王峰答辩幻灯.ppt
新型鱼腥草素衍生物对肿瘤坏死因子诱导的大鼠血管平滑肌细胞及NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响,导 师：欧阳平 副教授硕士研究生：王 峰,2006级硕士研究生,汇报提纲,研究背景,冠心病是危害人类健康的主要疾病之一。动脉粥样硬化(AS)是冠心病的主要病理生理基础，其与炎症之间的关系是学科研究的一个重要领域,AS,内皮细胞功能障碍,平滑肌细胞增殖及表型改变,成纤维细胞增殖,炎症反应贯穿于AS的起始、病变进展及斑块破裂、血栓形成的全过程。炎症是内在和外在危险因素致AS发病，尤其是斑块不稳定并发生破裂的中介和中心环节,肿瘤坏死因子(TNF-)是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的糖蛋白，它是炎症反应的关键调节因子之一，可从多种不同的炎症细胞中释放，在AS发生、发展中起着关键的作用,Syndecan-4是硫酸乙酰肝素类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一，也是血管床的主要蛋白聚糖之一。它广泛表达于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞(VSMCs)、血管外膜成纤维细胞(AF)等,Syndecan-4是由4个独立基因编码的具有组织特异性分布的I型整合膜蛋白，分子量约24KD，包含197个氨基酸序列。在结构上，它主要由3部分组成：胞外域，疏水的跨膜区及胞内域,鱼腥草为三白草科植物蕺菜的新鲜全草或干燥地上部分，是具有长期药用历史的中药材，具有清热解毒、消痛排脓、利尿通淋的功效,鱼腥草素（癸酰乙醛）化学性质不稳定,合成鱼腥草素,新型鱼腥草素衍生物3-(4-甲氧基苯基)-3-氧代丙醛肟甲醚,过敏过敏性休克,研究目的及意义,以抗炎活性单体鱼腥草素经结构改造后获得的一种低毒高效的NHD为观察对象，建立体外细胞培养模型,了解NHD对TNF-诱导的大鼠VSMCs及NIH/3T3细胞的增殖和syndecan-4蛋白表达的影响,争取获得其新的生物活性，为拓宽NHD的临床应用范围，进一步研究其潜在治疗作用提供相关的实验依据,材料与方法,实验材料 SPF级6周龄的SD大鼠 NIH/3T3细胞株 肿瘤坏死因子 新型鱼腥草素衍生物 MTS/PMS增殖试剂盒 兔抗人syndecan-4抗体H-140 ECL Western 显影试剂盒,1.细胞增殖的检测 体外培养大鼠VSMCs和NIH/3T3细胞，应用TNF-和不同浓度的NHD分别或共同作用于细胞24小时，同时设立无药物刺激的对照组，采用MTS/PMS法测定细胞的增殖状态,研究方法,2.Syndecan-4蛋白表达的检测 体外培养大鼠VSMCs和NIH/3T3细胞，应用TNF-和不同浓度的NHD分别或共同作用于细胞24小时，同时设立无药物刺激的对照组，裂解细胞提取蛋白，考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度，利用Western blot蛋白免疫印迹法测定syndecan-4蛋白的表达情况,技术路线,大鼠VSMCs的取材及原代培养,铺96孔板，设立对照组,分瓶培养,细胞同步生长静止,裂解细胞，提取蛋白，Western blot测蛋白表达,MTS/PMS检测细胞增殖率,细胞同步生长静止,细胞至85的融合状态,细胞至85的融合状态,TNF-或（和）NHD刺激24h,TNF-或（和）NHD刺激24h,传至3-6代的大鼠VSMCs,技术路线,铺96孔板，设立对照组,分瓶培养,细胞同步生长静止,裂解细胞，提取蛋白，Western blot测蛋白表达,MTS/PMS检测细胞增殖率,细胞同步生长静止,细胞至85的融合状态,细胞至85的融合状态,TNF-或（和）NHD刺激24h,TNF-或（和）NHD刺激24h,复苏的NIH/3T3细胞,统计分析,应用SPSS13.0软件进行数据录入和统计分析,OD值及蛋白表达量用均数标准差表示,采用析因方差分析，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单向方差分析,组间多重比较，方差齐性采用LSD检验方差不齐采用Games-howell检验,结 果,第一部分 新型鱼腥草素衍生物对肿瘤坏死因子诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan-4蛋白表达的影响,原代培养至1周的大鼠VSMCs(200),实验用的3-6代大鼠VSMCs(200),大鼠VSMCs-actin的鉴定(200),1.NHD对TNF-诱导的大鼠VSMCs增殖的影响,TNF-和NHD各水平下的大鼠VSMCs的增殖率(n=24,Xs),*：主效应；#：交互效应,组间多重比较 NHD4g/mL组及NHD8g/mL组与对照组比较对细胞增殖无影响(P=0.534、P=0.154)TNF-20ng/mL联用NHD4g/mL组及TNF-20ng/mL联用NHD8g/mL组与TNF-20ng/mL组比较有抑制细胞增殖的作用(P0.001、P0.001),蛋白标准曲线回归方程为Y=1.261+0.018X,2.NHD对TNF-诱导的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表达的影响,大鼠VSMCs syndecan-4蛋白电泳图,NHD对TNF-诱导的大鼠VSMCs syndecan-4表达的影响,-actin 42KD,syndecan-4 24KD,lane 1:Control,lane 2:TNF-20ng/mL,lane 3:NHD 4g/mL,lane 4:NHD 8g/mL,lane 5:TNF-20ng/mL+NHD 4g/mL,lane 6:TNF-20ng/mL+NHD 8g/mL,TNF-和NHD各水平下的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白的表达(n=3,Xs),*：主效应；#：交互效应,组间多重比较 NHD4g/mL组及NHD8g/mL组与对照组比较对syndecan-4蛋白的表达无影响(P=0.997、P=0.158)TNF-20ng/mL联用NHD4g/mL组及TNF-20ng/mL联用NHD8g/mL组与TNF-20ng/mL组比较能抑制syndecan-4蛋白的表达(P=0.001、P0.001),第二部分 新型鱼腥草素衍生物对肿瘤坏死因子诱导的NIH/3T3细胞增殖及syndecan-4蛋白表达的影响,NIH/3T3细胞(200),1.NHD对TNF-诱导NIH/3T3细胞增殖的影响,TNF-和NHD各水平下的NIH/3T3细胞的增殖率(n=21,Xs),*：主效应；#：交互效应,组间多重比较 NHD4g/mL组及NHD8g/mL组与对照组比较对细胞增殖无影响(P=0.186、P=0.186)TNF-20ng/mL联用NHD4g/mL组及TNF-20ng/mL联用NHD8g/mL组与TNF-20ng/mL组比较有抑制细胞增殖的作用(P=0.003、P0.001),蛋白标准曲线回归方程为Y=0.568+0.017X,2.NHD对TNF-诱导的NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响,NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白电泳图,NHD对TNF-诱导的NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响,-actin 42KD,syndecan-4 24KD,lane 1:Control,lane 2:TNF-20ng/mL,lane 3:NHD 4g/mL,lane 4:NHD 8g/mL,lane 5:TNF-20ng/mL+NHD 4g/mL,lane 6:TNF-20ng/mL+NHD 8g/mL,TNF-和NHD各水平下的NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白的表达(n=3,Xs),*：主效应；#：交互效应,组间多重比较 NHD4g/mL组及NHD8g/mL组与对照组比较对syndecan-4蛋白的表达无影响(P=0.571、P=0.120)TNF-20ng/mL联用NHD4g/mL组及TNF-20ng/mL联用NHD8g/mL组与TNF-20ng/mL组比较能抑制syndecan-4蛋白的表达(P0.001、P0.001),讨 论,TNF-是炎症反应的关键调节因子之一，在AS病变中其表达上调，其主要作用包括 参与AS斑块由静止状态向活动状态演变，进而斑块破裂的过程 诱导组织分解代谢和血管急性炎症,TNF-,大量增殖、并向内皮下迁移,发生表型改变由“收缩型”转变为“合成型”,动脉血管内膜损伤,VSMCs早期出现损伤、萎缩,VSMCs,VSMCs特异受体,VSMCs表型、生长信号,VSMCs迁移、增殖及表型的改变,血小板,血管壁,单核细胞,淋巴细胞,肽类生长因子,细胞因子,Rauch等研究发现，syndecan-4是凝血酶诱导人VSMCs迁移和增殖反应所必需的成分，凝血酶通过诱导sydnecan-4蛋白表达的上调激活p44/42 MAPK Telci等的研究显示，在组织损伤修复中syndecan-4可与纤维结合蛋白结合，激活PKC后，syndecan-4聚集并与1整合素结合，激活细胞存活机制及RGD依赖的细胞粘附，从而导致MAPK途径激活 Houston等报告了氧化型亚油酸能够刺激大鼠和人的VSMCs增殖并上调syndecan-4的表达,Syndecan-4与VSMCs,Gq蛋白信号转导通路,血管损伤后早期,AF增殖,活性氧类,局部血管缺血、缺氧,AF,1周,Syndecan-4与AF,AF,血管壁机械牵张刺激,syndecan-4脱落的增强和局部粘附的分解,syndecan-4的表达增高,AF从血管外膜迁移到血管新生内膜,Li等的研究显示，在大鼠颈动脉球囊损伤模型中，血管新生内膜和外膜中均有syndecan-4表达的持续上调,即刻到第5d中层平滑肌细胞,第2h到5d外膜成纤维细胞,第14d新生内膜和外膜,Syndecan-4与炎症,Syndecan-4参与的信号转导过程,FGF2与高亲和力的酪氨酸激酶受体相结合起始了这一过程，从而诱导了丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶1/2A型的活化，使syndecan-4在胞质尾的近膜区发生去磷酸化，进而发生寡聚化，syndecan-4与PIP2的结合推动了syndecan-4的多聚化进程及PKC的激活，进一步激活了p44/42 MAPK，从而启动了促细胞增殖的MAPK途径,抗菌,免疫调节,鱼腥草素,抗炎,既往的研究表明，合成鱼腥草素具有以下抗炎作用 降低小鼠耳肿胀和大鼠足肿胀的程度 抑制角叉菜胶引起的正常大鼠及去肾上腺大鼠足肿胀 降低急性炎症渗出，抑制白细胞的趋化和游走 抑制巴豆油致大鼠皮下肉芽组织增生 降低炎足炎症渗出物中前列腺素E的含量 推测合成鱼腥草素的抗炎作用与抑制炎症介质有关,鱼腥草素衍生物,碳链增长,抗炎、抗菌和免疫活性,脂溶性,作用机理可能是鱼腥草素疏水基团与细菌及细胞的膜蛋白发生相互作用,碳碳双键数目,本实验所应用的NHD是以鱼腥草素的-醛酮为基础，借鉴某些具有抗炎、抗菌等活性的芳香族醛酮类化合物的构效特点，在-醛酮与芳香环相连的化学结构骨架上，在芳香环对位引入甲氧基，以求增强其抗炎、抗菌等活性,前期结果 LD50的急性毒性初步试验结果表明KM小白鼠对NHD的最大耐受量为5000mg/kg，毒性不大 NHD对10株临床分离的金黄色葡萄球菌的MIC50和MIC90均为16g/mL，而其MBC50和MBC90分别为64g/mL和128g/mL，抑菌活性优于鱼腥草素(64g/mL)，而杀菌作用也不比鱼腥草素(128g/mL)弱 NHD对8株幽门螺杆菌的抗菌活性(16-64g/mL)强于或相当于克拉霉素(128g/mL)和甲硝唑(32-128g/mL)NHD4g/mL及8g/mL的剂量为我们前期实验结果对大鼠VSMCs及NIH/3T3细胞最适宜的剂量,我们的结果表明，NHD能抑制TNF-诱导的大鼠VSMCs和NIH/3T3细胞的增殖作用，并降低各细胞中syndecan-4蛋白的表达量,TNF-通过与VSMCs及NIH/3T3细胞表面相应的TNF受体结合,刺激syndecan-4蛋白的表达增加,激活p44/42MAPK信号传导通路,导致VSMCs及NIH/3T3细胞增殖,推 测,NHD通过抑制TNF-诱导的syndecan-4蛋白的表达,阻断PKC的激活,抑制p44/42MAPK的磷酸化,导致VSMCs及NIH/3T3细胞增殖的减少,结 论,一定剂量的TNF-能分别刺激大鼠VSMCs和NIH/3T3细胞的增殖及上调细胞中syndecan-4蛋白的表达 一定剂量的NHD能抑制TNF-诱导的大鼠VSMCs和NIH/3T3细胞的增殖作用，并降低各细胞中syndecan-4蛋白的表达量,1.王峰，欧阳平，左琦，彭文烈，贝伟剑，张建兴，赖文岩，许顶立.鱼腥草素衍生物对TNF-诱导的大鼠血管平滑肌细胞syndecan-4表达的影响J.广东药学院学报.2008,24(6):598-6012.王峰，欧阳平，左琦，张建兴，彭文烈，赖文岩，许顶立.新型鱼腥草素衍生物对肿瘤坏死因子诱导NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响J.中药材 2010,1 待发表3.王峰，欧阳平.Syndecans在组织损伤和炎症反应中的分子和细胞机制J.医学研究生学报 已接收，待发表 4.左琦，刘振华，欧阳平，王峰，赖文岩，张建兴，许顶立.重组人白介素-10对肿瘤坏死因子诱导的大鼠血管平滑肌细胞syndecan-4蛋白表达的影响J.中华神经医学杂志 2009,8(3):270-2735.左琦，欧阳平，张建兴，贝伟剑，赖文岩，王峰，许顶立.重组人白介素-10对TNF-诱导的NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响J.广东药学院学报 2009,25(2):113-1166.张建兴，欧阳平，赖文岩，贝伟剑，左琦，王峰，许顶立.冠状动脉支架植入术对急性冠脉综合征患者血浆syndecan-4水平的影响J.广东药学院学报 2008,24(6):605-608,论文发表情况,致 谢,谢谢,
