体内药物分析 生物样品与样品制备.ppt.ppt

1,第一节 生物样品的种类、采集、制备 与贮存一、生物样品的种类、采集和制备,第三章 生物样品与样品制备,2,体内药物分析采用的生物样品包括各种体液和组织，常用的是血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。其中最常用的是血浆或血清，因为它们可以较好地体现药物浓度和治疗之间的关系。,3,（一）血液1.血样的采集 供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。对于病人，通常采取静脉血。当血药浓度高和分析方法灵敏时，也可从毛细管（手指、耳垂、脚趾）采少量血。,4,测定血中药物浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。,5,药物动力学参数测定中常用的取样次数见示意图：,6,（1）血浆(plasma)的制备：血液置含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，淡黄色上清液即为血浆。肝素是一种含硫酸的粘多糖，常用其钠盐、钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。一般1ml的全血需加0.10.2mg的肝素。加入血样后立即轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免导致血细胞破裂。,7,(2)血清的制备 采集的静脉血液置试管中，放置30 min到1 h，由于激活了一系列凝血因子，血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白，血液逐渐凝固，离心后上层澄清的淡黄色液体即为血清。,8,血浆比血清分离快，而且制取的量约为全血的50%60%（血清只有30%40%），多数研究者喜用血浆进行分析测定。若血浆中含有的抗凝剂对药物的测定有影响，则应使用血清样品。血浆只比血清多含一种纤维蛋白原，而血纤维蛋白几乎不与药物结合，因此两者的药物浓度是一样的，且测定血药浓度的方法也是通用的。注意：血浆或血清有溶血时可能会影响测定 药物不稳定时，用血浆更好,9,（3）全血的制备 采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，轻轻混匀，不离心，防止凝血，保持血浆和血细胞混合在一起。需要测全血中血药浓度的情况：测定平均分布于血细胞内、外的血药浓度血浆药物浓度波动大，且难以控制血浆药物浓度太低,10,（二）尿液 尿药测定的目的与血液、唾液样品不同，主要用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度的研究，并可推断患者是否违反医嘱用药，预测药物的代谢过程及测定代谢类型 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物（conjugates）等形式排出。,11,尿液中药物浓度较高，收集量可以很大；因属于非损伤性采样方式，收集方便。但由于易受食物种类、饮水多少、排汗情况等影响，并且在尿液排出过程中，不仅包括肾小球的滤过，还包括肾小管的重新吸收，因此，尿药浓度变化较大，与血药浓度的相关性很不理想。,12,尿药浓度变化大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。,健康人排出的尿液是淡黄色或黄褐色，成人一日的排尿量为1-5L，尿液的密度为1.1051.020，PH值在4.88.0之间。放置后会析出盐类，并有细菌繁殖、固体成分的崩解，因而使尿液变浑浊。由于这些原因，必须加入适当的防腐剂保存。,动物试验中用代谢笼收集尿、粪，只能以时间段采集，有时会有收集不到的情况。,13,尿样 优点：容易获得，属非损伤性取样，且样品量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不需去蛋白处理。缺点：与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。尿样测定多用于药物排泄、生物转化研究。,14,（三）唾液,唾液是无损伤性采样，易收集。一些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓(P)密切相关，因此，在TDM中可利用测定S代替P监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。,15,腮腺分泌水、淀粉酶舌下腺、颌下腺分泌粘液和浆液质的混合液唾液分泌量1200ml蛋白含量为血浆的十分之一PH6.2-7.4，变化大,16,唾液的采集应尽可能在刺激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集，至少采集10 min。采集混合唾液也可用物理或化学的方法刺激，在短时间内得到大量的唾液。非刺激法条件下唾液直接流入容器内，流速慢，仅约0.05 mL/min。物理刺激法唾液分泌流速为13mL/min;化学刺激法是用酸刺激味觉或者毛果芸香碱刺激唾液分泌，流速可达510mL/min。,唾液的采集,17,Crouch研究发现：采集方法对唾液中药物浓度有显著影响，实验证明唾液中可待因的平均浓度在非刺激条件下比酸刺激条件下高3.6 倍，比机械性刺激低50%，是商品化采集装置的77%。,shellee 的实验证明：酸刺激组和非刺激组相比，非刺激组唾液与血液药物浓度相关度(0.901)明显高于酸刺激组(0.872)，说明酸刺激采集对唾液与血液药物浓度相关性有不利影响。,18,优点：不受时间和地点的限制，可反复采集，采集时无痛苦、无感染危险；唾液成分比血液、尿液简单，提取方便，有时可直接上样测定；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。,19,缺点：唾液是各腺体分泌的的混合液体，其组成发生经时变动；因此，唾液中的药物浓度与血浆中的游离型药物浓度相比就容易变动；唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值(S/P)只有少数药物是恒定值。有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比血浆浓度低得多，需要高灵敏度的分析方法才能检测到 对有些患者（昏迷）不能采集唾液样品。,20,唾液在体内药物分析中的应用：唾液样品比血液样品易采集，样品成分简单，前处理方便。有的药物在血液与唾液中的浓度密切相关，可以考虑用唾液代替血液作为药物监测的样本。唾液与血液中药物含量的相关性研究，可以为药物的检测和法医学鉴定提供理论基础 林中等对四种抗癫痫药物在唾液与血清中浓度的相关性进行了研究，结果显示,四种药物在唾液与血清中的浓度之间有较好的线性关系，其 r 分别为:卡马西平0.973 0；苯妥英钠0.955 6；苯巴比妥0.962 0；丙戊酸钠0.928 6，可根据唾液药物浓度来计算相应的血药浓度值。,21,(四)组织,在药物动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器中的分布情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。首先，将检材均匀化，制成水基质溶液，再用适当方法提取：,5.有机溶剂萃取法,4.酶水解法,3.酸水解或碱水解,2.沉淀蛋白法,1.匀浆化法,22,（五）头发,头发样品具有广谱性、积累性、稳定性、依时性、相关性、指纹性 毛发样品取样方便，无伤害，检样掺伪可能性低，能得到以往较长时间的用药情况信息，可用于体内微量元素的含量测定，但预处理复杂，分析对象含量低，需要精密仪器测定。,毛发通过毛根的毛细血管供应营养，药物、微量元素就是从这些毛细血管进入毛发中。,23,滥用药物、抗抑郁药和抗精神病药等药物都有长期用药的方式，由于药物在头发中的积累和储存,为这些药物的检测提供了可能性。,尼古丁、卡马西平、阿米替林、多虑平、安坦、氯丙嗪、泰尔登、三氟拉嗪、氯氮平和氟哌啶醇等精神药物均能进入头发，但进入头发的难易程度是不一致的。药物进入头发的难易程度可能与药物的分子量、极性和脂溶性有关。,指甲与头发类似,24,二、生物样品的贮存与处理,（一）冷藏或冷冻 采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短期保存，可 4 冷藏长期保存，可20 冷冻，不要反复冻融。,小技巧：按测定时需要的体积分装一支！,25,（二）有时，还应考虑加入稳定剂：酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，则应在采样后立即加入酶抑制剂如氟化钠等。抗氧化剂：一些易氧化的药物，可加入维生素C或其它抗氧化剂。如血浆中儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量VC，则能保存10周。奥氮平很容易被空气氧化，因此在样品的储存和提取时加入了25%的维生素C 溶液10ul 作为抗氧剂,26,第二节 生物样品的预处理与制备,进行体内药物分析时，除了极少数情况下只需将样品进行简单处理就可以直接测定外，都要采取分离、净化、浓缩、化学衍生化等预处理技术，为测定创造良好的条件。样品预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困难、最繁复的工作。由于药物在体内存在形式不同、待测药物浓度低、生物介质组份繁杂、待测药物类型众多、理化性质各异等原因，对生物样品的预处理很难规定固定的程序和模式，而必须结合实际情况，采取适当的分离、净化、浓集、化学衍生化等技术。,27,60%以上工作和费用用在样品前处理上,28,（一）将药物从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药物的总浓度（二）将微量药物从复杂的介质中纯化、富集出（三）为适应和符合分析方法所要求的专属性、灵敏度等。（四）防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度、准确度、精密度和选择性等,一、生物样品预处理的目的,29,二、样品制备时应考虑的问题,预处理时要考虑以下问题：,1.被测组分的理化性质、存在形式、浓度范围,2.测定目的,3.生物样品种类和基质干扰类型,4.样品的化学组成,5.药物的蛋白结合率,6.被测组分在预处理过程中的稳定性,7.样品在收集、储存和预处理过程中的容器污染,8.预处理过程尽量简单、尽可能高的精密度和准确度,9.预处理的最后一步应使被测组分富集,10.选用的分析方法是否具有专属性、是否满足灵敏度要求,30,（一）药物的理化性质和存在形式（二）待测药物的浓度范围（三）药物测定的目的（四）选用的生物样品类型（五）样品预处理与分析技术的关系,二、样品制备时应考虑的问题,其中5个重点问题：,31,（一）经有机破坏的方法,1.湿法破坏 硝酸-高氯酸法；电热消化器法；电热板消化法；烘箱消化法。2.干法破坏 高温电阻炉灰化法；低温等离子灰化法3.氧瓶燃烧法,三、生物样品的预处理技术,以上方法将有机物破坏，只能进行元素分析,32,（二）去除蛋白质,目的：去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能，延长使用期限,33,去除蛋白质有以下几种方法,1.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂操作简单，快速，精密度好常用，特别在LC-MS法中乙腈血浆=1.51，99.4%蛋白沉淀，颗粒大，易离心除去 甲醇血浆=3.01，98.9%蛋白沉淀，颗粒小，不易离心除去,2.加入中性盐 常用饱和硫酸铵、硫酸钠,34,3.加入强酸 10%三氯醋酸、6%高氯酸 4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 5.超滤法 蛋白质大分子不能通过半透膜 游离药物 6.酶水解法 枯草杆菌酶，贵，时间长 少用 7.加热法 少用,疑问：2、4法中的盐使溶液的极性更强，药物会游离出？在色谱法中，高浓度的盐会析出，把柱子堵了,35,以上去除蛋白质法仅去除了蛋白质（只起到保护色谱柱的作用），但内源性的杂质都在，样品浓度还被稀释。基本上不能用光谱法测定。若用色谱法分离，干扰严重，就得花更多的精力才能分离好。,对色谱法来说，它不是好方法,36,（三）分离、纯化与浓集,有差别才有可能分离！,生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物、同时服用的其他药物，组成一个极其复杂的混合物。,如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？,37,1.液-液萃取法（LLE）,原理：多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质（差别）。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。,38,采用LLE要考虑的几个问题,（1）溶剂的选择与纯度要求 纯度AR以上 了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用对药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶（光谱分析法）沸点低、易挥发、浓集与水不相混溶无毒，不易燃烧不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）具有较高的化学稳定性和惰性不影响紫外测定 表3-6 毒性大的尽量不用,39,（3）水相的PH值 主要由药物的pKa决定！当pH与pKa相当时，50%药物以非电离形式存在。对于碱性药物，最佳pH值要高于pKa 1-2单位；对于酸性药物来说，则要低于pKa值1-2单位。这样就可使90%的药物以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中！（丙戊酸的pKa4.95）但生物样品一般多在碱性下提取。因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中内源性物质多是酸性的，在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来,（2）有机溶剂相和水相的体积比 11或21 由实际情况决定，文献中有的101以上,40,由于血药浓度较低，提取时需浓集 传统的浓集方法主要有两种：一种是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。另一种是挥去提取溶剂后，再用少量适合的溶剂溶解后测定。,41,补充几点科研中的心得,（1）乳化问题,（2）在水相中加入中性盐，提高萃取效率,（3）在有机相中加入另一种改性的有机溶剂，提高萃取效果,（4）使用EP管作为提取容器,42,衡量提取方法优劣的一个重要指标就是提取回收率，它是指药物从生物样品中被分离出来用于测定的比例，一般应高于60%,中科院上海药物药检所 药物代谢中心 李川博士说“乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%药物的萃取”,43,液-液回提（多次提取）对于碱、酸性药物，在有机溶剂初次提取后，调节适当的pH值，使药物变成离子型，用水把药物回提（反提取）（back extraction）到水相：然后调节水相pH，使药物变成分子型，再用有机溶剂萃取水相中的药物。一些酸、碱性杂质，可用此法除去。光谱法测定时，常采用此法净化样品。但多次提取，得率低,44,离子对提取,一些电离性较强（调PH没用）的药物在水溶液中主要以电离形式存在，很难被提取，此时，若加适当的反离子（counter ion）与其形成离子对（大分子复合物），则成为一种伪中性分子，能从水相进入有机相中，就可用萃取法提取。常用的反离子有：季铵盐 R4N+（阳离子）；苦味酸 C6H3（NO2）3O-有机磺酸盐 CH3-SO3-（阴离子）；常用的提取溶剂为卤代烃类，如CH2Cl2,45,文献上常提到的LLE的缺点,传统萃取方式回收率低、样品用量大、繁琐费时、溶剂用量大、溶剂毒性大、易乳化、不能自动化操作,46,试验设计：现有1.9mL空白血浆，为筛选9种有机溶剂中哪一种对某药物的萃取效果最好，该如何将药物标准溶液加入血浆中？画示意图即可。（9支EP管，每管0.19mL血浆及10L药物标准溶液）,小测试,47,2.固相萃取法,固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。,48,固相萃取的基本原理和方法：SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。,差别,49,关于固相萃取小柱：a.常见的固相萃取柱分为三部分：医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板(20m)和填料(多为40-60m，80-100m)。,b.常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml为例：其中100mg为填料的质量，1ml是空柱管的体积。c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。,50,SPE填料,吸附型:活性炭，硅胶，硅藻土，硅酸镁，氧化铝等。化学键合相硅胶，正相：氨基，腈基，二醇基等；反相：C1，C2，C6，C8，C18，腈基，环己基，苯基离子交换：季胺，氨基，二氨基，苯磺酸基，羧基等。聚合物：苯乙烯-二乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等；乙烯吡咯烷酮和二乙烯萃共聚得到的高分子聚合物。相对于键合相填料，聚合物具有高纯度，高比表面的特点。因而具有比硅胶基质更强的吸附性，适用于全部pH范围，因而用途更广,51,固相萃取操作一般有五步：活化甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一定的溶剂环境。平衡水或适当缓冲液冲洗小柱，保持湿润？上样将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。弃去废液淋洗水或缓冲液最大程度除去干扰物。洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。,亲脂性键合相硅胶SPE柱的实验步骤：,52,53,WATERS公司的Oasis HLB柱（聚合物基质）,54,离子交换树脂,对弱酸性的药物，可在中性或碱性的条件下用阴离子交换树脂提取，用水及有机溶剂清洗后用酸性的溶液洗脱；碱性药物则相反。,离子交换法萃取的回收率常可达90%以上，而且有较好地选择性，但较麻烦，费时。,55,亲水型填料,用作SPE的亲水型填料有硅藻土、硅胶、棉纤维等，其原理为分配作用。填料为支持物，水基质中极性强的成分与填料结合牢固，流动相为与水不相混溶的有机溶剂，较亲脂的药物易分布于流动相，从而达到萃取的目的。,亲水型填料SPE有较高的萃取回收率（大于80%），但洗脱剂用量较大（一般大于5ml），无浓集作用，萃取液较干净。,56,固相萃取装置,真空SPE装置(SPE Vacuum Manifolds)组成：有机玻璃缸体，真空压力表，真空泵，真空缓冲瓶，收集管架，小柱连接头12孔 6500元24孔 11000元,57,96孔板 96孔板是高通量的SPE产品，每孔含少量吸附剂(10-100mg),样品载量约2ml/孔 主要用于生物，医药等行业小量的多样品的净化处理。且多与自动化的样品处理处理装置连用(如Tomtec液体处理工作站)。其基本原理和使用方法与SPE柱相似。,96孔板,58,SPE优点：1、不发生乳化；2、适应的极性范围较广；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶剂用量少；6、易于自动化；7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的应用已比较普遍。,最大的缺点：贵 20多元/支,59,三种方法的优缺点比较,60,以液-液萃取去除内源性杂质的效率最高，固相萃取次之，蛋白沉淀最差。但蛋白沉淀（用有机溶剂）由于操作步骤少，样品处理快，数据精密度高，在有液质的高灵敏度、高选择性作保证的前提下，该种方法使用最多（LC-MS/MS）。,魏敏吉（北大附属第一医院临床药理研究所）综述,另外，在所查的24篇抗癫痫药物的HPLC分析中，溶剂萃取法22篇，蛋白沉淀法2篇，无SPE法！,61,Oasis HLB固相萃取柱王朝虹，公安部物证鉴定中心,乙酸乙酯萃取,高效液相色谱法测定血浆中雷公藤内酯醇,内源性杂质都有,固相萃取与液-液萃取的比较,62,3.自动化SPE技术,自动化固相萃取装置,了解,400 样品/小时 没实际意义,临床药学测定的品种多,仪器昂贵,63,4.固相微萃取法,类似于气相色谱微量进样器的萃取装置,熔融石英纤维上面涂有有机聚合物(如聚二甲基硅氧烷，PDMS),SPME 集萃取、浓缩、进样于一身，极大地提高了分析速度。萃取模式可分为直接固相微萃取和顶空固相微萃取,了解,64,用固相微萃取一气相色谱联用分离、分析尿中痕量毒鼠强。方法的线性范围为10一500ng/ml，最低检出浓度10ng/ml，RSD 1 0%。用该法监测了1例毒鼠强中毒幼儿尿中毒鼠强含量，在中毒后 3 个月内仍从尿中检出毒鼠强成分，适用于临床和法庭毒物分析。,案例：,65,5.膜萃取,徽粒填料薄膜(Particle-loaded membrane)固定相填料有C8、C18键合硅胶、SDB、离子交换剂、碳微粒等；薄膜介质为多孔网状聚四氟乙烯(PLFE)、聚氯乙烯等高分子材料或玻璃纤维。PLM截面积较大，厚度小，压差小，样品流速可达同类型填料柱型SPE 10倍左右，而且在高流速条件下不会像柱型SPE一样造成回收率下降。这主要由于PLM填料粒较小，多为8m，且填料紧密而均匀，稳固不易产生缝隙，每0.5mm薄膜可提供4一9理论塔板数；而SPE柱填料粒径多为40 m，每厘米只能提供5一15理论塔板数。,了解,66,6.微透析技术（Microdialysis）,微透析技术实质上是一种膜分离技术，是一种利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术。,由于微透析针很细，可在基本不干扰生物体内正常生命过程的情况下，直接插到生物活体内采样进行在体(in vivo)、实时(real time)和在线(on line)的取样和检测，用来研究生物体在活动时体液组成的变化。,67,（1）原理,微透析的取样装置主要由注射泵、微透析探针、连接管和收集器组成。将微透析探针埋植于需要取样的部位，用与细胞间液非常接近的生理溶液以慢速（0.5-5l/min）灌注探针，由于半透膜的存在，与蛋白相结合的药物及其他大分子物质不能通过半透膜而被排斥在探针外，只有游离的小分子物质(如游离态药物)会经半透膜弥散进入灌流液而被连续不断地带出，储于样品收集器中，达到在体取样的目的。,68,微透析取样系统的组成(A)及探针取样的局部放大图(B),69,（2）微透析技术的特点,(1)时间分辨性-可连续跟踪体内多种化合物浓度随时间的动态变化，可使药代动力学资料更准确；(2)空间分辨性-取样无需匀浆过程，可真实代表取样位点目标化合物的浓度。同时，可以对同一动物进行多个部位取样，研究目标化合物的体内分布；(3)样品纯净，不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理，与多种分析仪器联用，实现在线持续分析；,70,(4)直接测定游离药物浓度，与血液取样技术相比，游离药物浓度与其药理或毒理作用的相关性更大；(5)可在清醒、自由活动的动物个体上取样，在接近正常生理条件下得到实验结果，更有科学性和实际意义；(6)能够避免传统血液取样后由于体液容量减少而引起的药物PKPD行为的改变，能够实现对组织长时间持续取样而不造成体液损失；(7)组织损伤小，不破坏机体完整性。,71,7.超临界流体萃取 SFE,超临界流体：处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的流体。,超临界流体同时具有气体和液体的双重特点,影响SFE的因素有：温度、压力、提携剂、提取时间等,缺点：特殊的实验设备、使用高纯的超临界流体。,了解,72,尿中药物多数呈缀合状态。含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物；含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酸水解或酶水解的方法。,（四）缀合物的水解,73,3）溶剂解：缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解。,2）酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37数小时，条件温和，选择性强，但费用较高。,1）酸水解：0.1N HCl，100，30min，条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。,为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：,74,值得注意的是，目前对缀合物的分析，逐渐趋向于直接测定缀合物的含量，以获得体内以缀合物形式存在的量，以及当排出体外时，缀合物占所有排出药物总量的比率，从而为了解药物代谢情况提供更多的信息。,75,（五）化学衍生化,药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化。,色谱分析法,光谱分析法？,色谱分析是分离分析方法，大部分样品处理后就可上样分析，但某些药物或代谢物极性大、挥发性低、对热不稳定、与其它物质分离不好或对检测器不够灵敏，因此，需要先进行衍生化反应，然后测定衍生物。,76,1.GC 法中的化学衍生化法,目的：使极性药物变成非极性的、易于挥发的药物，使具有能被分离的性质；增加药物的稳定性；含-NH2、-COOH、-OH官能团的药物常使色谱峰拖尾；为提高对光学异构体的分离能力。,主要的衍生化反应有烷基化、酰化、硅烷化、及生成非对映异构体衍生化法等。其中以硅烷化用得最广泛。,77,常用的烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等；常用的酰化试剂：乙酸酐、丙酸酐等；硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅咪唑（TMSI）等。,78,具有光学异构体药物的分离可采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法进行分析测定。常用的不对称试剂有：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。,79,2.HPLC法中化学衍生化法,高效液相色谱(HPLC)仪在我国已很普及，常配置紫外检测器，但无法分析没有紫外吸收或激发荧光的样品。为了克服此不足，可采用化学衍生技术接入强紫外吸收基团或能激发产生荧光的基团，转化成强紫外吸收或激发荧光衍生物，这样就能够大大扩大使用范围，提高检测器的灵敏度。,80,进行化学衍生化反应要满足如下要求：能迅速、定量地进行，且反应条件温和；选择性高，最好只与待测成分反应，衍生化试剂和副产物不干扰样品的分离和测定；衍生化试剂方便易得，通用性好。,81,从衍生时是否与HPLC 联机，化学衍生化法分为在线(on line)和离线(off line)两种。从衍生化反应发生的场合，可以分为柱前衍生化法、柱后衍生化法。,82,柱前衍生是在色谱分离前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离检测。优点：通常无需考虑衍生反应的动力学因素；衍生化试剂、反应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制，衍生产物易进一步纯化，不需附加仪器设备。缺点：操作过程较繁琐，容易影响定量分析的准确性。,83,柱后衍生化是在色谱柱和检测器之间所接的反应器中进行的，它是一种在线的衍生化方法。最简单的反应器是用玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢等材料制成的管状反应器，适应于滞留时间低于30 s的快速反应。例如：OPA 作为柱后衍生试剂与氨基酸反应，可以消除柱前手动生物不稳定的因素，具有较高的分辨率和灵敏度。缺点：要求衍生化反应时间短，重现性好，使反应条件受到很大的限制；要求反应的副产物及过量的衍生试剂都不应影响检测，使试剂的使用受到限，因为有这些缺点，目前柱后衍生化HPLC 法的应用还不够广泛，但它毕竟是一种自动分离检测方法，有很好的应用发展前景。,84,常见的四种衍生化法：,1.紫外衍生化反应 有的化合物在紫外光区无吸收或吸收系数很小而不能被检测，将它们与具有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下反应，使生成具有紫外吸收的衍生物，从而可以被紫外检测器检测。常用的紫外衍生试剂见表3-11,2.荧光衍生化反应 荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性的检测器，比紫外检测的灵敏度高10-100倍，适合痕量分析。很多药物本身不具荧光，必须与荧光衍生试剂反应，生成具有强荧光的衍生物才能达到痕量检测的目的。常用的荧光衍生试剂见表3-12.,85,4.手性衍生化法：将药物对映体先与高光学纯度衍生化试剂反应形成非对映异构体，再进行色谱拆分。常用的手性衍生化试剂主要有：光学活性氨基酸类，羧酸衍生物类，异硫氰酸酯与异氰酸酯类，萘衍生物类及胺类等。,3.电化学衍生化反应 电化学检测器灵敏度高，选择性强，但只能检测具有电化学活性的化合物。电化学衍生化是指药物与某些试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物，以便在电化学检测器上被检测。一些带硝基的电化学衍生试剂见表3-13.,