第4章基因工程的主要技术及其原理课件.ppt

第4章基因工程的主要技术及其原理,2023/1/11,第4章基因工程的主要技术及其原理,第4章基因工程的主要技术及其原理2022/9/24第4章基因,提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（1mol/L NaCl）将DNP抽提出来，再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。,(1).细胞裂解和DNA的溶解；一般采用机械破碎或酶解细胞释放DNA，严防细胞中各种酶对DNA的 破坏：1)利用液氮在超低温下研磨，使酶失活；2)快速加入缓冲液并迅速混匀，保护DNA。,DNA提取的步骤：,EDTA：螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+，降低DNA酶活性；SDS：变性并降解蛋白质，降低DNA酶活性；抗氧化剂：PVP，-巯基乙醇，抗坏血酸、半胱氨酸，DTT降低酚类氧化 对DNA的干扰 PVP：有效去除酚类和多糖物质。,第4章基因工程的主要技术及其原理,提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐,(2).与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；,主要利用DNA与蛋白、多糖性质不同，加入离子变性剂、去污剂使其变性解聚；,CTAB:十六烷基三甲基溴化铵，可溶解细胞膜，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）与DNA结合形成复合物并呈溶解状态，但当浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，DNA即从溶液中沉淀，通过离心可将DNA-CTAB复合物与多糖与 蛋白质分开。,SDS:十二烷基硫酸钠，可使蛋白质变性，核蛋白解聚，使DNA游离出来，再根据DNA和蛋白质在有机溶剂中溶解度差异，用苯酚-氯仿抽提蛋白。,苯酚-氯仿:对蛋白质具有极强的变性作用，而对DNA无影响。,RNA杂质:用不含DNA酶的RNA酶去除。,第4章基因工程的主要技术及其原理,(2).与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；主要利用D,(3).DNA的沉淀与纯化,溶解在上清液中的DNA加入2倍体积的无水乙醇使其沉淀。在多糖、蛋白含量高时用1倍的异丙醇沉淀效果较好。,（二）DNA提取的几种方法,根据细胞破碎后，分离DNA与蛋白质所采用的技术策略和试剂不同，可分以下几种方法：,1.浓盐法原理：根据RNP和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。,方法1：用1mol/L NaCl抽提，得到的DNP液中加入含辛醇的氯仿，离心，DNA位于 上层水相，回收水相，用2倍体积的95%乙醇或无水乙醇将DNA沉淀出来。,方法2：用0.15mol/L NaCl反复洗涤细胞裂解液除去RNP，再用1mol/L NaCl抽提DNP，然后用氯仿-异戊醇除去蛋白。,第4章基因工程的主要技术及其原理,(3).DNA的沉淀与纯化溶解在上清液中的DNA加入2倍体,以稀盐溶液提取DNA，可加入适量SDS使蛋白质变性解聚，使DNA解离；使用SSC溶液（5mol/L NaCl、0.015mol/L柠檬酸钠）抑制DNase降解DNA,2.SDS法原理：SDS使细胞膜裂解，使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA分开，加入乙酸钾可使SDS-蛋白复合物转变成溶解度更小的钾盐，使沉淀更加完全。,3.CTAB法原理：在细胞裂解液中，加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来。再经氯仿-异戊醇 抽提除蛋白，即可得到含DNA水相，经乙醇或异丙醇沉淀即得到DNA。,第4章基因工程的主要技术及其原理,以稀盐溶液提取DNA，可加入适量SDS使蛋白质变性解聚，使D,4.苯酚抽提法原理：苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚处理细胞匀浆液，蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，离心分层取水相，多次重复，合并水相，用乙醇沉淀，即得到DNA。,5.水抽提法原理：利用核酸溶于水的性质，用低盐除去RNA，将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解，离心后收集上清液，加入固体NaCl调至2.6mol/L，加入2倍体积的95%乙醇，然后，分别用66%，80%，95%乙醇及丙酮清洗DNA，经干燥后即得DNA样品。,第4章基因工程的主要技术及其原理,4.苯酚抽提法5.水抽提法第4章基因工程的主要技术及其原,在强碱环境中，大分子量的核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将pH调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形成不溶性网状结构，但质粒DNA仍然呈可溶状态。,碱裂解法提质粒DNA的原理：,（三）质粒的提取,第4章基因工程的主要技术及其原理,在强碱环境中，大分子量的核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍,二 RNA提取的基本原理与方法,（一）总RNA提取的基本原理与方法,1.总RNA提取的原理,真核生物RNA分子主要存在于细胞核与细胞质中。总RNA：rRNA，tRNA，mRNA。其中mRNA仅占总RNA的1-5%，分子大小不等，由几百乃至数万核苷酸组成。,能否成功提取RNA，关键在于能否完全抑制或除去RNA酶的破坏作用，获取完整的全长RNA分子。,RNA酶有一条多肽链组成，不需要任何辅助因子，存在十分广泛并十分稳定，非常耐热，在较宽的pH范围内有活性，及其顽固。,第4章基因工程的主要技术及其原理,二 RNA提取的基本原理与方法（一）总RNA提取的基本原理与,1）所有玻璃器皿应置于180烘箱烘烤4小时以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制品需用01%的DEPC（二乙基焦碳酸盐）溶液处理，然后121 高压消毒40分钟；2)全部过程需戴手套、口罩操作，并经常更换手套；3)RNA电泳漕需用去污剂洗涤，用水冲洗干净后，用乙醇干燥，浸泡于3%的H2O2水溶液中，室温10分钟后，再用0.1%DEPC水彻底冲洗。,提取RNA的实验必须采取以下措施：,第4章基因工程的主要技术及其原理,1）所有玻璃器皿应置于180烘箱烘烤4小时以上；凡是不能烘,1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底；2)使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中；变性剂有异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠等；3)有效地抑制内源及外源RNase活性；4)将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开。策略一是先提总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；策略二是直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，低pH的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA留在有机相中，水相中的RNA可用异丙醇沉淀出来。,提取RNA的方法一般包括4个关键点：,第4章基因工程的主要技术及其原理,1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底；提,2.总RNA提取的方法,(1)酚-异硫氰酸胍提取法。Trizol试剂是最广泛的抽提总RNA的试剂，即根据酚-异硫氰酸胍提取法设计。,提取步骤：在液氮中研磨样品，使细胞破碎 加入Trizol试剂，溶解细胞成分 加入氯仿抽提蛋白，离心分离水相和有机相 收集含RNA的水相 异丙醇沉淀可获得RNA样品。,(2)离心分离法。过柱纯化，将含RNA的细胞破碎液加在含硅胶膜的柱子上，通过柱子时，RNA被硅胶膜吸附，与其他杂质分开，然后在低盐溶液或水中将RNA洗脱下列。,第4章基因工程的主要技术及其原理,2.总RNA提取的方法(1)酚-异硫氰酸胍提取法。提取步,（二）mRNA的提取,真核生物mRNA的提取途径有两条：其一：抽提细胞总RNA，经蛋白酶K除蛋白，在利用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤 维 素柱层析，把mRNA与tRNA、rRNA分开。真核生物mRNA的3末端带有一串长约200个腺苷酸的polyA序列，其他RNA 没有这样的结构，从而可用polyT将mRNA结合将其分离。,基因表达具有时空特异性，分离与目的基因时空表达相对应的mRNA是实验成 功的关键。,其二：先提多聚核糖体，再将蛋白质与mRNA分开，利用抗原抗体反应，将微量 特异的mRNA提取出来。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（二）mRNA的提取真核生物mRNA的提取途径有两条：,二 DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定,常用的方法有紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法。,（一）紫外分光光度计法测定DNA、RNA的浓度和纯度,DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫外区具有较强吸收，吸收峰在260nm处。1个OD260相当于50ug/mL的双链DNA；1个OD260相当于40ug/mL的单链RNA；,蛋白质的最大吸收峰在280nm处，多糖的最大吸收峰在230nm处。,对于DNA，OD260/OD2801.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明 有蛋白质、苯酚等的污染。对于RNA,OD260/OD280=1.82.0之间，小于1.7表明有蛋白质和苯酚污染，大于2.0表明有异硫氰酸胍残留。,第4章基因工程的主要技术及其原理,二 DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定,（二）琼脂糖凝胶电泳鉴定,采用琼脂糖凝胶电泳可以粗略鉴定DNA和RNA的含量和纯度。,EB(溴化乙锭）：DNA的染色剂。该物质能嵌入核酸分子，并具有在紫外光下 发荧光的特性。,利用EB染色的DNA样品的亮度可粗略定量，而通过条带的清晰度判断是否降解如果DNA有降解，则在电泳图谱上表现出明显的拖尾。,一般用常规的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（二）琼脂糖凝胶电泳鉴定采用琼脂糖凝胶电泳可以粗略鉴定DNA,第二节 凝胶电泳,DNA的等电点偏酸，当处于电泳条件（pH=8）时，DNA链上带有负电荷，在电场力的作用下会向正极泳动，由于DNA链上负电荷的增加伴随着DNA分子质量的增加而增加。所以，实际上DNA分子的荷质比始终是一常数，电泳中分离DNA靠的是分子的大小与构型的不同。,一 琼脂糖凝胶电泳,（一）琼脂糖凝胶,琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持介质，在适当条件下对带电生物大分子进行分离。琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，是D-半乳糖和脱水3,6-L-半乳糖连接而成的一种线性分子，具有亲水性，不带电，不引起DNA变性，不吸附分离物质的特点。,第4章基因工程的主要技术及其原理,第二节 凝胶电泳 DNA的等电点偏酸，当处于电泳,凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。,不同类型琼脂糖分离DNA片段大小范围,第4章基因工程的主要技术及其原理,凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。不同类型琼脂糖分离DN,（二）凝胶电泳的影响因素,1、DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。,2、DNA的分子构型。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环DNA分子移动最慢。,3、凝胶浓度。一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（二）凝胶电泳的影响因素1、DNA的分子大小。2、DNA,4、电场强度。电压一般不超过5v/cm，电压高，电泳快，但分辨率低。电压低，电泳慢，但分辨率高。,5、溴化乙锭。荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15。,6、电泳缓冲液。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。,第4章基因工程的主要技术及其原理,4、电场强度。5、溴化乙锭。6、电泳缓冲液。第4章基因,二 琼脂糖变性胶电泳,RNA为单链分子，链内碱基容易配对形成二级结构。不同的RNA分子空间结构不同，在未变性条件下，其相对分子量与电泳一定距离没有严格的相关性。,常用的RNA变性胶有两种：其一为含有乙二醛-二甲基亚砜（DMSO）的凝胶；其二为含甲醛的凝胶。,水平电泳,第4章基因工程的主要技术及其原理,二 琼脂糖变性胶电泳 RNA为单链分子，链内碱基容易配对,三 聚丙烯酰胺凝胶电泳,垂直电泳,聚丙烯酰胺凝胶，既具有分子筛效应，又具有静电效应，分辨率高于琼脂糖凝胶，可达一个核苷酸。同时又可用于蛋白质的分离。,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，需要自由基催化完成。常用的催化方法有化学聚合和光聚合：化学聚合需加入催化剂过硫酸铵(AP）和加速剂四甲基乙二胺（TEMED)。光聚合是核黄素在光照射下及有微量氧存在时产生自由基使凝胶聚合。,第4章基因工程的主要技术及其原理,三 聚丙烯酰胺凝胶电泳 垂直电泳 聚丙烯酰胺凝胶，既,聚丙烯酰胺凝胶制备在玻璃板上或玻璃管中。电泳漕分上漕和下漕，各装有电极，通过凝胶使它们连成导电的整体。电泳中带有电荷的分子在电场作用下移动，移动速度依赖于电场强度、分子净电荷以及分子的大小和形状，同时也与介质的离子强度、黏度和温度有关。,第4章基因工程的主要技术及其原理,聚丙烯酰胺凝胶制备在玻璃板上或玻璃管中。第4章基因工程,四 脉冲场凝胶电泳,常规琼脂糖凝胶电泳中，在一定的分子量范围内DNA片段泳动速率与分子量大小呈线性关系，但当DNA分子大小超过凝胶孔径，DNA分子将由无规则卷曲的构象沿电场方向伸直，变成与电场平行以通过凝胶空隙，这样大分子通过凝胶的速率无差别，因此无法区分。,脉冲电场电泳是一种交替变换电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场的方向，使DNA在微观上按“Z”形向前泳动，从而区分不同大小的DNA分子。,脉冲场电泳可区分50kb或100kb以上的大片段DNA分子。,第4章基因工程的主要技术及其原理,四 脉冲场凝胶电泳 常规琼脂糖凝胶电泳中，在一定的分子量,第4章基因工程的主要技术及其原理,第4章基因工程的主要技术及其原理,五 凝胶电泳中DNA的检测,凝胶中DNA的检测方法主要有三种：,EB染色，然后在紫外灯下观察，主要用于琼脂糖凝胶；银染显色法，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳；放射性同位素标记发，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。,第4章基因工程的主要技术及其原理,五 凝胶电泳中DNA的检测凝胶中DNA的检测方法主要有三种：,第三节 核酸和蛋白质的分子杂交,核酸分子杂交原理：双链DNA或具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火或复性过程。形成的分子有DNA/DNA,DNA/RNA杂合分子形式。,一 探针的标记,探针：是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列，这些序列使用前需要标记。标记：同位素标记，生物素、地高辛或辣根过氧化物酶等标记,第4章基因工程的主要技术及其原理,第三节 核酸和蛋白质的分子杂交 核酸分子杂交原理：双,（一）探针的制备,（1）切口平移法标记,通过复制合成新探针分子，在复制过程中掺入标记核苷酸,从而使整个分子被均匀标记。特点：均匀标记，探针信号强。,均匀标记,第4章基因工程的主要技术及其原理,（一）探针的制备（1）切口平移法标记通过复制合成新探针分子，,（2）随机引物法,（3）PCR扩增标记,利用6个核苷酸的随机引物在Klenow酶的作用下，对待检测的DNA进行随机扩增，在扩增产物中加入32pdATP，扩增产物用作探针,在PCR扩增时加入标记的dNTP，可获得大量探针。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（2）随机引物法（3）PCR扩增标记 利用6个核苷酸,2.末端标记,直接将探针分子的某个原子替换成放射性同位素原子，或直接在探针分子加上标记的原子或复合物。这种标记一般在探针分子的末端进行，故称为末端标记。,（1）DNA片段的末端标记 a.黏末端的补平反应或平末端的置换反应引入标记的核苷酸；b.T4多核苷酸激酶在DNA的5末端引入标记的磷酸基团；c.末端转移酶在DNA的3末端连接标记的核苷酸。,（2）.寡核苷酸的标记 用DNA聚合酶，以合成的更短的寡核苷酸作引物，或合成两个部分互补的寡核苷酸使之互为模板，在DNA合成的过程中引入标记的寡核苷酸。,第4章基因工程的主要技术及其原理,2.末端标记 直接将探针分子的某个原子替,（二）标记物及其检测,同位素,非同位素标记有：生物素标记，地高辛标记和辣根过氧化物酶标记等。,地高辛标记由德国Roche公司开发，将DIG与dUTP交联，在掺入核苷酸标记反应中引入DIG-11-dUTP，使DNA或RNA被DIG标记。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的沉淀。,生物素是一种水溶性维生素，可通过丙烯键与嘧啶的C5位共价结合，形成biotin-11-dUTP，显色原理同DIG。,辣根过氧化物酶（HRP)标记的探针是通过HRP与带正电荷的聚乙烯亚胺交联产生带正电荷的复合物，再与带负电荷的单链或双链DNA结合形成共价键，产生酶标记探针，酶可使无色底物显色，从而进行检测。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（二）标记物及其检测同位素32P:半衰期为14天，放射性粒,二 Southern杂交,Southern杂交示意图,第4章基因工程的主要技术及其原理,二 Southern杂交Southern杂交示意图第4章基因,三 Northern杂交,总RNA或mRNA甲醛变性琼脂糖电泳印迹转膜预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色,第4章基因工程的主要技术及其原理,三 Northern杂交总RNA或mRNA甲醛变性琼脂糖电,四 菌落或噬菌斑杂交,菌落原位杂交示意图,第4章基因工程的主要技术及其原理,四 菌落或噬菌斑杂交菌落原位杂交示意图第4章基因工程的主要技,五 Western杂交,第4章基因工程的主要技术及其原理,五 Western杂交PVDF膜目的蛋白质抗目的蛋白的第一抗,第四节 聚合酶链式反应技术,一 PCR技术原理,PCR(Polymerase Chain Reaction):一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应。,DNA的体外复制,第4章基因工程的主要技术及其原理,第四节 聚合酶链式反应技术一 PCR技术原理PCR(Pol,高温变性:92-96 低温退火:37-72 适温延伸:72,（一）PCR技术的基本过程,第4章基因工程的主要技术及其原理,高温变性:92-96（一）PCR技术的基本过程第4章,变性、退火、延伸,循环n次,n次循环后双链DNA在理论上的最高值为2n,第4章基因工程的主要技术及其原理,53变性、退火、延伸循环n次一两变性5335退火,（二）平台期与平台效应,平台效应形成与下列因素有关：,平台效应：PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的指数积累趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进人线性增长或静止期。,（1）引物、dNTP快速掺入底物中，其浓度降低，掺入速度减慢；（2）随产物增加，酶与模板的比例下降；（3）非特异性产物或引物二聚体与反应物竞争；（4）产物的再结合。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（二）平台期与平台效应平台效应形成与下列因素有关：平台效应,PCR产物的积累规律示意图,第4章基因工程的主要技术及其原理,PCR产物的积累规律示意图第4章基因工程的主要技术及其原理,二 PCR反应体系,PCR反应需用一定的条件才能完成，这些条件主要指：,10缓冲液（Mg2+）DNA模板dNTP(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)一对引物DNA聚合酶(Taq酶）无菌水（补足体系用）,第4章基因工程的主要技术及其原理,二 PCR反应体系PCR反应需用一定的条件才能完成，这些条件,（一）TaqDNA聚合酶,以单链DNA为模板，以引物为起点，按53方向合成新生互补链无35外切酶活性耐高温（95 C）最适合成DNA温度为72 C,第4章基因工程的主要技术及其原理,（一）TaqDNA聚合酶以单链DNA为模板，以引物为起点，按,（二）引物,引物长度(16-30bp),防止一对引物内及引物之间同源性，避免形成引物的发卡结构或“二聚体”GC含量为40%-60%，两引物的Tm值相近，Tm=2（A+T）+4（G+C）引物3端不能进行修饰或形成二级结构；引物的5端可进行修饰，如添加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等 引入突变位点、插入或缺失突变序列等。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（二）引物引物长度(16-30bp)退火55335,（三）PCR反应的最佳条件,Taq DNA聚合酶的浓度为1.0-2.5U/100uL反应液；dNTP的浓度为20-200umol/L;Mg2+浓度为0.5-2.5mmol/L；引物浓度为0.2-1.0umol/L。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（三）PCR反应的最佳条件Taq DNA聚合酶的浓度为1.0,三 PCR技术的应用,（一）反转录PCR,第4章基因工程的主要技术及其原理,三 PCR技术的应用（一）反转录PCR第4章基因工程的主要,（二）锚定PCR,第4章基因工程的主要技术及其原理,（二）锚定PCR第4章基因工程的主要技术及其原理,（三）反向PCR,第4章基因工程的主要技术及其原理,（三）反向PCR第4章基因工程的主要技术及其原理,（四）巢式PCR,设计一对外测引物和一对内测引物先用外测引物扩增含目的DNA的大片段再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段,第4章基因工程的主要技术及其原理,（四）巢式PCR设计一对外测引物和一对内测引物模板DNA加,（五）实时定量PCR,在普通PCR 仪的基础上再配备一个激发和检测的装置。通过PCR反应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复性好，在临床检测方面有广泛的用途。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（五）实时定量PCR 在普通PCR 仪的基础上,（1）TaqMan荧光探针,TaqMan荧光探针的标记原理,第4章基因工程的主要技术及其原理,（1）TaqMan荧光探针TaqMan荧光探针的标记原理第4,（2）SYBR荧光探针,DNA双链非特异性内嵌染料（SYBR Green）能特异性地结合到双链DNA上，而不结合到单链DNA上，并且结合后的染料的发光强度会明显增加，没有结合的染料在溶液中只能发出很微弱的荧光。,第4章基因工程的主要技术及其原理,（2）SYBR荧光探针DNA双链非特异性内嵌染料（SYBR,第五节 DNA序列分析,一 Maxam-Gilbert化学降解法,二 Sanger双脱氧链终止法,第4章基因工程的主要技术及其原理,第五节 DNA序列分析一 Maxam-Gilbert化学降解,第六节 基因定点诱变,使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。,一 盒式诱变,第4章基因工程的主要技术及其原理,第六节 基因定点诱变 使已克隆基因或DNA片段中,二 寡核苷酸引物诱变,应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。,第4章基因工程的主要技术及其原理,二 寡核苷酸引物诱变 应用化学合成的含有突变碱基的,三 PCR诱变,重组PCR定点突变法示意图,第4章基因工程的主要技术及其原理,三 PCR诱变重组PCR定点突变法示意图第4章基因工程的主要,大引物诱变法示意图,第4章基因工程的主要技术及其原理,大引物诱变法示意图第4章基因工程的主要技术及其原理,第七节 DNA与蛋白质互作分析,一 酵母杂交系统,第4章基因工程的主要技术及其原理,第七节 DNA与蛋白质互作分析一 酵母杂交系统 酵母,1.酵母双杂交系统的原理,酵母双杂交系统的原理示意图,第4章基因工程的主要技术及其原理,1.酵母双杂交系统的原理 酵母双杂交系统的原理示意图第4章,酵母单杂交系统的原理示意图,2.酵母单杂交系统的原理,第4章基因工程的主要技术及其原理,酵母单杂交系统的原理示意图2.酵母单杂交系统的原理第4章,二 凝胶阻滞试验,凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带,A,C,B,放射自显影,*,*,*,*,凝胶电泳,放射性标记的DNA,细胞蛋白质提取物,蛋白质与DNA结合,DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢,滞后带表明DNA与蛋白质结合,第4章基因工程的主要技术及其原理,二 凝胶阻滞试验凝胶阻滞实验的基本原理图ACB放射自显影*,三 DNaseI足迹试验,DNaseI足迹试验示意图,第4章基因工程的主要技术及其原理,三 DNaseI足迹试验DNaseI足迹试验示意图第4章基因,三 DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析,（一）与蛋白质特异结合的DNA免疫沉淀分析,1).提取目标生物的总DNA，酶切，连上接头；2).将连上接头的DNA与融合蛋白一起温育；3).用融合蛋白上的标签蛋白抗体与融合蛋白结合，用沉淀法分离复合物，使其结合的DNA被免疫共沉淀；4).用有机溶剂除蛋白，释放DNA,第4章基因工程的主要技术及其原理,三 DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析（一）与蛋白质特异结合,演讲完毕，谢谢听讲!,再见，see you again,3rew,2023/1/11,第4章基因工程的主要技术及其原理,演讲完毕，谢谢听讲!再见，see you again3rew,