体内药物分析方法.ppt

,体内药物分析,Biopharmaceutical analysis,第一章 体内药物分析概述,一、体内药物分析的定义 狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析 广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价,二、体内药物分析的意义,（一）在新药评价 和开发中的意义 1全面质量控制 2新药报批 3为设计新药提供信息 从代谢产物中开发新药 保泰松羟基保泰松（作用强、副作用小）非那西丁扑热息痛 前药设计 新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等 以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决,（二）临床合理用药中的意义 1血药浓度与药理作用,2.影响血药浓度的因素,（1）机体因素 a生理因素 年龄、性别、生理状况 b病理因素 c遗传因素（2）药物因素 a剂型因素（生物利用度问题）b药物合并使用（酶抑、酶促）c时间因素,（三）药物中毒解救的意义（四）兴奋剂检测的意义,三、体内药物分析的对象,3从样品的来源分,1从分析物分,母体药物代谢物内源性物质,2从生物样品种类分,均匀样品 非均匀样品,人体实验动物,四、体内药物分析的任务,（一）方法学的研究（二）治疗药物监测 TDM，therapeutical Drug Monitoring1定义2哪些药物需进行体内血药浓度监测,有效血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效剂量小，毒性大的药物个体差异大，剂量难以控制药物毒性反应与疾病症状相似多种药物合并应用，有中毒危险胃肠道、肝脏、肾脏疾病呈非线性动力学的药物判断患者用药的依从性,（三）药代动力学的研究（四）代谢分型的应用（五）内源性物质测定,五、体内药物分析的特点,1干扰杂质多2样品浓度低3取样量少4工作量大5时间短6有一定设备,六、体内药物分析的发展,1国外发展概况60年代初发现药效与血药浓度关系70年代体内药物分析方法建立80年代至今发展迅猛，新仪器不断涌现书籍出版Drug Level Monitoring1980Therapeutical Drug Monitoring1981Textbook of Biopharmaceutic Analysis1981,2国内情况,80年代初，药物分析工作者倡导，1980年版药物分析教材中纳入部分内容，第二、三版增加体内药物分析一章。第四版、第五版取消，各学校开设体内药物分析课程。80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。,有关书籍,吴如金体内药物分析人卫版1984陆明廉血药浓度测定与临床应用上海科技1986陈刚治疗药物监测理论与实践人民军医1988吴莱文治疗药物监测人卫版 1989曾经泽生物药物分析 北京大学出版社 1998姚彤炜体内药物分析浙大2001张君仁体内药物分析 化学工业出版社2002,3学科前沿,游离药物浓度测定 直接进样方法研究 代谢物测定 对映体分析,第二章 体内药物存在的状态与 体内药物分析的关系,一、药物的体内变化 吸收分布代谢排泄 ADME过程 发生两种变化 物理变化 可逆变化 化学变化 结构和数量发生变化,二、药物与血浆蛋白的结合,1游离型药物与结合型药物（非特异性的结合）在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10与药物 结合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性药物主要与白蛋白结合 弱碱性药物与白蛋白、a1-酸性糖蛋白结合药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）,2血浆蛋白结合率Df+P Db K=解离常数血浆蛋白结合率：=,PDf,Db,Db,Db+Df,1,1+K/np+Df/np,结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。由此可见，K、np是影响的重要因素 np K 药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。,3血浆蛋白结合的测定平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。（1）平衡透析法 原理 计算=100%=Ct-Cf/Ct100%,袋内-袋外,袋内药物,注意事项,a.蛋白质溶液 新鲜血浆 pH7.4，至少三个浓度测定b.缓冲液 0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4 抑制酸性药物与蛋白质结合c.温度与平衡时间 37 1648h 注意防腐剂加入，药物的分解d.透析袋 渗漏检测 3%三氯醋酸e.搅拌 保持动态平衡,影响因素,a.药物膜上吸附b.Donnan效应 由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。c.空白值增加d.缓冲液体积变化，水分进入血浆 游离药浓 此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用,（2）超滤法,原理 计算注意事项 a装置 50l5ml，选择不同型号超滤膜，保湿。b速度与时间 300010000r/min 515min c温度 37，25，4影响因素 a膜吸附 b超滤液的体积 超滤液/总体积0.30.6 c超滤膜温度,三、药物与血浆蛋白结合对体内药物分析的影响,1血浆不同对体内药物分析的影响 2平衡状态不同对体内药物分析的影响 3平衡状态受破坏对体内药物分析的影响4游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响,四、药物代谢,1研究药物代谢的意义了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全 有效研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新 药研究药物相互作用机制有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰,2药物代谢的途径,第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强 第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。,氧化反应 还原反应 水解反应 结合反应 a葡萄糖醛酸结合 b硫酸酯化 c谷胱甘肽缀合 d乙酰化结合 e氨基酸结合,五、药物代谢与体内药物分析的关系,1样品的保存 样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。2分析方法选择 光谱法 色谱法 免疫法3样品的提取、分离法 代谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开 尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）,第三章 生物样品的预处理,一、生物样品的采集与贮藏 体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。,（一）样品的采集,1血样 血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。,血细胞,血浆（plasma）,血小板,血清（serum）,血细胞,测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓,抗凝,自然,全血,血液,2尿样 目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离3唾液 唾液中药浓与血浓相关性 收集方法 离心 收集,（二）样品的贮藏,1血样（血浆、血清）及时分离冷藏，-70加入稳定 剂NaF2尿样 尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4保存 加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变3唾液：同血样,二、生物样品的预处理,（一）预处理的目的 存在形式的多样性 游离 结合 代谢物 浓度低，杂质多（分离浓缩）出现浑浊和沉淀 与试剂起反应 影响色谱柱寿命,（二）处理方法选择的一般原则,1药物理化性质 pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性2浓度范围 灵敏的方法3测定的目的 定性 定量 母体 代谢4生物样品的种类5样品处理与分析方法的选择 专一性 灵敏性,（三）生物样品去蛋白处理,1加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5（NH4）2SO4 NaCl2加入酸性沉淀剂 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点,3组织酶消化法加入酶使蛋白质水解优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化4其他 加热 超滤,（四）生物样品缀合物水解,1酸水解 2酶水解-葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 373溶剂解 某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中,（五）生物样品的萃取,1液-液萃取（1）优点：与杂质分离 简便 浓集 提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取，70%重现性,（3）影响提取率的因素 pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH 提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应 离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取,（4）离子对提取,对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取原理应用阴离子：COOH+SO3H-反离子 四丁基铵阳离子：NH2+反离子烷基或芳基磺酸盐（5）提取技术 一般在试管中进行 有机相与水相比1:1或2:1,（6）乳化问题措施 轻缓振摇 含有分散度大或不溶物应过滤掉 避免在高pH条件下，从水中提取药物 避免使用易发生乳化的溶剂 萃取剂水中加入少量NaCl,破孔方法 机械法 加入少量高级脂肪醇 改变表面张力 改善混合溶剂比例，增加分散相分数,（7）药物的吸附玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷血浆,2液固萃取,固相萃取solid phase extraction SPE针管式 抽空减压 加压 过滤,（1）固相萃取步骤,固相选择 样品1ml 1ml规格固相 125ml 3ml规格固相固相处理 反相C18 固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态上样分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相洗脱待测物 改变pH或极性,（2）影响固相萃取的因素,（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 510mlmin-1 洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）装样 过载 突破性试验 已知浓度样品液 小体积上柱洗脱回收百分率 加大体积洗脱回收百分率 绘图 当回收率下降时为过载,（六）生物样品的组分浓集（七）衍生化处理 GC衍生化 HPLC衍生化,第四章 体内药物分析方法的建立与评价,一、分析方法,根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的,二、分析方法的设计依据,方法的建立,原始方法改进创新创立方法,1做好文献总结2充分了解药物特征及体内状况 pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3明确测定目的、要求目的4结合实验室条件 设备条件 预处理方法,药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物,三、分析方法的建立,1纯品进行测定 确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T）2空白样品测定 确定空白样品是否有干扰3以水代替空白样品，加标准液后测定 了解提取率、检测浓度 确定萃取条件、pH、挥发浓缩等4空白样品加入标准液测定 标准曲线建立 回归方程 回收率5实验样品测定,四、分析方法的评价,可行性和可靠性 1准确度 accuracy 测定结果与真实性的差异 用回收率表示 接近100%相对恒定,绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率考虑3个浓度（高、中、低）分布在标准曲线成上、中、下一般要求绝对回收率在70%一般方法HPLC内标内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值10%,相对回收率方法回收率药物系列浓度+血样标准曲线取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值15%，定量限20%,注意问题：a加入药量与实际测定值相近 b加入物与实际存在状态相近 c空白试验 与已确定方法进行比较,2精密度precision,标准差SD相对标准性偏差 RSD不大于15%，定量限不大于20%日间精密度日内精密度,3灵敏度（sensitivity）检测的最小量,（1）检测限（LOD）从背景中检测到的最小药物浓度：S/N3的绝对量 LOD=3N/S（N噪间 S被测物信号/单位重量）N=1mm 取2gml样品，20l进样 峰度30mm LOD=4ng,（2）定量限(LOQ)在一定精密度和准确度前提下求得最低检测量，通常以标准曲线最低点作为一定量限，也可S/N=10作为定量限，实际测定时，满足35个半衰期浓度，或Cmax1/101/20,（3）最低检测浓度可以进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大小等因素有关最低检测浓度=LOQ/进样体积体内浓度检测限=仪器浓度检测限稀释度 1ml0.1ml 体内检测限=仪0.1 1ml10ml 体内检测限=仪10,（4）提取灵敏度的方法 提取仪器灵敏度 提取进样量 降低仪器噪音 提取浓度程度,4专属法（specificity）选择性同时受试药物合并应用的药物，体内代谢物等5线性范围（Linear range）,6稳定性（stability）（1）长期贮存稳定性-20-70（2）短期室温稳定性室温放置424h（3）冷冻解冻稳定性冷冻解冻冷冻解冻（4）贮备液稳定性贮备液在室温或冷冻条件下,五、应用实例,