免疫表面展示 Dll4 蛋白的家蚕杆状病毒对【推荐论文】.doc

免疫表面展示 Dll4 蛋白的家蚕杆状病毒对小鼠肺癌的抑制作用张浩1，张耀洲25（1. 浙江理工大学生命科学院，杭州 310018；2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457）摘要：Dll4(Delta-Like 4)蛋白是 Notch 信号通路的一个配体，在血管生成过程中起到关键作 用。据研究，在许多肿瘤中如乳腺癌、胃癌等都存在 Dll4 蛋白过表达现象。当封闭 Dll4 通 路时肿瘤会因所生成的血管分支过多，无功能化，无法正常输送氧气和营养从而抑制肿瘤的10生长。将人源 Dll4 基因利用重叠 PCR 方法与家蚕杆状病毒信封蛋白 gp64 的信号肽序列和 跨膜区序列连接。并将该片段插入到 pFastBac1 载体多克隆位点 BamH1 和 Xhol1 两个酶切 位点之间。利用 Bac-to-Bac 系统，构建表面展示 Dll4 蛋白的家蚕杆状病毒。经 WesterBlotting及细胞免疫荧光检测证明重组的杆状病毒在家蚕细胞中表达 Dll4 蛋白。将重组杆状病毒BmN 细胞进行扩增,并将病毒上清液 50000rpm 超速离心 45mins，用 PBS 重悬沉淀，进行 30%15和 60%的蔗糖梯度密度离心，收集区带，脱糖后，取少量制样，进行 Western Blotting 鉴定， 结果表明纯化获得的杆状病毒中含有 Dll4 蛋白。将脱糖后获得的病毒进行蛋白定量后，以 每份 100g 粗蛋白注射免疫 C57BL/6 小鼠。每隔七天进行一次免疫，连续免疫 3 次，第三 次免疫后第二天接种小鼠 Lewis 肺癌细胞。每隔一日检查并记录肿瘤生长情况。接瘤 12 天 后，对实验小鼠眼眶取血，并拉颈处死，剥取瘤体，测量体积。将所取的血清用 ELISA 检20测 Dll4 抗体效价。经检测，在 10g/mL 抗原包被的情况下疫苗组小鼠血清中 Dll4 抗体效 价为 1：3200，而免疫野生杆状病毒组及对照组未检测到 Dll4 抗体。与对照组比较，疫苗免疫组的肿瘤体积约为对照组的 50%，说明免疫表面展示 Dll4 蛋白的家蚕杆状病毒对小鼠肺 癌具有一定抑制作用。关键词：分子生物学；杆状病毒；Dll4；肿瘤疫苗25中图分类号：R73-36+2The inhibition of immuning BmNPV displaying Dll4 to mouse lung canerZHANG Hao1, ZHANG Yaozhou230(1. Zhejiang Sci-Tech University School of Life Sciences, HangZhou 310018;2. Tianjin International Joint of Biotechnology&Medicine, TianJ in 300457)Abstract: It is report that Dll4 have be detected over expression in majority kinds of cancer such as breast cancer，gastric cancer，lung cancer. When blockade Dll4 function results in hypersprouting due to the loss of lateral inhibition of the endothelial tip cell phenotype mediated35through Notch1. As a consequence, an excessive, but nonproductive, angiogenic response is mounted, characterized by poor perfusion that results in hypoxia. Amplified human Dll4 gene and signaol Pepitide, transmembrane area of gp64 with PCR then spliced with overlap extension PCR. Clone the SP-Dll4-TM into pFastBac1 between BamH1 and Xhol1 clonesite, Transformating pPastBac1gp64Dll4 into DH10Bac, choosing white spot culture and extracting Bacmid genome,40using liposome transfect into BmN cell. After six days, cell loat obviously. Extract viral genome, PCR identification. Then transfer the virus in the bottle of BmN,after three days,12000 RPMcentrifugal 30 mins, collect the cells and supernatant, 50000 RPM speed centrifugal 45 min, with PBS suspending precipitation, 30% and 60% sucrose density gradient centrifugation, collecting zone, take off sugar, take a small amount of sample preparation, Western Bloting appraisal. After45taking off sugar , quantitate each 100 g protein immune C57BL/6 mice every seven days,continuous immune three times.the second day after the last immune . Inoculate Lewis lung cancer基金项目：国家高技术研究发展计划“863”项目（2011AA100603）作者简介：张浩，（1988-），男 硕士，基因治疗。通信联系人：张耀洲，(1964-)，男，教授，家蚕生物反应器。E-mail: yaozhoucells in mouse. Every two day inspecte and record tumor growth situation. After tumor 12 days later, taking blood from mice eyes for detecting Dll4 antibody titer with elisa and pull mice neck to death, measuring cancer volume. In the concentration of 10 g/ml antigen ,thevaccine mice50serum Dll4 valence is 1:3200. Comparing with control group, the vaccine immune group of tumor size is about only 50% of the control group.Keywords: Molecular Biology; Baculovirus; Dll4; cancer vaccine0引言55肿瘤综合治疗的重要策略之一就是靶向针对宿主血管系统，抑制肿瘤生长1。最近几年， 贝伐单抗（Bevacizumab Avastin）能够与人血管内皮生长因子（VEGF）结合并阻断其生物 活性，被成功利用于临床治疗多种癌症，包括乳腺癌、结肠癌等2-3 。最近研究发现， Dll4(Delta-Like 4)有选择的在恶性肿瘤组织表皮中过度表达，而在正常的乳腺或结肠表皮中 并未发现异常4-5。几个研究团队在临床模型和实验小鼠模型实验中表明，若封闭 Dll4 信号60通路，由于对血管内皮细胞中出芽细胞侧面抑制消除导致血管过度出芽6。因此，一个过多 的，无功能的血管生长会导致血液流经量减少，无法运输营养物质和氧气，从而抑制肿瘤的 生长7-8。利用 Dll4 特异性抗体堵塞 Notch 信号通道，或者利用 Dll4 可溶性蛋白 FC 融合能 够附束住 Notch 受体，阻滞 Dll4 的激活，这些实验显示了强有力的抗癌效果。那么能否研 制一类以 Dll4 为靶点疫苗来抑制肿瘤的生长？因此，文章利用表面展示 Dll4 的家蚕杆状病65毒免疫 C57BL/6 小鼠，使其体内产生针对 Dll4 的抗体，从而降低肿瘤中 Dll4 的水平，导致 肿瘤血管过多的分支，无功能化，最终达到抑制肿瘤生长的目的。1材料与试剂1.1材料载体 PMD18-TDLL4 购自北京忆翘神舟科技有限公司；C57BL/6 小鼠由中国军事医学科70学院动物研究中心提供；pFastBac1 载体购自 Invitrogen 公司1.2试剂主要试验试剂来源：低糖 DMEM 培养基、胰酶、胎牛血清（Gibico），弗氏佐剂、 TurboFectTM 体外转染试剂、高保真 DNA 聚合酶 Phuscin、各类内切酶 （Fermentas），病 毒基因组提取试剂盒（Sigma）,实时荧光定量 PCR 试剂盒（Roche）。752实验方法2.1PFastBac1gp64Dll4 载体构建以野生家蚕杆状病毒基因组为模板，将信封蛋白 gp64 的信号肽基因和跨膜区基因通过PCR 获得。以 gp64-SP-F /gp64-SP-R 互为引物，PCR 扩增。gp64-SP-F: 5-AGTAGGATCCATGGTAGGCGCTATTG-380gp64-SP-R: 5-ACGCTGCCGCTAACGCCGCAAAGG-3以 gp64-TM-F /gp64-TM-R 互为引物，PCR 扩增。gp64-TM-F: 5-AGTAGGATCCATGGTAGGCGCTATTG-3gp64-TM-R:5-ACGCTGCCGCTAACGCCGCAAAGG-3利用重叠 PCR 将其连接起来。以 SP-Dll4-F，Dll4-TM-R 为引物，PCR 扩增。85SP-Dll4-F:5- TGCCTTTGCGGCGTTAGCGGCAGCGTCCC-39095100105110Dll4-TM-R:5-AATTCGCCTTCAGCTACCTCCGTGGCAATG-3将信号肽 SP，跨膜区 TM 与 Dll4 基因的 PCR 产物割胶回收，进行重叠 PCR。以gp64-SP-F,Dll4-TM-R 为引物，信号肽 SP 和 Dll4 基因 PCR 产物分别 5 l，PCR 扩增。 再将重叠的 PCR 产物回收，同样的方法与跨膜区 TM 重叠 PCR 扩增，获得 SP-Dll4-TM片段。将回收的 PCR 片段用酶切酶酶切切半小时，割胶回收 ，同时将 pFastBac1。重叠 PCR 产物，经割胶回收，将 pFastBac1 载体和回收产物同时用 BamH1 和 Xho1 双酶切，割胶回收， 然后用 Ligation High 连接。经转化大肠杆菌 TG1 感受态，挑斑鉴定，挑取单克隆进行质粒 酶切、PCR 鉴定，并测序。2.2BmNPVgp64Dll4 的获得用构建好的载体 pFastBac1GP64Dll4 质粒 5l 转化 DH10Bac 感受态，42热激五分钟， 加 LB 培养基震荡培养 4 h，均匀涂布于已经涂好 X-gal 和 IPTG 的三抗板上。37避光培养48 h，待蓝斑明显显现，挑去白色单菌落。37震荡培养 48 h，用碱裂解法提取 Bacmid。 将提取获得的 Bacmid 进行鉴定。将鉴定成功的重组 Bacmid 浓度检测符合转染要求，分别 取 8l Bacmid 与 8l 脂质体与已含有 200l 无血清培养基（SF-900SFM）Eppendorf 管中 混匀，室温孵育 20min，取生长状态良好覆盖率为 60%左右的 BmN 细胞，将 Bacmid 脂质 体复合物加入细胞中。28培养 5 天，细胞发病呈圆形，漂浮于培养基。收集细胞，离心，4保存。取病毒上清提病毒基因组，PCR 鉴定。2.3注射用病毒的样品的制备2.3.1杆状病毒纯化将接种病毒 3 天后的细胞收集，先 12000 rpm 离心 30 min，然后 18000 rpm 离心 30 min， 取上清液转移到超离管中，配平，50000 rpm 离心 45 min。用无菌 1ml PBS 重悬沉淀，用移 液枪吹打混匀。先在超速离心管中加入 5 ml 的上一步所获取的含病毒样品的溶解液，然后 在离心管中依次加入 30 % ,60 %的蔗糖,加时用长针头从底部往上加。50000 rpm 离心 1h, 发现在 30 %与 60 %之间有一条明亮的带，用长针头将带都吸取出来，收集起来。再超离去 蔗糖，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻干备用。1151202.3.2蛋白定量将 BSA 标准品完全溶解摇匀。用 PBS 将其 10 l 稀释至 100 l ，使终浓度为 0.5 mg/ml。 将标准品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20l 加到 96 孔板的标准品孔中，加 PBS 补足到 20 l。加适 当体积样品到 96 孔板的样品空中，加标准品稀释液到 20 l。各孔加入 200 l BCA 工作液，37放置 30min。 测定 A562nm 波长的吸收值。根据标准曲线计算出蛋白浓度。2.4C57BL/6 小鼠病毒免疫实验以 C57BL/6 小鼠为实验对象，先对小鼠进行免疫，再接种肿瘤评价其对肿瘤的抑 制效果。将实验对象分为 3 组，第一组为对照组，只注射生理盐水和弗氏不完全佐剂的 1:1 的混合液。第二组为野生杆状病毒与弗氏不完全佐剂混合液，第三组为重组杆状病毒与弗氏 不完全佐剂混合液组。每组六只小鼠，雌雄各半。弗氏佐剂和纯化制备好的病毒粒子在无菌 EP 管中 1:1 混合，用振荡器震荡 10min，再用注射器反复抽吹，乳化半小时，直到白色混合 液静置不分层为止。第一次免疫：每只小鼠以 100 l 计量，于小鼠腋下皮下注射。用 1ml 的注射器，吸取125130135140100 l 乳化好的注射液，在小鼠右掖，皮下注射。7 天后，进行第二次免疫。将小鼠放入金属网格笼内固定，在小鼠大腿内侧皮下注射 100 l 注射液。再过 7 天，进行第三次免疫。在 小鼠另一侧大腿，肌肉注射 100 l 注射液。2.5小鼠肿瘤模型的构建以 C57BL/6 小鼠为实验对象，用小鼠 Lewis 肺癌细胞为瘤源建立小鼠肺癌模型。小鼠 肺癌细胞用 DMEM 加 10% FBS，扩大培养。将长满培养瓶底部细胞加入 3ml 胰酶，在 37培养箱中消化 3min，待细胞都分离脱落后，加入 PBS。用巴氏吸管吹打分散。将消化后 的细胞转移到无菌的 15 ml 离心管中，200 g 离心 5 min。离心后弃去上清，加入适量 PBS， 重悬混匀。取少量细胞悬液和台酚蓝混匀，在显微镜下用血球计数板计数，细胞密度为3×108/ml,以每只小鼠注射 3×107 个细胞注射小鼠。用 5 ml 注射的针头 1 ml 的注射器，于小 鼠腋下皮下 100 l。供食供水，安静饲养，每天观察。2.6小鼠血液中 Dll4 抗体水平检测采用间接法 Elisa 检测小鼠血液中 Dll4 抗体水平。Dll4 蛋白购自于北京亿翘神州公司。 将小鼠眼眶取血，37静置 1 h，4000rpm 离心 4 min。将 Dll4 蛋白梯度稀释 10051200，进 行包被过夜，洗板，37孵育处理后的小鼠血清 1 h，未免疫血清，PBS 为对照。洗板，加 入 Goat-anti-Rabbit 二抗，孵育 1 h。洗板，加入显示剂，显色，加终止液。酶标仪检测。3实验结果1451503.1pFastBacgp64Dll4 载体鉴定如图 1 所示，重组载体 pFastBacgp64Dll4 经 BamH1 和 Xhol1 双酶切条带以及 PCR 条带 位置一致，在 2000bp 左右。实验结果表明 pFastBacgp64Dll4 载体构建成功。由重叠 PCR 连 接的 SP-gp64-TM 片段成功插入到 PH 启动子下。由华大基因测序结果与预计的完全匹配。图 1 重组 pFastBac1gp64Dll4 载体鉴定Fig.1 Identification of recombinant pFastBacgp64Dll4M：Mark；1：以 gp64-SP-F，gp64-TM-R 互为引物 PCR 鉴定；2：酶切鉴定3.2Bacmidgp64Dll4 PCR 鉴定如图 2 所示，泳道 2 为 M13 上下游引物 PCR 鉴定大小约在 4500bp 左右，而泳道 1 和 3分别为 M13F 和 Dll4R， Dll4F 和 M13R 互为引物 PCR 结果。结果表明 pFastBacgp64Dll4155160载体转入 DH10Bac 大肠杆菌中，经 T7 转座后成功的将目的基因整合到 Bacmid 中。图2 Bacmidgp64Dll4 PCR 鉴定Fig.2 Identification of Bacmidgp64Dll4M:Mark; 1. M13F 和 Dll4R 互为引物; 2:M13 上下游引物;3 :Dll4F 和 M13R 互为引物1651701753.3Bmgp64Dll4 病毒基因组 PCR 鉴定BmN 细胞转染 Bacmid 后，细胞膨胀、漂起发病。提取病毒基因组其 PCR 鉴定。如图3 所示 PCR 结果与 Bacmid 的 PCR 结果一致，各条带都在同一位置。结果表明 Bmgp64Dll4病毒构建成功，即该病毒中 PH 启动子下插入 SP-Dll4-TM 基因。图3 Bmgp64Dll4 病毒基因组 PCR 鉴定Fig.3 PCR identification of recombinant Bmgp64Dll4 genomeM:Mark; 1. M13F 和 Dll4R 互为引物; 2:M13 上下游引物; 3 :Dll4F 和 M13R 互为引物3.4Bmgp64Dll4 发病家蚕细胞 Western Blotting 鉴定如图 4（B）Western Blotting 结果显示，重组杆状病毒感染的家蚕细胞泳道 1 中有目的 条带显现，大小约为 70KD，正常家蚕细胞相应泳道 2 没有目的条带。结果表明重组杆状病 毒感染的家蚕细胞中表达了融合的 Dll4 蛋白但在发病和正常细胞中的 PEGE 胶如图 4（A） 中不能看到明显的蛋白条带，或许蛋白表达含量较低。180185190195A B图 4 Bmgp64Dll4 发病家蚕细胞 Western Blotting Fig.4 Bmgp64Dll4 infected BmN cell Westen Blottin（A）Bmgp64Dll4 发病细胞电泳 SDS-PEGE(A) Bmgp64Dll4 infected BmN cell SDS PEGEM Mark；1.发病家 蚕细胞的 PAGE；2.正常家蚕细胞的 SDS-PAGE（B）Bmgp64Dll4 发病家蚕细胞 Western Blotting (B)Bmgp64Dll4 infected BmN cell Westen Blotting M Mark1.发病家蚕细胞 2.正常家蚕细胞3.5Bmgp64Dll4 感染 BmN 细胞中的 Dll4 蛋白的免疫荧光检测细胞免疫荧光检测重组病毒表达的 Dll4 融合蛋白能够在家蚕细胞中表达，如图 5（B） 中绿色荧光主要出在细胞膜上，这说明 Dll4 蛋白主要定位于细胞膜上。而在正常细胞的对 照中未见有绿色荧光，文章中未给出相应图片。这说明融合上的信号肽能够将蛋白引导到细 胞膜上，同时跨膜区也能够将目的蛋白定位于细胞膜上。ABCD图 5. 病毒 Bmgp64Dll4 的 Dll4 蛋白在 BmN 细胞的免疫荧光检测Fig.5 The Bmgp64Dll4 Dll4 protein in BmN cellular immune fluorescence detectionA. Alexc488donkeyantirabbit,anti-Dll4 一抗,DAPI 染色，overlay 激光共聚焦显微镜 400 倍放大。B. Alexc488donkeyantirabbit,anti-DLL ;488nm 激发 C. DAPI 染色 激光共聚焦显微镜 UV 激发，400 倍放大。D. 激光共聚焦显微镜明场 400 倍放大。2003.6病毒 Bmgp64Dll4 超速离心脱糖后 PEGE 及 Western Blotting如图 6（B）所示纯化后的杆状病毒 WesternBlotting 检测在 70KD 左右位置有条带显现。 结果表明，纯化获得的病毒中含有融合的 Dll4 蛋白。说明 Dll4 蛋白展示于杆状病毒表面， 我们可以将其用作为疫苗。205210215220AB图 6. 病毒 Bmgp64Dll4 超速离心脱糖后 PEGE 及 Western BlottingFig.6 Bmgp64Dll4 SDS-PEGE and Bmgp64Dll4 western Blotting(A) Bmgp64Dll4 病毒粒子 (A) Bmgp64Dll4 SDS-PAGE(B) Bmgp64Dll4 病毒粒子 Western Bloting（B）Bmgp64Dll4 western Blotting3.7蛋白定量结果蛋白定量结果为 2 mg/ml。3.8小鼠血液中 Dll4 抗体水平检测用 Dll4 蛋白作为包被抗原在 10g/mL 的情况下 ELISA 检测小鼠血清中抗体效价。如图7 所示，免疫 Bmgp64Dll4 组小鼠效价为 1：3200，而免疫野生杆状病毒组和对照组小鼠的 血清中基本检测不到 Dll4 的特异性抗体。实验结果表明免疫后的小鼠血液中产生了针对 Dll4 的特异性抗体。图 7. 小鼠血清中 Dll4 抗体效价测定Fig.7 Determination of Dll4 antibody titer in Mouse serum3.9小鼠肿瘤体积生长情况将肿瘤视为球体计算体积.如图 8 所示第 12 天平均肿瘤体积分别为对照组 5720mm3,免 疫野生杆状病毒组 5000mm3，免疫 Bmgp64Dll4 疫苗组 3250mm3。结果表明:免疫 Bmgp64Dll4 疫苗组小鼠的肿瘤较对照组及免疫野生杆状病毒组小鼠生长缓慢。12 天后，免疫 Bmgp64Dll4 疫苗组小鼠肿瘤平均体积为对照组的 55%。225230235图 8.小鼠肿瘤生长情况Fig.8 Mouse tumor size图 9. 各实验组小鼠肿瘤Fig.9 Each group Mouse tumor3.10 小鼠接受免疫后体重的变化小鼠注射病毒后行为正常，行动活泼。如图 10 三组实验小鼠的体重增长速度由快到慢 依次是对照组、免疫野生杆状病毒组和免疫 Bmgp64Dll4 疫苗组。说明无论是重组或者野生 杆状病毒对小鼠有一定影响。图 10. 小鼠接受免疫后体重的变化Fig.10 The change of Mouse weight after immunization2402452502552604结论利用 Bac-to-Bac 系统构建了 Bmgp64Dll4 病毒。采用重叠 PCR 将 gp64 蛋白的信号肽和 跨膜区与 Dll4 基因连接。病毒经超速离心，蔗糖梯度密度离心纯化后，能够检测到 Dll4 蛋 白，说明 Dll4 蛋白表面展示于家蚕杆状病毒囊膜上。也有文献报道将目的基因直接插入到 gp64 蛋白中也能够被展示在杆状病毒表面9，但这种展示方法对于目的蛋白的结构和功能是 否会造成影响并不清楚。除囊膜表面展示技术外，衣壳展示外源蛋白亦是一个不错的选择。 将外源基因与衣壳蛋白 VP39 用柔性肽连接并将其连接到多角体启动子后也能够展示蛋白 10。我们将 RFP 蛋白与 VP39 连接，获得了表面展示红色荧光蛋白的病毒。不过这类展示 方法在疫苗生产中并未见有人采用，也不清楚用此法制备的疫苗在动物体内免疫会有何不 同。文章建立小鼠 Lwise 肺癌荷瘤模型，利用表面展示人源 Dll4 蛋白的杆状病毒对小鼠进 行三次免疫，在免疫的小鼠血清中检测到了 Dll4 抗体，疫苗免疫组较对照组肿瘤生长缓慢 一些，抑瘤率达到 45%，许多研究者认为 Dll4 蛋白人源与鼠源的同源性达到 87%，无法产 生免疫效果，但 2011 年 BK Haller11等人的实验结果，及本实验结果都说明能够产生针对 Dll4 蛋白的抗体，这似乎是一个悖论。BK Haller 等人认为是瞬时大量的蛋白进入体内打破 了自身免疫耐受，从而产生了抗体。当然也存在抗体交叉反应的情况，就是人源的 Dll4 蛋 白进入小鼠体内后，诱导出来的抗体既能够中和人源的 Dll4 蛋白也能够与鼠源的 Dll4 蛋白 结合。在给小鼠免疫了杆状病毒后，小鼠的行为没有异常，行动能力也正常，但除免疫 Bmgp64Dll4 组小鼠体重明显较对照组增长缓慢外，未见其他明显副作用。尽管文章检测到 Dll4 的抗体，肿瘤的生长也受到抑制，但并未对肿瘤血管的生长情况进行证明，不能明确表 面肿瘤生长抑制的情况是封闭 Dll4 通路的结果对于其具体原因有待于更深入的研究。参考文献 (References)2652702752801 Gale NW, Dominguez MG, Noguera I, et al. 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