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动物细胞工程,专题2 细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,动物体细胞核移植技术和克隆动物,思考与回忆：1、动物细胞全能性特点？随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？细胞增殖,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,其它动物细胞工程的基础,一：动物细胞培养 二：核移植技术,本节内容：,一、动物细胞培养的应用和概念：,1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,2、原理：细胞增殖,定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。,胰蛋白酶处理,取出组织,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,单个细胞,细胞悬液,转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。,原代培养,3：过程,图示,原代培养,强调一：细胞贴壁过程,细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,强调二：接触抑制,细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。,强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）,细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,几个有关概念：,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,3、总结：动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,配置细胞悬液,剪碎用胰蛋白酶处理,10代细胞,转入培养瓶,40-50代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液稀释,传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）,为什么用胰蛋白酶处理？,分瓶传代培养,原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制,继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。,细胞株：一般说遗传物质未改变,细胞系：遗传物质已改变,原代培养,4.动物细胞培养的条件:,1）无菌无毒 的环境：,适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4,液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。,4）气体环境：,2）营养：,3）温度和pH：,“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。,对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。,问题3：为什么用胰蛋白酶处理？,问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。,问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,问题8、动物细胞培养的原理：,细胞增殖。,问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？,10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,5.动物细胞培养技术的应用:,1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物,植物组织培养和动物细胞培养的比较：,获得杂种植株,用途,物理、化学方法（同左）,生物：灭活的病毒,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（PEG）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,主要用于制备单克隆抗体,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、定义：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.,3、分类：胚胎核移植、体细胞核移植。,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。,动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难,2、原理：动物细胞核具有全能性,4、体细胞核移植过程-示动物克隆-无性繁殖,1.）克隆羊多利培育过程：,另一头绵羊的子宫,特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不可能！因为：一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,供体,受体,代孕受体,1、写出AB所代表细胞工程名称：a表示：b表示:,2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：,体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,3、多利面部毛色是：根据遗传学原理说明判断依据。,4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为,核移植,胚胎移植,白色,多利全部的核基因都来自白面绵羊,aa,取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（M中期）为什么？,激活方法：激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2.）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）,1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,核移植流程:,1、供体细胞的采集与培养,5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。,6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。,4、将供体细胞注入去核卵母细胞,3、显微操作去除卵母细胞中的核,2、受体卵母细胞的采集与体外培养,7、胚胎移植入代孕母牛体内,8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。,4.体细胞核移植技术的应用前景,5.体细胞核移植技术存在的问题,看书P49-50页,下图所示为用两栖动物卵所做的实验图解，据图回答下列问题：,蝌蚪肠上皮细胞核中含有青蛙发育所需的_，重新组合的细胞相当于蛙的_ 细胞，经过_ 和_形成组织和器官。,全部基因,受精卵,细胞分裂,细胞分化,本实验结果说明_具有全能性，图中A过程采用的技术手段称做_。,动物体细胞核,核移植技术,动物细胞融合与单克隆抗体,1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。,一、动物细胞融合,细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。,杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,动物细胞融合,2、诱导融合的因素生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.物理法：电激融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,3、动物细胞融合技术的应用,细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。,思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,人们获得抗体的传统方法是?将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？B淋巴细胞在体外不能无限增殖。,二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备,思考,抗体的传统生产方法,从血清中分离抗体,该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。,多种效应B细胞,动物体内,多种抗体,抗原,单克隆抗体的制备极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。,单抗的制备过程要点：,注射抗原,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,融合,多种杂交细胞,选择性培养基 筛选1,专一抗体检测,克隆化,单克隆抗体,有限稀释法培养 筛选2,1.注射抗原的目的是什么？,注射抗原,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,融合,多种杂交细胞,选择性培养基 筛选1,专一抗体检测,克隆化,单克隆抗体,有限稀释法培养 筛选2,2.诱导细胞融合的手段有哪些？,注射抗原,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,融合,多种杂交细胞,选择性培养基 筛选1,专一抗体检测,克隆化,单克隆抗体,有限稀释法培养 筛选2,3.若细胞两两融合后，有几种融合情况？,注射抗原,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,融合,多种杂交细胞,选择性培养基 筛选1,专一抗体检测,克隆化,单克隆抗体,有限稀释法培养 筛选2,4.第一次筛选出的杂交瘤细胞为何需进行克隆化培养和专一抗体检测？,5.实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞？,有限稀释法稀释多次,稀释,将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。,动物特异性免疫分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）细胞融合三种融合方式:（BB;BG;GG）第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。提取单克隆抗体。,3）、为何要进行两次筛选？,4）、如何进行第2次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。,第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。,问题强化：,1）、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.2、用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,2、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3、单克隆抗体的应用,具有一定的流动性,C,有丝,不变,抗体能与抗原发生特异性结合的特点,例题2（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选)（）AT淋巴细胞 B效应B淋巴细胞 C抗体 D记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是(多选)（）AB淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台 病毒或聚乙二醇诱导 B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克 隆抗体 C体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不 能无限增殖 D单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性明显,BCD,ACD,已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出 杂种细胞，并说原理。方法：。原理：,培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞,加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,例3：,1.动物细胞工程技术的基础是：（）A动物细胞融合B胚胎移植C动物细胞培养D核移植,课堂练习;,在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同,.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞A BC D,C,再见,