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PCR技术的原理及应用,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,DNA聚合酶,DNA聚合酶,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,DNA聚合酶,引物,引物,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,72,94,55,PCR循环,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用,提 纲,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,实时荧光定量PCR定义,常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。,实时荧光定量PCR 原理,实时定量PCR技术：,利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值,实时荧光定量PCR 原理,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: lg X0= - Ct lg(1+Ex) + lg M (3) Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,Sample,实时荧光定量PCR原理 绝对定量,提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 SYBR Green 法,SYBR Green 法,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。,SYBR Green,2022/12/30,43,可编辑,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,SYBR Green 法 融解曲线分析,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。 Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化:SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer 体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 应用范围,起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法 优缺点,本单位目前开展的工作,多种病原体定量和定性细胞因子检测（人，小鼠，大鼠等）基因表达水平检测PCR芯片,实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，FRET） Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法 工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan 法 PCR反应的建立,1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同,已肝病人血液中HBV的绝对定量目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测设置对照：浓度为106、105 、104 、103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,数据分析,分析结果： HBV DNA的精确copy数为 3.7X105,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,sample,sample,TaqMan法 应用范围,起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 单核苷酸多态性分析 (single nucleotide polymorphism ， SNP),TaqMan法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法 3 - Molecular beacon 法(分子信标),标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,Molecular beacon (分子信标) 工作原理,荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,Molecular beacon (分子信标) 应用范围,起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP分析,Molecular beacon (分子信标) 优缺点,几种方法总结,实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理,绝对定量与相对定量,绝对定量与相对定量,绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷贝数转基因的拷贝数相对定量：计算初始反应模板的相对含量差异表达分析芯片评估转基因生物的检测基因型检测,实时荧光PCR绝对定量方法,标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值,使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势,敏感性高检测低拷贝数样品：单拷贝区分小差异样品：24，48，96，大范围拷贝数样品同时检测100 1010省时有效,实时荧光相对定量,相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题解决样品材料不均一造成的差别解决加样过程中的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个内标基因拷贝,提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR法 标准样品,相对定量中的内标 内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA和体外转录的RNA,实时荧光定量PCR法标准样品DNA拷贝数,用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释,实时荧光定量PCR法 定量方法,绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相） 2-C（t） 双标准曲线法,TaqMan法举例 标记探针,使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量,Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针,TaqMan法举例 材料准备,从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的 总RNA含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 Controlsno RNA：阴性对照RNA + no reverse transcriptase：基因组对照,TaqMan法举例 反应程序,RT-qPCR 反应程序：,TaqMan法举例 症标记物表达,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,TaqMan法举例 实验结果 定量,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法举例 实验结果 定量分析,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法举例 实验结果 表达差异,HealthyTissue,Carc.Tissue,Relative Expression,ERBB2的表达差异,TaqMan法举例 实验结果 讨论,通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍。,2022/12/30,85,可编辑,