生物传感器课件.ppt

生物传感器,1,ppt课件,是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术。应用领域：环境监测、食品分析、生物医学,2,ppt课件,3,ppt课件,开端于20世纪60年代。1962年克拉克等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果,最早提出了生物传感器(酶传感器)的原理。1967年实现了酶的固定化技术,研制成功酶电极,这被认为是世界上第一个生物传感器20世纪70年代中期，生物传感器技术的成功主要集中在对生物活性物质的探索、活性物质的固定化技术、生物电信息的转换以及生物传感器等研究，如Divies首先提出用固定化细胞与氧电极配合，组成对醇类进行检测所谓“微生物电极”。1977年，钤木周一等发表了关于对生化需氧量(BOD)进行快速测定的微生物传感器的报告，并在微生物传感器对发酵过程的控制等方面作了详细报导，正式提出了对生物传感器的命名。,4,ppt课件,生物传感器(biosensor)是利用某些生物活性物质所具有的高度选择性来识别待测化学物质的一类传感器。生物传感器通常是指由一种生物敏感部件和转化器紧密结合，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。它是对物质在分子水平上进行快速和微量分析的方法。,5,ppt课件,1.原理,生物传感器的结构一般是在基础传感器(如电化学装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探头表面上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏感物质上时，形成复合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通电化学装置能感知的O2、H2、NH4+、CO2等或光声等信号，并通过信号转换元件转换为电信号。,6,ppt课件,7,ppt课件,生物敏感膜,利用生物体内具有特殊功能的物质制成的膜与被测物质接触时伴有物理、化学变化的生化反应可以进行分子识别。生物敏感膜是生物传感器的关键元件，它直接决定着传感器的功能与质量。,8,ppt课件,9,ppt课件,信号转换器,信号转换器是将分子识别元件进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成可用信号的装置。生物传感器的信号转换器已有许多种，其中到目前为止用得最多的且比较成熟的是电化学电极，用它组成的生物传感器称为电化学生物传感器。,10,ppt课件,将化学变化转变成电信号,以酶传感器为例，酶催化特定底物发生反应，从而使特定生成物的量有所增减。用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合，即组成酶传感器。常用转换装置有氧电极、过氧化氢电极。,11,ppt课件,将热变化转换成电信号,固定化的生物材料与相应的被测物作用时常伴有热的变化。例如大多数酶反应的热焓变化量在25-100kJ/mol的范围。这类生物传感器的工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化,后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中。,12,ppt课件,将光信号转变为电信号,例如，过氧化氢酶能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光，因此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端，再和光电流测定装置相连,即可测定过氧化氢含量。还有很多细菌能与特定底物发生反应，产生荧光，也可以用这种方法测定底物浓度。,13,ppt课件,2.生物传感器的特点,操作简单，需用样品少，能在短时间内完成测定。一般不需进行样品的预处理，它利用本身具备的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体，测定时一般不需另加其他试剂,使测定过程简便迅速，容易实现自动分析。可进入生物体内，进行活体分析。对被检测物质具有极好的选择性，噪音低。经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感器可反复使用。传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪，因而便于推广普及。主要缺点是寿命较短。,14,ppt课件,3.生物传感器分类,根据传感器输出信号的产生方式,可分为生物亲合型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器。根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。根据生物传感器的信号转换器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等。,15,ppt课件,生物亲合型传感器 被测物质与分子识别元件上的敏感物质具有生物亲合作用，即二者能特异地相结合，同时引起敏感材料的分子结构和/或固定介质发生变化，如电荷、温度、光学性质等的变化。反应式可表示为：S（底物）+R（受体）=SR,16,ppt课件,代谢型或催化型传感器 底物（被测物）与分子识别元件上的敏感物质相作用并生成产物，信号转换器将底物的消耗或产物的增加转变为输出信号，这类传感器称为代谢型传感器，其反应形式可表示为：S（底物）R（受体）=SR P（生成物）,17,ppt课件,18,ppt课件,19,ppt课件,20,ppt课件,生物活性材料固定化技术,使用生物活性材料作为生物敏感膜，必须研究如何使用生物活性材料固定在载体（或称基质）上，这种结合技术称为固定化技术。在研制传感器时，关键是把生物活性材料与载体固定化成为生物敏感膜。固定化生物敏感膜应该具有的特点：对被测物质选择性好、专一性好性能稳定可以反复使用，长期保持其生理活性使用方便,21,ppt课件,常用载体：丙烯酰胺聚合物、甲基丙烯系聚合物等合成高分子胶原、右旋糖酐、纤维素、淀粉等天然高分子陶瓷、不锈钢、玻璃等无机物常用的固定化方法：夹心法、吸附法、包埋法、共价连接法、交联法,22,ppt课件,1)酶生物传感器,酶传感器是由酶传感器和电化学器件构成的。由于酶是蛋白质组成的生物催化剂，能催化许多生物化学反应。酶的催化效率极高，而且具有高度专一性，即能对待测生物量（底物）进行选择性催化，并且有化学放大作用。因此利用酶的特性可以制造出高灵敏度、选择性好的传感器。,23,ppt课件,24,ppt课件,25,ppt课件,26,ppt课件,27,ppt课件,葡萄糖酶传感器工作原理与检测过程当测量时，葡萄糖酶传感器插入到被测葡萄糖溶液中，由于酶的催化作用而产生耗氧(过氧化氢)，其反应式为 葡萄糖氧化酶葡萄糖H2OO2 葡萄糖酸H2O2在Pt阳极上加0.6V电压，则H2O2在Pt电极上产生的氧化电流为 0.6V Pt H2O2 O22H+2e-式中，2e-为形成电流的电子。,28,ppt课件,不同酶传感器检测物质机理是不同的。有些酶对物质具有催化转化能力(如酪氨酸酶对酚类)，有些物质对酶活性有特异性抑制作用(如有机磷酸酯类对乙酰胆碱酯酶)或作为调节、辅助因子对酶活性进行修饰（如Mn()对辣根过氧化酶）。检测酶反应所产生的信号，可以间接测定物质的含量。由于单酶传感器只能测定数目有限的环境污染物，可以在一个生物传感器上偶联几种酶促反应来增加可测分析物的数目。多酶传感器的例子之一就是糖原磷酸化酶与一个碱性磷酸酶变旋酶葡萄糖氧化酶相结合以测定无机磷酸盐。结合多种酶之后，分析物的数目就可以增加，如共固定酪氨酸酶和漆酶之后就能检测多种酚类化合物。,29,ppt课件,2)微生物传感器,细胞除含有各种酶外，还含有辅酶及酶促反应的其他必要成分，它们存在于细胞内，直接参加酶促反应，在使用中不需纯化，亦不需添加其它成分。可直接用活细胞代替纯酶用于生物传感器。微生物传感器分为两类：利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用利用不同的微生物含有不同的酶。,30,ppt课件,装置由适合的微生物电极与氧电极组成。原理：利用微生物的同化作用耗氧,通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量,从而达到测量底物浓度的目的。例如，荧光假单胞菌能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇，因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时，均消耗溶液中的氧，因此可用氧电极来测定。,31,ppt课件,32,ppt课件,微生物反应的特点微生物反应过程是利用生长微生物进行生物化学反应的过程。也就是说，微生物反应是将微生物作为催化剂进行的反应。酶在微生物反应中起最基本的催化作用。微生物反应与酶促反应的共同点同属生化反应，都在温和条件下进行；凡是酶能催化的反应，微生物也可以催化；催化速度接近，反应动力学模型近似。,33,ppt课件,3)免疫传感器,抗原：具有能够引起免疫反应的物质;抗体：由抗原刺激机体产生的特异性免疫功能的球蛋白，又称免疫球蛋白。抗原抗体反应:选择性强,灵敏度高免疫传感器利用抗体对相应的抗原具有的识别和结合的双重功能，将抗体或抗原和换能器组合而成的装置。由于蛋白质分子(抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基团等,当抗原抗体结合时,会产生电学、化学、光学等变化,通过适当的传感器可检测这些参数，从而构成不同的免疫传感器。,34,ppt课件,基本原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）,35,ppt课件,36,ppt课件,4)生物组织传感器,生物组织传感器是以活的动植物组织细胞切片作为识别元件，并与相应的变换元件构成生物组织传感器。生物组织含有丰富的酶类，这些酶在适宜的自然环境中，可以得到相当稳定的酶活性，许多组织传感器工作寿命比相应的酶传感器寿命长很多；在所需要的酶难以提纯时，直接利用生物组织可以得到足够高的酶活性；组织识别元件制作简便，一般不需要采用固定化技术。,37,ppt课件,38,ppt课件,39,ppt课件,肝组织电极 动物肝组织中含有丰富的H2O2酶，可与氧电极组成测定H2O2及其它过氧化物的组织电极1981年Mascini等研究了数种哺乳动物和其它动物（鸟、鱼、龟）的肝组织电极，报道了基于牛肝组织的H2O2电极。牛肝-H2O2电极 取0.1mm厚牛肝一片，覆盖于氧电极的特氟隆膜上，用“O”型橡皮圈固定，即成牛肝组织电极。在pH6.8的缓冲液中，使电极与空气中的氧平衡，然后加入底物，底物为浓度大于1O-5molL H2O2溶液反应产生的氧气到达氧电极的特氟隆膜时，使电极输出增加在110-4mol/L底物浓度时，1.5min即可获得稳定电流。,40,ppt课件,若向溶液中通以氮气，以降低氧的溶解度，减少空气平衡溶液中氧的残余电流（约10A）至十分之几微安，检测下限可降低至110-5molL，相关系数R=0.997(n9)。,41,ppt课件,5)核酸传感器,依据生物体内核苷酸顺序相对稳定,核苷酸碱基顺序互补的原理而设计出核酸探针传感器，即基因传感器。基因传感器一般有1030个核苷酸的单链核酸分子,能够专一地与特定靶序列进行杂交从而检测出特定的目标核酸分子。,42,ppt课件,生物传感器的主要应用领域,43,ppt课件,（1）食品工业,生物传感器在食品分析中的应用包括食品成分、食品添加剂、有害毒物及食品鲜度等的测定分析。食品成分分析：在食品工业中，葡萄糖的含量是衡量水果成熟度和贮藏寿命的一个重要指标。已开发的酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄糖等。食品添加剂的分析：亚硫酸盐通常用作食品工业的漂白剂和防腐剂，采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电极可用于测定食品中的亚硫酸含量。,44,ppt课件,45,ppt课件,46,ppt课件,47,ppt课件,48,ppt课件,（2）环境监测,大气环境监测：二氧化硫是酸雨酸雾形成的主要原因，传统的检测方法很复杂。将亚细胞类脂类固定在醋酸纤维膜上，和氧电极制成安培型生物传感器，可对酸雨酸雾样品溶液进行检测。,49,ppt课件,硫化物的测定硫化物的测定是用从硫铁矿附近酸性土壤中分离筛选得到的专性、自养、好氧性氧化硫硫杆菌制成的微生物传感器。在pH=2.5、31时一周测量200余次，活性保持不变，两周后活性降低20%。传感器寿命为7天，其设备简单，成本低，操作方便。,50,ppt课件,乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化下可以分解为乙酸和胆碱：CH3COO(CH2)2N+(CH3)3Cl-+H2O CH3OOH+HO（CH2）2N+(CH3)3Cl-在水溶液中，乙酸电离，从而使溶液的pH值发生变化：CH3COOH CH3COO-+H+有机磷农药或氨基甲酸酯类农药可以有效地结合到乙酰胆碱酯酶的活性位点上，抑制酶的活性，减少pH值的变化。通过检测这种微小的变化，便可以测得溶液中的有机磷农药的含量。,51,ppt课件,阴离子表面活性剂传感器生活污水中烷基苯磺酸(LAS)这类阴离子表面活性剂比较多，它们的自然降解性差，在水面产生不易消失的泡沫，并消耗溶解氧，甚至能改变污水处理装置中活性污泥的微生物生态系统。用LAS降解细菌制成的生物传感器，利用当LAS存在时，LAS降解菌的呼吸作用增强，引起溶解氧变化，从而导致氧电极电流变化来测定LAS浓度。,52,ppt课件,德国研发的环境废水BOD分析仪,53,ppt课件,BOD测定传统的稀释法：在(20土1)培养5d，分别测定样品培养前后的溶解氧，二者之差即为5d的生化需氧量B0D。这种方法操作繁杂，重现性差，不能及时反应水质情况和反馈信息，不适合现场监测。生物传感器测BOD只涉及到初始氧化速率，两者之间的相关性可以通过对标准溶液的测定来获得。这就可以将测定时间缩短到15 min左右，且重现性提高。,54,ppt课件,原理,将微生物电极浸入空气饱和的磷酸盐缓冲液，由于固定在电极上的微生物的内呼吸作用，电流响应值稍有下降（图中曲线A段）；将样品S（葡萄糖-谷氨酸标准溶液或实际废水样品）加入到缓冲溶液中，由于固定化微生物耗氧降解溶液中的有机物，消耗了溶解氧，电极电流响应值急剧下降(图中曲线B段）直至达到稳态(图中曲线C段)；当用磷酸盐样品溶液替换样品溶液后，电极电流响应为D。微生物传感器在曲线平台A和C间的电极电流响应差值用于计算BOD值。用于BOD微生物传感器的微生物有假单胞菌、异常江逊酵母、活性淤泥菌、丝孢酵母菌、枯草芽孢杆菌等。,55,ppt课件,甲烷传感器,在空气中甲烷含量在5-14之间时会具有爆炸性。从自然界中分离并纯培养的甲烷氧化细菌，如鞭毛甲基单胞菌利用甲烷作为惟一碳源进行呼吸。将鞭毛甲基单胞菌用琼脂固定在醋酸纤维膜上，制备出固定化微生物传感器（每个反应器固定有300mg细胞）。当含有甲烷的气体传输到固定化细菌池时，甲烷被微生物吸收同时微生物耗氧，使反应池中溶解氧浓度降低，电流下降，当微生物消耗的氧和氧从样品气体到固定化细菌的扩散之间达到平鵆时，电流下降达到平鵆，稳态电流的大小取决于甲烷的浓度。当空气通过反应池时，传感器电流在1min内恢复至初始状态。,56,ppt课件,硝酸盐微生物传感器,硝基芳香族化合物类污染物（硝基酚、苦味酸、三硝基甲苯等）经微生物降解的主要产物之一是亚硝酸盐。由于Nitrobacter sp.含有亚硝酸氧化还原酶，在兼性培养过程中对亚硝酸盐具有很高的选择性和灵敏度，可用于构建硝酸盐微生物传感器。Larsen等发展了测定硝酸盐的微型微生物传感器。他们将假单胞菌Pseudomonas固定在毛细管中，置于N2O微小的电化学传感器前端，固定化菌将NO3-转化为N2O，随即N2O在传感器探头部位银阴极表面还原。该传感器对10400mol/L范围的NO3-浓度响应呈线性关系，介质中呈涡流或静止状态对结果影响不大，唯一的干扰是NO2-和N2O，高浓度的硫化物会使传感器永久失活。,57,ppt课件,（3）发酵工业,微生物传感器具有成本低、设备简单、不受发酵液混浊程度的限制、能消除发酵过程中干扰物质的干扰等特点。因此，在发酵工业中广泛地采用微生物传感器作为一种有效的测量工具。微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的测定，代谢产物如头孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等的测定。测量的原理基本上都是用适合的微生物电极与氧电极组成，利用微生物的同化作用耗氧，通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。,58,ppt课件,59,ppt课件,发酵中葡萄糖测定,过去用操作繁琐时间长的还原糖方法只能近似地估计葡萄糖的变化。现在提供了快速而准确的固定化酶的测定方法，发酵中可根据糖消耗确定微生物的生长速率，观察是否染菌，随时与产物的产生一起估算转化率，确定补料效果和及时判断发酵结束的时间。发酵过程或设备异常现象通过葡萄糖分析得到及时预报。在发酵控制方面，一直需要直接测定细胞数目的简单而连续的方法。人们发现在阳极表面，细菌可以直接被氧化并产生电流。这种电化学系统已应用于细胞数目的测定，其结果与传统的菌斑计数法测细胞数是相同的。,60,ppt课件,（4）医学领域,61,ppt课件,手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,62,ppt课件,一种葡萄糖传感器-Glucowatch,Glucose pulled through the skin by charged molecules The ions migrate to the anode(+)and cathode(-)Glucose reacts with glucose oxidase to form hydrogen peroxideThe reaction produces an electrochemical measured by the AutoSensor,63,ppt课件,乙醇生物传感器,在乙醇氧化酶、水和氧存在的情况下，乙醇被氧化成乙醛和过氧化氢的反应过程如下：由固定化酶膜和过氧化氢电极可以组合构成乙醇生物传感器。,64,ppt课件,6)生物芯片,生物芯片是生物传感器的阵列和集成化。生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号即可实现对生物样品的分析。,65,ppt课件,66,ppt课件,67,ppt课件,生物芯片与一般分子杂交比较,68,ppt课件,基因芯片是具有相当集成度（通常每平方厘米点阵密度高于400）的核酸探针阵列，通过将大量的寡核苷酸片断或已知基因片段有序地固定于固相支持物上用作核酸探针，然后与标记的样品分子杂交，便可根据碱基互补匹配的原理，以及各位点探针分子杂交信号的强度来确定样品分子的数量和序列信息。基因芯片可同时对大量核酸分子进行检测分析，已应用于生物医学、生物分子学、人类基因组研究和医学临床诊断领域。,（1）基因芯片,69,ppt课件,70,ppt课件,光刻技术在基因芯片制备过程中，使用了半导体领域的微加工技术（如光刻技术）。,71,ppt课件,72,ppt课件,基因芯片分析的一般流程,大量探针分子固定于支持物上后，利用DNA双链的互补碱基之间的氢键作用，与标记的样品分子进行杂交，然后用精密扫描仪或摄像纪录，通过计算机软件分析处理，得到有价值的生物信息。待测核酸样品制备（与扩增）；荧光素标记待测核酸样品；与芯片进行杂交；洗涤去除未杂交的标记样品；采集芯片杂交模式（用荧光显微镜或荧光扫描仪或激光共聚焦扫描仪）；对芯片杂交模式进行电脑分析获取待测样本的相关信息。,73,ppt课件,74,ppt课件,75,ppt课件,基因芯片点样仪Macroarray,芯片数据处理,76,ppt课件,芯片的反应与杂交,依据碱基互补配对原理发展的核酸链间分子杂交技术，在靶标样品与探针之间进行选择性反应，将反应一方(探针)固定在芯片上，另一方(荧光标记)通过流路加至芯片上。,77,ppt课件,杂交信号检测,对于用荧光素标记经扩增（也可用其他放大技术）的序列或样品，与芯片上的探针进行杂交，然后冲洗，采集荧光图像。1.激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光。2.激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号。3.软件进行进行图象分析和数据处理。,78,ppt课件,基因芯片,荧光标记的样品,共聚焦共聚共聚焦显微镜,获取荧获取荧光图获取荧光图象,杂交结果分析,探 针 设 计,杂交,79,ppt课件,（2）蛋白质芯片,蛋白质芯片主要是蛋白质如抗原或抗体在载体上的有序排列，依据蛋白质 分子、蛋白质与核酸相互作用的原理进行杂交、检测和分析。,80,ppt课件,81,ppt课件,（3）组织芯片,它将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上，为医学分子生物学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具。,82,ppt课件,芯片上的实验室,将生命科学研究中的许多不连续的分析过程如样品制备、生物化学反应和目标基因分离检测等烦琐的实验操作，通过采用象集成电路制作中的半导体光刻加工那样的缩微技术，移植到芯片上进行，使其连续化、微型化。,83,ppt课件,84,ppt课件,生物传感器的发展方向,集成化与功能化提高灵敏度智能化,85,ppt课件,