分离方法 第7章 色层分离法课件.ppt

第六章 色层分离法,6.1 概 述6.2 柱层析6.3 纸层析6.4 薄层层析,色层分离法又称层析法或色谱分离法，它的最大特点是分离效率高，能把各种性质及相近的物质彼此分离。现代的色谱分离技术就是在此基础上发展而来的。色层分离最早是由波兰植物学家M茨维特系统的提出来的。他在叶绿素的石油醚溶液流经装有碳酸钙的管柱时，发现碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，于是在管柱中出现了不同颜色的色谱带，因此称这种分离方法为色层分离法或色谱分离法。,6.1 概 述,层析法的发展史,6.1 概 述,目前层析法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。层析分离由两相组成：一个是固定相固定不动的一相一个是流动相即携带样品流过固定相的流动体。,“层析的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。”马丁（A.J.P.Martin）（英）,层析分离图示,二、构成层析法的条件 色层法应具备的因素或条件是：1.具有两相 2.混合物中各组分的物理化学性质有差异 3.多次冲洗或展开,三、层析法的分类,根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,凝胶过滤法,分配层析法,离子交换色层分离法,吸附层析法,疏水作用色层分离法,金属螯合色层分离法,共价作用色层分离法,根据操作技术的分类,低压层析技术,中压层析技术,高压层析技术,电泳法,操作压力在0.5MPa-5MPa之间,操作压力在5Mpa-40MPa之间,操作压力小于0.5MPa,靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离,根据固定相的形状不同的分类：,柱层析法,纸层析法,薄层层析法,根据流动相的物态不同的分类,操作方式（展开方式）不同的分类：,气相色谱仪的流程,I-载气系统;II-进样系统;III-色谱柱和柱箱;IV-检测系统;V-记录系统,液相色谱仪的流程,各种层析法的机理及优缺点,6.2 柱层析,一、吸附柱层析二、分配柱层析,柱层析分离法图示,柱层析分离的基本原理,柱层析分离的基本原理示意图,t0,6.2 柱层析,一、吸附柱层析 1.原理 吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其表面具有许多吸附中心（或称吸附位置），吸附中心的数量多少以及吸附能力强弱直接影响其吸附性能。,四、层析法的基本概念,（1）分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值。（2）解离常数 有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值。（3）分离因数 某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数。（4）阻滞因子 分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动 速度（距离）比值。（5）洗脱（容积）溶出体积 在柱色层分离中，使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积。（6）分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比（7）理论塔板 流动相与固定相平均浓度达传质 平衡时的一段柱高。（8）溶量因子 固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比。,分配系数,在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律：Kd=C1/C2 K d为分配系数 C1，C2为两液相中的溶质浓度。应用条件：温度一定 低浓度,解离常数 和 分离因数,）,恒定缓冲液条件下，色层分离的拖尾现象,洗脱容积Ve：,在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积。,理论塔板fr第r块塔板上溶质的质量分数为：,r n E/(E+1)时,r max n E/(E+1),最大浓度塔板r max n E/(E+1),E=,N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移高峰浓度减少、色带扩大。,一、吸附柱层析,当溶质A随着流动相缓缓流过层析柱时，溶质A在两相中不断的进行吸附、脱附、再吸附、再脱附过程。其中，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。,6.2 柱层析,一、吸附柱层析,吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数是不同的。吸附能力强的吸附中心，溶质在其上的分配系数KD较大，溶质分子将首先占据它们，其次再占据较弱的、弱的和最弱的吸附中心。随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心逐渐被饱和，其分配系数也渐变小。,一、吸附柱层析,试样中各种组分的分配系数往往有差异，分配系数较大的组分，在柱中被吸附得较牢，在固定相中保留的时间较长，不易被洗脱下来；而分配系数较小的组分被吸附得较不牢，在固定相中保留的时间较短，最先被洗脱下来。,一、吸附柱层析2、吸附等温线(1)吸附：是指物质在吸附剂表面上集中浓缩的现象。(2)吸附等温线：某种组分在吸附剂表面的吸附规律。包括：线形和非线性。,I）线性吸附等温线,Cm：溶质A在流动相中的浓度Cs：溶质A在固定相中的浓度当溶质A在随流动相缓慢流过层析柱的固定相时，在两相中不断吸附，脱附达到平衡 Cm Cs（吸附平衡）KD=Cs/Cm,Cs 固定相,Cm 流动相,若测定流出液中A的浓度，绘制CV的曲线，则得到洗脱曲线（又叫洗提曲线）。为一对称的层析图谱。,C,V,II）非线性吸附等温线,Langmuir等温线 反Langmuir等温线由于吸附剂表面上具有吸附能力强弱不同的吸附中心，溶质在其上分配系数KD不同。吸附力强的溶液，溶质在其上分配系数大，反之则相反。因此随着强吸附中心被饱和KD 逐渐变小，曲线向下变曲，洗脱时弱的和较弱的先洗脱下来，吸附强的后洗下流出，出现拖尾峰,Cs 固定相,Cm 流动相,Cs 固定相,Cm 流动相,试样中各组分分配系数有差异。利用各组分在固定相上吸附能力的差异，即保留特性的差异把它们分开。保留特性 保留时间 保留体积,3.吸附剂的选择,吸附剂应具有合适的吸附力。颗粒均匀、大小适宜。吸附与解吸可逆。不含杂质。不溶于所使用的溶剂（即洗脱剂），与欲分离的物质不发生化学反应。,常用吸附柱介质的分类,无机物吸附介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。聚合物吸附介质有：琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等,（1）Al2O3（中性、酸性、碱性）,I）分类中性：适用于醛，酮，醌，酯，内酯及苷的分离酸性：酸性化合物如酸性色素，氨基酸等碱性：生物碱，醇及其它中性和碱性物质一般地，能用酸性或碱性Al2O3分离的也能用中性Al2O3分离,II）活性 活度级I级增强 吸附能力 I 减弱 在不同的温度下活化氧化铝：加热至 100150 活化有一定活性 150 III级 300400 IVVI 600 脱水开始烧结每一批Al2O3表面积和表面孔结构不一致，活性不同一般，分离极性较强的组分用活性弱的吸附剂；分离弱极性的组分用活性强的吸附剂。,（2）硅胶,弹性多聚硅酸脱水制的 硅氧烷不具吸附性表面孔穴较小的硅酸吸附能较强用途：微酸性，吸附能力较Al2O3 弱，可分离酸性和中性物质，如有机酸，氨基酸，萜类，甾（胆固醇及激素属于甾类化合物）类,弹性多聚硅酸脱水 OHOH SiOSi SiOH SiSi 硅氧烷 游离型硅酸醛 束缚型 活泼型 硅酸醛 硅酸醛 a b c d,（3）聚酰胺,乙内酰胺聚合：聚己内酰胺，锦纶可与酚类，酸类，醌类，硝类化合物形成氢键而分离。形成氢键基团的吸附能力大对、间位形成氢键邻位（空间位阻）芳香族由于共轭吸附能力大,由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 中性不带电水溶性线状多糖高亲水性，含大量羟基能制成多孔性凝胶，分离大分子制备：去除带电琼胶成分 将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。采用交联剂增加介质的机械强度,（4）琼脂糖,（5）葡聚糖,-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒性质：（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）（2）化学稳定性及热稳定性好（3）孔度与机械强度与交联度有关（4）用于凝胶过滤分子筛应用：水溶液中分离蛋白质等,（6）纤维素,-1,4 相连的D-葡萄糖（偶而有1，6 键合）线性天然高聚物（1）亲水（2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度大孔珠状纤维素（1）高孔度（2）高机械强度（3)亲水性强 应用：离子交换分离蛋白质介质,性质：（1）丙烯酰胺与交联剂N,N-甲叉双丙烯酰 胺共聚（2）烷烃骨架与酰胺侧链（3）控制交联剂比例可控制网格孔度（4）亲水好，但不如多糖介质(5)机械强度差应用：（1）凝胶过滤（2）电泳介质,（7）聚丙烯酰胺,4、流动相及其选择,(1)洗脱过程实质：流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性组分选强极性的流动性洗脱，反之相反。(2)功能团极性：有机分子基本母核相同时，取代基极性增强，整个分子极性增强；极性基团增多，整个分子极性增强。分子中双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力强。分子形成内氢键，吸附力弱于不能形成内氢键的化合物。,烷烃（CH3，CH2）烯烃（CH=CH）醚类（OCH3，OCH2）硝基化合物（NO2）二甲胺酯类（COOR）酮类（C=O）醛类（CHO）硫醇（SH）胺类（NH2）酰胺 醇类（OH）酚类（ArOH）羧酸类（COOH）,（3）常用流动相极性：石油醚环己烷二硫化碳CCl4三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸在某些情况下可用混合流动相聚酰胺柱层析可采用水溶液：乙醇水溶液，丙酮水溶液等溶解试样用的溶剂极性应与流动相相近,5.洗脱方法及流出曲线 有色物质分离的洗脱方法 推出法：有色物质分离后，将吸附剂从柱中推出，用刀按层切开，分层洗脱再定量。无色物质分离的洗脱方法及流出曲线 无色物质分层后，可采用流出曲线加以判断。流出曲线：以物质浓度为纵座标，以收集的洗脱液体积为横座标，得出的曲线。,洗脱方式：柱层析中按洗脱剂的不同可分为以下三种：设样品中含有A、B两组分，前者吸附力弱，即样品与固定相吸附力AB。洗脱法 洗脱剂：纯溶剂 最初流出纯溶剂，尔后是吸附力较弱的A，最后为吸附力较强的B组分。迎头法 洗脱剂：原试样溶液 最初流出纯溶剂，一定体积后，吸附力较弱的A组分开始流出，一段时间后，吸附力较强的组分B与A 一起流出。置换法 洗脱剂：置换剂（即内含吸附力更强的吸附剂）。先置换A，再置换B。,柱层析的洗脱方法,洗脱一般有三种方法：恒定洗脱法：逐次洗脱法：梯度洗脱法：梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。,恒定洗脱,分 步 洗 脱,梯 度 洗 脱,洗脱剂的选择,样品在溶剂中具有一定溶解度。一般采用无水溶剂，且与水不互溶。溶剂沸点适宜。纯度要高，无杂质。,二、分配柱层析,分配柱层析是根据欲分离组分在两种互不混溶或部分混溶的溶剂间的溶解度差异来实现分离的。这两种互不混溶的溶剂一个是流动相，另一个被吸收在载体中，被称为固定相。流动相载着试样中的各种组分沿着层析柱流动时，试样中的各种组分就在流动相和固定相间进行分配，当不同组分的分配系数有差异时，它们在层析柱中的前进速度就不相同，于是得以分离。,一、层析的原理,层析法是利用物质在两相中的分配系数（由物理化学性质：溶解度、蒸汽压、吸附能力、离子交换能力、亲和能力及分子大小等决定）的微小差异进行分离的方法。当互不相溶的两相作相对运动时，被测物质在两相之间进行连续多次分配，这样原来微小的分配差异被不断放大，从而使各组分得到分离。或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而得到逐步分离。,二、分配柱层析,1.原理 分配层析是根据混合物中各组分在两种不相混溶的溶剂间溶解度（即分配系数）的不同，使各组分得以分离。分配系数K：当溶质在两种不相混溶的溶剂中达到平衡时，溶质在两种溶剂（即两相）中的浓度比值为一常数，称做分配系数。各种组分具有各自的分配系数K，同一物质，温度不同时，K不同。在分配的各组分中，某组分K，则固定相中浓度，后出柱。,2.固定相与流动相 固定相：由支持剂和液体（多为水）组成。流动相：一般是有机溶剂。鉴于固定相、流动相均为液体，故分配层析为液液层析。当流动相是水或水溶液，固定相液体是有机溶剂时，称为反相分配层析。,分配柱层析,常用的载体有：硅胶、纤维素、硅藻土等；常用的固定相有：水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂。流动相一般是与水互不相溶的有机溶剂，如正丁醇、正戊醇等。分配柱色谱常用来分离极性极强的、亲水性的物质，如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等。,3.移动速率 主要是用于比较各组分移动速度的大小，即在同一时间内，各组分移动距离的大小，作为定性之用。=,6.3 纸色谱,特点：微量操作技术，简便、分离效率高，但分离速度慢。,纸色谱(Paper chromatography)是在滤纸上进行的色谱分析法。一、定义 将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法。纸色谱是在纸上进行萃取的色谱，它和萃取一样，也是根据不同物质在两相间的分配比不同而进行分离的（相当于逆流萃取）。,6.3 纸色谱,6.3 纸色谱,二、基本原理固定相（展开剂）滤纸：滤纸是一种惰性载体，滤纸纤维素中吸附着的水或其它溶剂作固定相。流动相：沿着滤纸流动的溶剂(一般为有机溶剂)。试液点在滤纸上，在层析过程中，试液中各组分，因其在两相中的溶解度不同，(也就是 分配系数KD 不同)，因而得到分离。其原理与萃取相似。它是一种分配层析。在固定相与展开剂之间反复溶解。在固定相中溶解度大，在展开剂中 S 小的，在纸条上移动慢，停留在纸条的较下端。,1.层析缸 2.滤纸 3.原点 4.展开剂 5.前沿 6.7.斑点,6.3 纸色谱,1.纸色谱的基本原理,x,y,Rf的计算,2.比移值Rf,组份分离后,它们在滤纸上的位置用比移值Rf 表示。,定义:,6.3 纸色谱,比移值Rf的大小取决于各组分在二相间的分配系数及滤纸的性质。不同的组分具有不同的分配系数,因而也就有不同的Rf。这就是定性的依据。,3.影响Rf的因素,(1).欲分离物的本性:物质在两相的分配系数,决定了它的Rf大小;,6.3 纸色谱,(2).展开剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。通常应选这样的层析剂，使溶质的Rf在0.05 0.85之间,不同组分的Rf差值0.05.,(3).pH:影响它们的存在状态,(4).滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质,3.影响Rf的因素,(5).温度:在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过 0.5oC,(6).展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf较小，环行法的 Rf也不大。,3.影响Rf的因素,操作技术(1).载体(滤纸)滤纸的选择 a.要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐 b.要求滤纸的纤维松紧适宜 c.滤纸的杂质含量少,6.3 纸色谱,层析滤纸的性能与规格,滤纸的处理 以0.1 0.4 mol/L HCl(或 2 mol/L HAc)浸泡数小时,除去无机杂质后,取出用蒸馏水洗净,再将滤纸放在丙酮-乙醇(1:1)中浸泡一周时间,除去有机杂质,再取出风干备用。,操作技术,6.3 纸色谱,（2）固定相 纸层析以吸着在纤维素上的水作固定相。反相纸层析用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。,(3).试样 A.试样的溶解 尽量避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体样可直接点样。,操作技术,点样方法a 先用铅笔在距纸条一端2 3 cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下示意图：,b 点样工具：微量注射器、毛细滴管（0.5 mm)；,c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样的斑点直径为0.2 0.5 cm,每次点样2 20 m于滤纸上，以冷风吹干；,d.干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。,点样方法,C.展开 展开剂的选择欲分离物在两相中的溶解度；展开剂的极性展开剂与欲分离物间应无化学反应欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到,b.常用的展开剂水、饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等。,c.展层方法展层前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。,上行展开法,将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但不能浸没点样处）上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3 4 cm 时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）,对于 Rf 十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法。,纸条的上端暴露在层析缸外，以便令上升的溶剂挥发；只要保持纸条下端与溶剂面接触，溶剂便能不断地上升而挥发，展层过程就自动连续地进行；若溶剂沸点100oC，则可在纸条暴露部分用红外灯烘烤，促使溶剂挥发；该法不能测量前沿，但可达分离的目的。,玻片,玻璃棒,原点,玻皿,剪成锯齿状，便于溶剂滴下,b.下行展开法,溶剂自纸的上端向下降（借助于重力的作用），具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。,C.环行法 又叫径向色谱法。这是一种既快又方便的方法。取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。,d.双向展开法,有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。,若前后二次展开剂选择适当，可使各种组份完全分离。例如，氨基酸的分离可用此法。双向展开法也可以二次使用同一种展开剂展层。,D.显色,展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作记号,a.有色物：直接观察各个色斑,无色物：物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。,.分析定性分析：实验条件，各物质有各自的Rf。为了查明未知物的组成，最好是在同样条件下与已知的纯物质做对照实验。,化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂，若被分离的物质含有羧酸，可喷酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。,x,y,Rf 的计算:Rf=x/y,x1,x2,y,Rf 的计算:Rf 1=x1/yRf2=x2/y这样每一个斑点用两个Rf 来描述,定量分析剪洗法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用各种仪器方法（如红外、紫外、原子吸收、发射光谱），也可将斑点剪下灰化，再用适当的溶剂溶解，测之。比较法：经纸色谱将各种组份分开后，可在相同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比较，确定其可能的含量。,反射散射光谱法：物质受光照射时，通常发生两种不同的反射现象（即镜面反射与散射）。镜面反射同镜子反射一样，光线不被物质吸收，反射角等于入射角；散射则必须满足Kubelka-Munk 方程式：其中，R=IR/I0，I0、IR分别为入射光与散射光强度，S 为反射系数，K为线性吸收系数，为被测物的摩尔吸光系数，C为被测物的物质的量浓度，K=/S。仪器上显示的反射散射吸收值为AR=lg I0/IR=lg 1/R 由上可建立方程组：,（2）式代入（1）式，得：,（3）式即为反射散射吸收光谱测量值F与C的定量关系；若以F为纵坐标、C为横坐标，则可得一截踞为2的直线，斜率为K。,图1.反射散射附件的光路示意图M:反射镜;S:样品:PC:光电管,1,2,3,4,s,M,PC,M,1长颈漏斗，2滤纸，3垫板，4抽滤瓶,F.应用,例氨基酸的分离（固定相为水）,例2.糖的分离(固定相为水),例脂肪酸的分离（固定相为水）,例4.胺类的分离（固定相为水）,例5.醇、酚的分离（固定相为水）,例 核酸降解物（核苷酸、嘌呤、嘧啶碱基）的分离（固定相为水）,例.其它类的分离（固定相为水）,例8无机应用（固定相为水）,例9生物学应用,Fe,Cu,Co,Ni,Ni,Ni,Ni,Ti,Mo,黑毛,红毛,黄毛,白毛,兔毛的色谱图,以兔毛作实验，分离结果如右图。,取不同颜色兔毛(300 500 mg),干法灰化,溶于稀HCl 中,用丙酮:丁醇:HCl=10:4:2,展开后,显色,用纸色谱法分离A、B两种物质，在某条件下两物质的比移值Rf分别为0.36、0.40。设A、B两物质斑点的直径分别为0.2 cm,0.4 cm,当展开剂的前沿达到10 cm时，A、B能否完全分离?,解：设A、B两物质色谱斑点的中心距原点分别为x1,x 2 cm,则 x1/10=0.36 x2/10=0.40 x2-x1=(0.40-0.36)10=0.4(cm)欲分离两物质，两斑点中心距离至少为(0.20+0.40)/2=0.30cm,而实际两斑点中心距离为0.4 cm,故在此条件下A B两物质可得到完全分离。,用纸色谱法分离A、B两种物质，在一定条件下A、B两物质的比移值分别为0.35,0.45，设A、B两物质色谱斑点的直径分别为0.50cm和0.80cm,要求展开剂前沿至少达到多少厘米时，A和B才能完全分离?,设x1,x2分别为AB两物质斑点距原点的距离：则 x1/y=0.35 x2/y=0.45 x2-x1=0.40+0.25=0.65又 x2-x1=(0.45-0.35)y=0.65 y=6.5(cm),纸色谱法分离混合离子,若混合离子极性大小顺序为ABC,用弱极性有机溶剂展开后其Rf值大小顺序为_。,C,B,A,6.4 薄层色谱法,原理和特点,原理:当展开剂从薄板上固定相的空隙中通过时,由于各组分的K的不同和足够多次的分配.,特点:装置简、操作方便展开时间短样品负荷量大、斑点扩散少,缺点：Rf值的重复性差,克服办法：标样和试样在同一块板上展开,同一张色谱图可用不同的试剂显斑，也可用浓硫酸等强氧化剂或在400 500 加热碳化检出。,吸附剂（固定相）决定吸附性能的因素：吸附剂的化学组成、活性、表面积,要求：合适的吸附力与展开剂、被吸附物质均不起化学反应粒度细小而且均匀（范氏方程，减少涡流扩散项）,(1).氧化铝氧化铝呈微弱碱性，酸性较强的化合物在氧化铝上吸附的很牢（所以，酸性物质分离不好），故通常用于分离碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定的中性物质、碱性物质。,一般要求薄板用的活性为 级,氧化铝的活性与含水量密切相关（含一定量的水份时，吸附剂表面的吸附中心回被水分子占据）,故加热驱除水活化；加入一定量的水失活,100 150oC,除去Al2O3中与羟基结合的部分水份，使Al2O3有一定的活性150 300oC，Al2O3活性达 级300 400oC，Al2O3活性达 级 600oC，Al2O3进一步脱水并开始烧结,由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批生产的Al2O3，其表面积和表面孔穴结构并不一致，活性也不相同。,Al2O3活性的测定：取20 L染料溶液（偶氮苯30 mg、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各20 mg，溶解于50 mL CCl4中），加到薄板上，用CCl4展层，根据下表确定活性。,市售的供薄层色谱用的Al2O3有:Al2O3 H氧化铝中无粘合剂Al2O3 G氧化铝中含煅石膏（一般5煅石膏）煅石膏CaSO4，作为粘合剂Al2O3 HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示剂（在254 nm下呈黄绿色荧光）Al2O3 GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示剂（在254 nm下呈黄绿色荧光）上述商品可以直接调料涂敷（1份料，2份水调合）,（）硅胶（吸附性较Al2O3弱）,硅胶是微酸性吸附剂，且适用于酸性、中性物质的分离（如有机酸、氨基酸、萜类、甾体）碱性物质则能与硅胶作用（当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好的分离）,注:硅胶薄层的活化温度不能高于200oC,硅胶的结构为:,硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各40mg溶于100 mL 苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开10 cm，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，其Rf值分别为：二甲黄0.58，苏丹红0.19，靛酚蓝0.08（展层时间30 45 min），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与Al2O3活性 级相当。,薄层用商品硅胶有：硅胶H（不含粘结剂）、硅胶G（含粘结剂煅石膏）、硅胶HF254（含荧光物质的硅胶）硅胶GF254（含有煅石膏和荧光剂）,此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。,(3).选择吸附剂的规律：,极极性物质被极性表面的吸附剂吸附；亲亲水性的吸附剂适用于在非水溶液中吸附物质疏疏水性的吸附剂适用于在水溶液中吸附物质,展开剂（流动相）,展开剂的洗脱作用实质是展开剂分子与欲分离组分竟争占据表面吸附中心的过程。强极性展开剂分子占据吸附中心的能力强，所以，有强的洗脱作用，非极性展开剂分子占据吸附中心的能力弱，所以，有弱的洗脱作用。（1）常用展开剂的极性：石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇吡啶酸,（2）欲分离组分的极性饱和碳氢化合物系非极性化合物，不被吸附或吸附不牢。在其结构中引进某些功能团则极性增加。取代基团极性越强，整个分子极性越强。常见功能团按其极性增加的顺序是：烷烃烯烃醚类硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸类,当有机分子的基本母核相同时，极性基团越多，整个分子的极性越大分子的双键越多，吸附能力越强；共轭双键越多，吸附能力越强分子中取代基团的空间排列对吸附性也有影响，如同一母核中羟基处于能形成内氢键位置时，其吸附能力弱于不能形成内氢键的化合物,（3）展开剂的选择,4.操作技术,（1）制板,玻璃板 a.平整、去油、去污（可用浓H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干）b.玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选择，小的可用2.57.5cm的载玻片,大的可用20 20cm的玻片。,涂布液 取一定量的吸附剂放入研钵中，加入需要的水或适当的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，即成胶状物，色泽洁白为最佳，立即倾入玻璃板上，用下述方法涂布。涂布方法 玻棒涂布 玻片刮涂 倾斜涂布（利用流平性）：简单，但均匀性差 涂布器,活化 薄板首先风干，否则湿板一下加热到高温，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。氧化铝G板在150 160oC,烘4小时(级左右)硅胶G板在110oC烘1小时 薄板经活化后，一定要储藏在密闭的干燥器或烘箱中备用。,(2)点样适当的点样量，集中的斑点是得到一个好的色谱的必要条件。如何才适当？不同的分离要求、不同的薄板（有厚有薄）、不同的吸附剂（性能不一），需要不同的点样量。从下图可见：点样量少了，不易检出；点样量多了，易拖尾或扩散，影响分离效果。,0.1,2,50,300,0.5,0.3,0.1,Rf,g,纯物质的鉴定，若又有高灵敏度的显色剂，点样量只需g或ng；若进行天然物或中间产物的分离时，点样量需50 g几百微克；若进行制备色谱，进样量可达1mg。点样时可用内径约1mm，管口平整的毛细管或微量吸管吸取试液后，轻轻接触板面，分数次滴加样品。,注意点：a.溶解试样的溶剂最好是挥发性的b.点样宜分几次点加,即点一次后,用吹风机的冷风吹干,再点,再吹干,.,反复,直到点完所要求的量c.点样量的体积尽可能小些(2 10L左右)d.点样最好是在密闭的室中或比较干燥的环境下完成,避免薄板吸水降低活性.,15cm,2.5cm,1.5cm,溶剂前沿,（）展层薄层的展开需在密闭的器皿中进行，密闭容器应用展开溶剂予先饱和。展开方式和纸层析相同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平式（与平面成20 10oC角）的上行或下行的展层而不能垂直展层。,把点好样品的薄板浸入0.5cm深的适宜展开剂中，当展开剂移动至离起点约10 20cm处(约30min)，将薄板取出放平，用铅笔或小针记下溶剂前沿的位置后，在室温干燥或烘箱内干燥，测其Rf值。,注意：每次的展层距离要固定，以便Rf值的重复,（）检出,a.本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜色 b.本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色的荧光 c.薄板本身有荧光（硅胶HF254+366,硅胶GF254,.),欲测物吸收紫外线,在荧光背景下呈暗色,d.多数有机物,喷10 50%H2SO4(或铬硫酸)并在100 120oC加热,使有机物碳化,观察加热中有机物颜色变化及碳化斑点位置,可以推断物质的化学性质e.喷显色剂或荧光试剂（不含粘合剂的薄板不能喷，只能浸，以免把吸附剂吹散）,表 主要显色试剂,5.应用,(1)氨基酸分离薄层:硅胶G板;流动相:正丁醇:醋酸:水=3:1:1Rf值:丙氨酸0.27,氨基辛酸0.60,精氨酸盐酸盐0.08,磺基丙氨酸0.14,胱氨酸盐酸盐0.16,二羟基苯丙氨酸0.45,甘氨酸0.22,组氨酸盐酸盐0.06,羟脯氨酸0.20,亮氨酸0.47,甲硫氨酸0.40,颉氨酸0.36,苯丙氨酸0.49,脯氨酸0.19,肌氨酸0.17,苏氨酸0.25,色氨酸0.56,(2)核苷,核苷酸,寡核苷酸的分离薄层:硅胶F254 流动相:正丁醇:HAc:H2O=5:2:3Rf值:腺苷-5-磷酸0.35,胞苷-5-磷酸0.24,脱氧腺苷-5-磷酸三氯乙酯0.74,脱氧胸苷酰(3,5)脱氧胸腺嘧啶核苷0.61,5-甲基尿苷-5-磷酸酯(胸苷-5-磷酸)0.37,5-0-磷酸基脱氧胸腺嘧啶核苷酰-(35)脱氧胸腺苷酰-(3,5)脱氧胸苷0.19,5-0-三氯乙基-磷酸脱氧腺苷酰(3,5)脱氧腺苷0.68,尿苷-5-磷酸0.30,(3)类固醇、固醇的分离薄层：Al2O3 流动相：C6H6:乙酸乙酯=4:1Rf值:胆甾醇0.83,别色胆甾醇0.77,-谷甾醇0.63,豆甾醇0.62,-谷甾烷醇0.44(4)碱金属的分离薄层:硅胶卷 流动相：含0.1mol/L I2 的硝基甲烷:C6H6=40:60Rf值:Cs+0.55,Rb+0.47,K+0.36,NH4+0.24,Na+0.18,Li+0.06,在薄层色谱和纸色谱中，Rf 定义为_,两物质的Rf相差_,就可能彼此分离。,原点至层析点中心的距离,0.02 原点至溶剂前沿的距离,