

SD大鼠肝癌模型建立及病理分析学院名称： 生命科学学院 专业名称： 生物科学 年级班别： 姓 名： 指导教师： SD大鼠肝癌模型建立及病理分析摘要：本实验采用灌胃的方法构建诱发性肿瘤模型，将二乙基亚硝胺（Diethyl nitrosamine，DENA）配成1%水溶液，根据每只SD雄性大鼠称重结果确定灌药量，70mg/kg，每周1次，灌胃14次之后正常饲养。从灌胃之日起，分别在第2、4、8、11、15、16周分六组处死大鼠，完整取其肝脏称其重量，计算肝体比；HE染色制作病理切片观察癌变演进中肝组织结构变化。结果显示，大鼠肝体比实验组与对照组相比，从第8周开始二者呈显著性差异（P<0.05），第11-16周二者呈极显著性差异（P<0.01）。病理切片结果表明成功获得大鼠肝轻度变性坏死、重度变性坏死、结节性增生、肝硬变、肝癌（包括肝细胞癌及肝胆管癌）五个时期的组织材料，病理演变过程和人类肝癌发生过程相似。克服了目前国内外对肝癌研究多取材于临床中晚期标本的局限性，为更加全面系统地研究肝癌演进的发生发展及分子机理奠定了坚实的基础。 关键词：大鼠；肝癌动物模型；诱发性肿瘤模型；二乙基亚胺SD Rat Hepatocarcinogenesis Model and Pathological AnalysisZHU Bao-minAbstract In this study, we use the gavage method to construct induced tumor model, diethylnitrosamine (DENA) paired 1% solution, according to SD male rats each weight to determine irrigation dose, 70mg/kg, 1 week, after 14 times to conduct normal feeding . The rats were devided into six groups and killed on the 2th week, 4th week, 8th week 11th week, 15th week, 16th week respectively when the rats were piped drinking, and the liver of every rat was taken completely then weight them and calculate the hepatosomatic. Structural changes in liver tissue was observated by HE staining. The results showed that the hepatosomatic of the experimental group compared to the control group, from the 8th week showed a significant difference (P<0.05), 11-16th weeks showed significant differences (P<0.01). According to the pathologic slices, liver degeneration and necrosis, severe degeneration and necrosis, nodular hyperplasia, cirrhosis, liver cancer (including hepatocellular carcinoma and liver bile duct) were got successfully, the evolution of pathology was similar process with human liver cancer. Overcome the limitations of the current domestic and international research on liver cancer taken from late clinical specimens, for a more comprehensive and systematic study of the incidence of liver cancer development and evolution of the molecular mechanism has laid a solid foundation.Key words Rat; Liver cancer animal model; induced tumor model; DENA前 言肝癌起病隐匿、病程短、死亡率高，是我国最常见的恶性肿瘤之一1，而动物模型是进行肝癌实验研究的重要材料和手段，所以建立肝癌动物模型有助于对肝癌的发生机制、诊断与治疗进行深入的研究。自20世纪初获得小鼠自发性肝癌模型以来，人们对肝癌动物模型的研究不断深入，逐步建立了动物自发性肝癌模型、诱发性肝癌模型、移植性动物肝癌模型、人类肝癌的异种移植模型以及转基因动物肝癌模型2。对于动物肿瘤模型的建立来说，自发性肝癌模型的优点是肿瘤发生学和细胞动力学特点与人类肿瘤较接近，肿瘤的形成周期长，便于进行慢性治疗实验，但是它的不足表现在自发性肿瘤模型的发生情况参差不齐，而且在短时间内无法获得大量的肿瘤材料，耗时，耗资；移植性肝癌模型虽便于重复实验，但与人体肿瘤的不同点较多，如肿瘤生长速度快，增殖比率高，体积倍增时间短等，特别是与人的实体瘤差别较大；人体肝癌的异种移植性肿瘤模型，移植后虽有一定比例的成活率，但因肿瘤生长缓慢又受植入部位包膜的限制，难以传代，无法满足实验研究（要求病源较多）的需要。其中诱发性肿瘤模型是以物理的、化学的或生物的致癌因素处理动物，使动物产生类似于人类肿瘤的肝癌。此类动物模型操作方法简单，在短期内可大量复制，并能严格控制各种条件，使复制出的肝癌模型适用于不同的研究要求。本实验即采用诱发性肿瘤模型的方法构建不同时期的肝癌动物模型，其中二乙基亚硝胺（Diethyl nitrosamine，DENA）诱导大鼠肝癌模型被认为是较符合人类肝癌发生发展过程的。二乙基亚硝胺（Diethyl nitrosamine，DENA）为亚硝胺类化合物，水溶性。诱发动物肝癌模型时，多采用灌胃法3-7，将DENA配成一定浓度（以1%最为常用）的水溶液。每周一次，连续12周以上。自由饮水的方法也较多见8-11。DENA诱发肝癌的特点是：诱癌成功率高；具有较强的致癌力，较小剂量即能启动致癌；有器官亲和性，尤对肝脏有较强的亲和力；肝癌多弥漫型，肝细胞性肝癌有较高比例,多为分化I级和II级，分化III级很少；整个诱癌过程一般分为非特异性药物反应、非癌性增生性反应和肝癌发生三个阶段，是迄今应用最广泛的一种诱发性肝癌模型12-15。1 实验部分1.1 主要试剂(1)DENA：购自Sigma(2)0.02MPBS：NaH2PO42H2O 0.6gNa2HPO412H2O 5.8 g NaCl 18 g 加双蒸水至5000ml.(3)Harris苏木精染液：甲液：0.25克苏木精溶于2.5ml 95酒精中；乙液：将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，加热使其溶解。甲液与乙液混合煮沸后加入0.25克氧化汞，玻璃棒搅匀，待冷却后过滤。用前加入几滴冰醋酸。(4)伊红染液：0.5克伊红溶于100ml 95%酒精中。(5)10%福尔马林：100ml福尔马林加入900ml蒸馏水，再加入磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠16.23g。1.2主要仪器设备紫外分光光度仪（UV-1800，北京瑞利）；超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州苏净安泰公司）；恒温振荡培养箱(HZQ-X100，哈尔滨东联)；移液枪 （德国Eppenddorf）1.3 大鼠肝癌模型的建立(1)实验动物：雄性SD大鼠60只，清洁级，（105±20）g，6-8周龄，购自河南省实验动物中心。(2)诱癌药物：二乙基亚硝胺。(3)给药方式及剂量：将DENA配成1%水溶液灌胃，70mg/kg，每周1次，灌胃14次之后正常饲养。(4)模型建立方法 随机分为10笼。随机选择3笼为对照组，其余7笼为实验组。按清洁级标准饲养，饲养温度21±2，相对湿度55±5%，光照时间12h/d（8:00-20:00），喂以普通颗粒饲料，自由饮水。计算灌药量：根据每只大鼠称重结果确定灌药量。给药时间及次数：见表1-1。表1-1 大鼠肝癌模型建立方法处死时间（w）实验组对照组灌DENA次数数量（只）灌生理盐水次数数量（只）227234474388783111171131514614316145143取样与处理：脊椎脱臼法处死大鼠。取材时，完整取出大鼠肝脏并称其重量，计算肝体比。1.4 大鼠肝组织病理学切片制作与观察1.4.1 盖玻片与载玻片的处理盖玻片直接用95%乙醇浸泡24h即可使用。待清洁处理的载玻片逐张放入清洁液中浸泡24h以上，捞出后自来水和蒸馏水冲洗以彻底除去清洁液，然后放入95%乙醇浸泡24h，烘干即可使用。1.4.2病理切片的制作(1)取材：组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5 cm为好，迅速冲洗固定。(2)固定：10%福尔马林中固定16-20 h。在投入固定液3-4 h后需要将组织取出进行修整，用手术刀片将组织块不规则的部分切去后，再次投入固定液中固定至16-20 h。(3)冲洗：将固定好的材料置于干净的标本缸中用自来水冲洗24 h；(4)脱水：将冲洗好的材料依次置于50%酒精、70%酒精、80%酒精、95%酒精、100%酒精（）、100%酒精（）各2-4 h；(5)透明：将上述脱过水的材料依次置于1/2二甲苯（二甲苯、酒精各半）、100%二甲苯（）、100%二甲苯（）各2-4 h；(6)浸蜡：将上述透明过的材料依次置于1/2石蜡（石蜡、二甲苯各半，3-4h）、石蜡（，30-40min）、石蜡（，30-40min）、石蜡（，30-40min），浸蜡在高于石蜡熔点3左右的融蜡箱中进行；(7)包埋：用金属包埋框盒包埋上述浸蜡材料，材料切面朝下，位置摆正，倒蜡时避免冷却不均；(8)修块：包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形或方形，确保蜡块的上下边平行，蜡边约1-2cm；(9)切片：以少许热蜡液将修好的蜡块底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，切片厚度为7m，切出连续的蜡带，用毛笔轻托置于纸上（切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度）；(10)展片：滴两滴蒸馏水于载玻片（已涂抹铬矾明胶）上，再将单个蜡片置于水滴上，略加温（此处可在水浴锅上搁置两块玻璃，将载玻片置于玻璃之上实现加温过程）使蜡片展开，最后用滤纸吸取多余水分；(11)烤片：贴好片后，将载玻片放入45烘箱中干燥；(12)脱蜡：将烤好的载玻片依次置于100%二甲苯（，15min）、100%二甲苯（,10min）、1/2二甲苯（同上第5步，2min）；(13)水化：将脱蜡后的玻片依次置于100%酒精（）、100%酒精（）、95%酒精、80%酒精、70%酒精、50%酒精和蒸馏水各2min；(14)苏木精染色：将玻片置于苏木精染液中1-5min，染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色；(15)蒸馏水洗1min；(16)自来水蓝化5 min；(17)蒸馏水洗1min；(18)伊红染色及脱水：将玻片置于50%酒精、70%酒精（其中溶有0.5%的伊红，染色后，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色）、80%酒精、95%酒精、100%酒精（）、100%酒精（）各2min；(19)透明：将玻片置于1/2二甲苯（同上第5步）、100%二甲苯（）、 100%二甲苯（）各2min；(20)封片：透明后，擦去材料周围多余液体，滴加适量中性树胶，将洁净盖玻片呈45度倾斜放下。(21)镜检：光学显微镜下检查制备完毕的玻片，挑选染色效果好、没有裂纹的，以备观察大鼠肝组织结构变化情况。2 实验结果2.1 大鼠体征变化结果正常大鼠皮毛光滑，活泼好动。2、4周实验组大鼠外观与对照组相似，但较对照组生长缓慢。8周实验组大鼠皮毛蓬乱、发黄、无光泽，食欲不振，体重开始下降。11周实验组大鼠饮食减少，活动较少，有大鼠死亡。15、16周实验组大鼠虚弱消瘦，行动迟缓，病态明显，死亡率明显增加。见图2-1。2.2 大鼠体重变化结果由表2-1和图2-2可见，对照组大鼠体重在整个实验周期内呈持续增长的趋势；而实验组大鼠从8周起，体重增长缓慢。经SPSS 15.0软件分析表明：大鼠体重实验组与对照组相比，第8周呈显著性差异（P<0.05），第11-16周呈极显著性差异（P<0.01）。表2-1 大鼠肝癌癌变进程中对照组与实验组体重变化时间(周)体重(g)对照组实验组2131.49±8.78132.13±4. 854251.15±14.53249.78±8.538362.14±3.91338.23±8.89*11397.15±20.55365.74±14.05*15439.00±12.35385.21±18.15*16448.00±8.16376.49±17.35*表示与对照组相比呈显著性差异，P<0.05；*表示与对照组相比呈极显著性差异，P<0.01。 图2-2 大鼠肝癌演进中体重变化*2.3 大鼠肝脏组织表观观察结果正常大鼠肝脏表面光滑，颜色红润，边缘锐利，质地柔软。2、4周，实验组大鼠肝脏基本与正常相似，但颜色较暗。8周，实验组大鼠肝脏表面尚光滑，颜色微黄，部分大鼠肝叶表面出现米粒状黄色斑点。11周，实验组大鼠肝脏表面略粗糙，质地较硬，边缘变钝，出现大小不一的灰白色圆形结节。15、16周，实验组大鼠肝脏表面更加粗糙，颜色较黄，同时出现散在的深褐色斑点，结节数量增多；整个肝脏皱缩且与周围组织粘连严重，有局部区域出现空泡。并见多数肝叶表面出现深红色充血块状物，有白色包膜。见图2-3。2.4 大鼠肝体比变化结果如表2-2和图2-4所示，对照组大鼠肝体比在整个实验周期内变化趋势平缓；而实验组大鼠肝体比，自第8周起变化明显增大，并持续升高，至16周达到最大。经SPSS15.0软件分析表明：大鼠肝体比实验组与对照组相比，第8周呈显著性差异（P<0.05），第11-16周呈极显著性差异（P<0.01）。表2-2 大鼠肝癌癌变进程中肝体比变化时间(周)肝体比(HIS)对照组实验组24.17±0.0794.22±0.18144.45±0.1544.53±0.17985.11±0.2255.40±1.009*115.20±0.1618.07±0.381*155.19±0.1358.40±0.618*165.25±0.1029.63±1.237*表示与对照组相比呈显著性差异，P<0.05；*表示与对照组相比呈极显著性差异，P<0.01。图2-4 大鼠肝癌演进中肝体比变化*2.5 病理切片的显微观察结果对照组大鼠肝小叶结构完整，肝板排列整齐，肝窦正常，肝细胞间界限清晰，肝细胞大小基本一致，胞质均匀，核大而圆，核仁清晰。依据前人对实验性动物肝癌模型组织病理学分类16-19的研究，结合本实验中大鼠肝脏的病理变化特点，将其组织变化分为五种类型，见图2-5：(1)轻度变性坏死：肝组织结构基本正常，可见少数肝细胞水变性、坏死，并伴有轻度的脂肪变性，肝窦扩张，汇管区周围有轻度炎细胞浸润，此种病理变化2周出现。(2)重度变性坏死：肝组织结构基本正常，肝细胞水变性严重，并有不同程度的脂肪变性。肝窦扩张充血加重。炎细胞浸润范围扩大，由汇管区向周围组织浸润，并逐渐出现纤维组织增生。此种病理变化4周出现。(3)结节性增生：肝小叶结构被破坏，汇管区周围伴有不同程度卵圆细胞及纤维组织增生，向肝小叶内延伸，出现大小不等的假小叶结构。假小叶由排列紊乱异常增生的肝细胞细胞构成，其中包括嗜酸性、嗜碱性及透明细胞。同时伴有胆管上皮增生，数量增多。此种病理变化8周出现。(4)肝硬变：肝小叶结构完全被破坏，出现典型的假小叶结构。结节内肝细胞异型增生明显，病理性核分裂较多。依然伴有不同程度的胆管上皮增生。此种病理变化，11周全部出现。(5)肝癌：主要是肝细胞癌，同时伴有胆管细胞癌。表现为细胞异型，核圆形或卵圆形，核内染色质凝集。细胞排列为索状、腺状、实片状向周围组织浸润。此种病理变化15周有3例出现，16周全部出现。3 讨论肝癌是严重危害人类的疾病，其早期诊断及治疗对改善患者存活率具有重要意义。但是由于肝癌早期症状常不明显，一旦形成便会迅速扩散，所以临床上一旦确诊，大多都为中晚期癌，要获得癌前病变时期的材料非常困难，给研究带来了极大障碍，无法达到早发现、早诊断、早治疗的目的。实验性动物模型的引入为肝癌的研究提供了新的途径。目前已经建立并应用的肝癌模型种类较多，自发性、诱发性和移植性肝癌模型三种，其中使用较多的为诱发性肝癌模型，本实验用 DENA作为诱癌剂，DENA具有很强的化学毒性，所含的亚硝胺基因具有诱癌剂和中毒剂的双重效应，它的特性为诱癌率高，对肝脏的致癌性专一，肝细胞癌所占比例大，是迄今应用最广泛的一种肝癌模型。本实验采用二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine，DENA，DEN）作为诱变剂建立了SD大鼠肝癌变各时期的动物模型，成功的获得了轻度变性坏死、重度变性坏死、结节性增生、肝硬变和肝细胞癌及肝胆管癌五个不同癌变时期的组织学材料。病理形态观察显示，诱癌早期肝脏发生中毒性反应，主要表现为肝细胞变性、坏死；诱癌中期，出现肝纤维化和肝细胞的异常增生等现象，诱癌晚期在结节性增生和肝硬变后形成肝癌。病理演变过程和人类肝癌发生过程相似。本次造模结果较为满意，病理演变过程和人类肝癌发生过程基本相似，这为后续分子实验的准确性和结果的实用性提供了良好的前提。4 结 论本实验成功建立大鼠肝癌变各时期的动物模型并获得大鼠肝癌轻度变性坏死、重度变性坏死、结节性增生、肝硬变、肝癌（包括肝细胞癌及肝胆管癌）五个时期的组织材料，克服了目前国内外对肝癌研究多取材于临床中晚期标本的局限性，为更加全面系统地研究肝癌变的发生发展及分子机理奠定了坚实的基础。参考文献1袁利超，党双锁，程延安肝癌的靶向治疗J 世界最新医学信息文摘，2003，2（6）：881-8832陈华，赵德明，肝癌动物模型实验动物科学与管理， 2005，9（4）：32-343陈惠黎，吴兴中，汤华，等诱发肝癌过程中脂类和磷脂酶动态变化的相关性J生物化学与生物物理学报，1999，29（5）：489-4954韦伟，龚建平，裘法祖正常和异常肝组织增生中细胞增殖与凋亡的关系J中华实验外科杂志，2001，18（2）：156-1585盛学仕，方肇勤，管冬元，等DEN诱发大鼠肝癌过程中肝组织基因表达谱的演变J 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Alternative RNA splicing in he nervous system J.Prog Neurobiol, 2001,65(3):289.致 谢本论文是在导师张红绪教授的悉心指导下完成的。从选题、试验设计实施、论文撰写到论文的完成都倾注着张老师大量的心血和汗水。几个月来，导师严谨的治学态度、广博的知识、敏锐的洞察力、开阔型的思维方式、执着的追求精神和宽厚随和的处世方式时刻影响着我，也必将使我受益终身。感谢王莉师姐，在我论文的完成过程中给予鼓励，指导建议和无私的帮助，在此对师姐表示深深的感谢！感谢曹静师姐，段如冰师姐，李林师姐，赵鹏师兄对我的帮助！也感谢我的搭档丰胜磊，刘琪，苏运章等的热心帮助！感谢培养我的母校河南师范大学，感谢我求知、成长的沃土生命科学学院！感谢我的父母和家人一直对我的关爱和无私的照顾！最后，再次衷心感谢所有关心支持帮助过我的人！祝你们工作顺利、身体健康、生活美满、万事如意！图 版 诱癌11周对照组诱癌8周诱癌4周诱癌2周诱癌16周 图2-1 大鼠体征变化对照组诱癌16周诱癌11周诱癌15周诱癌8周诱癌2周诱癌4周 图2-3 大鼠肝脏组织表观变化正常肝组织（100×） 正常肝组织（400×）轻度变性坏死（100×） 轻度变性坏死（400×）重度变性坏死（100×） 重度变性坏死（400×） 肝硬变 （100×） 肝硬变（400×）肝细胞癌（100×） 肝细胞癌（400×）结节性增生（100×） 结节性增生（400×）图2-5 大鼠肝组织切片结果