核酸提取及常见问题分析ppt课件.ppt
核酸提取 及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.,DNA提取及常见问题分析 RNA提取及常见问题分析,讲座内容,DNA提取及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.,DNA提取的原则 DNA提取的方法 DNA提取常见问题分析,DNA提取及常见问题分析,保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等,DNA提取的原则,基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法,DNA提取的方法,基因组DNA提取主要方法,CTAB法 适用于植物组织，真菌等 SDS法 适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等,CTAB法(植物DNA提取经典法),原理CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组DNA CTAB法,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组DNA CTAB法,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,植物基因组DNA提取试剂盒,缓冲液GP1缓冲液GP2去蛋白液GD洗脱缓冲液TE吸附柱CB2(20g)收集管,每个离心柱处理材料的量为鲜重：100mg干重：30mg,SDS法,原理SDS 阴离子去垢剂 高温（5565）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA,SDS提取缓冲液的配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；,动物组织细胞,裂解液,上层溶液,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,组织匀浆,SDS法流程图,细菌基因组DNA提取试剂盒血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒病毒基因组提取试剂盒酵母基因组DNA提取试剂盒 CB2：20(g),SDS提取试剂盒,细菌基因组DNA提取试剂盒 15ml细菌菌液/离心柱 10-40 g 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒全血 100 l1ml 3-30 g动物细胞培养液 106107cells 5-30g动物组织 30mg 10-30g病毒基因组提取试剂盒 DNA RNA酵母基因组DNA提取试剂盒 Lyticase(20U/g）,不同材料对SDS提取试剂盒提取量,96血液基因组DNA试剂盒 一次实验可提取96个样品，快捷、方便。,不同材料对SDS提取试剂盒提取量,基因组DNA其它裂解方法,根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解生物方式：酶法,基因组DNA纯化的方法,吸附材料结合法：,硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒,质粒DNA提取,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.,碱裂解法 煮沸法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,上层溶液,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,质粒DNA溶液,离心柱型 质粒DNA提取试剂盒,96系列,细胞器DNA提取,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.,细胞器DNA,线粒体 叶绿体,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,基因组DNA新鲜材料，低温保存血液基因组DNA提取选择有核细胞细胞培养时间不能过长含病毒的液体材料提取前先富集,质粒DNA对数期的菌体培养时应加入筛选压力低拷贝或大质粒，应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细 菌溶菌酶破壁酵 母破壁酶或玻璃珠,质粒DNA菌体量适当，除净培养基变性的时间不要过长（5分钟）控制复性时间，避免基因组DNA的污染G菌、酵母细胞酶或机械处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,多糖的去除：多糖水解酶在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,多酚的去除：加入还原剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70的乙醇洗涤,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,DNA提取基本步骤,问题一：DNA降解,材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老提取操作过于剧烈，DNA被打断外源核酸酶污染,低温保存，避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后操作应尽量轻柔试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融,问题二：DNA样品不纯,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：DNA提取量少,RNA提取及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.,RNA提取相关知识及注意事项 RNA提取方法 RNA提取常见问题分析,107 个细胞10g 30mg动物组织，30-100mg植物组织rRNA 占8085mRNA占1-5%,AAAAAA,细胞中RNA的含量,mRNA的应用,RT-PCR,Northern杂交，cDNA文库构建 mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应，体外转录RNA标记，RNA酶保护试验，RNA微注射(RNA Microinjection),RNA的不稳定性,内因：核糖残基的2和3位置带有羟基，易被水解外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,常用的RNA酶抑制剂,焦碳酸二乙酯（DEPC）与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 异硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。,RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种RNA酶结合，使其失活 氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性 SDS、尿素、硅藻土等,常用的RNA酶抑制剂,RNAsafe,RNA酶抑制剂,提取RNA的注意事项,经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌 玻璃器皿可在180烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染,RNA提取相关知识及注意事项 RNA提取方法 RNA提取常见问题分析,异硫氰酸胍/苯酚法,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,动植物材料,研磨或匀浆,细胞裂解,基因组DNA,水相,有机相,RNA,氯仿,纯化,pH5.7,离心,加入裂解液(TRNzol),RNA提取流程示意图,等体积异丙醇沉淀,70乙醇洗涤沉淀,晾干溶解,RNA吸附柱,去蛋白液,漂洗,洗脱,水相RNA,传统方法：有机溶剂抽提，得率高,柱纯化法：纯度高，无有机溶剂,RNA提取流程示意图,可选择的RNA提取产品,材料准备,TRNzol裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA沉淀 柱纯化,RNA溶解 保存,植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位培养细胞除尽培养液消化系统的组织选取杂质少的部位细菌和酵母需要破壁处理样品切成小块投入液氮或专门的RNA样品储存液中保存液氮研磨时不要使液氮挥发净,RNA提取基本步骤,材料准备,TRNzol裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA沉淀 柱纯化,RNA溶解保存,异硫氰酸胍、酚(TRNzol)裂解细胞灭活RNaseTRNzol要与细胞组织充分接触裂解尽量充分,RNA提取基本步骤,材料准备,TRNzol裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA沉淀 柱纯化,RNA溶解保存,氯仿抽提时充分混匀离心分离两相，保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到有机相和中间层，RNA留在水相中注意避免吸入中间层不慎吸入再次用有机溶剂抽提,RNA提取基本步骤,材料准备,TRNzol裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA沉淀 柱纯化,RNA溶解保存,异丙醇低温沉淀RNA高盐低pH值，核酸与硅胶膜结合70乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA70 分装保存或加入RNase抑制剂(RNAsafe),RNA提取基本步骤,RNA提取相关知识及注意事项 RNA提取方法 RNA提取常见问题分析,RNA提取常见问题一：样品不纯,蛋白多糖多酚DNA离子,保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化加入不含RNase的DNase处理增加洗涤次数,RNA提取常见问题二：得率低,样品太多或太少RNA在柱子上未洗出洗出液中有酒精,减少或增加样品使用量加入RNaseFree,放置几分钟再离心漂洗后再次离心,RNA提取常见问题三：降解,样品不新鲜或保存不当RNase污染RNA溶液储存不当,取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存研磨样品及时补充液氮严格处理相应的器具和试剂-70 冻存，分装使用,谢谢大家！,联系我们,技术支持：010-62521767 6252607224小时热线：010-80972619免费咨询：800-810-2177E-mail：peopletw-,TIANGEN公司,福州特约经销商：厦门泰京驻福州办事处订货电话：0591-83758122 87640182 E-mail:,
