免疫电泳技术课件.ppt

免疫电泳技术,免疫电泳技术免疫电泳技术免疫电泳技术 1953年和将凝胶扩散置于直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合，从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、及免疫固定电泳等新方法。 一、免疫电泳技术的发展,免疫电泳技术免疫电泳技术免疫电泳技术免疫电泳技术 19,免疫电泳技术,1953年和将凝胶扩散置于直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合，从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、及免疫固定电泳等新方法。,一、免疫电泳技术的发展,免疫电泳技术 1953年和将凝胶扩散置于直流电场中，让,琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术。(K) 1电泳优点 （1）将蛋白电泳分开 （2）加快反应速度 2沉淀反应,（一）免疫电泳技术的定义,二、免疫电泳技术的相关概念,免疫电泳,分析,琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术。(K)（一）免疫,蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团，在一定值条件下，使蛋白质分子带正电荷或负电荷。在电场中，带正电荷的粒子向负极移动，而带负电荷的粒子向正极移动，由于各种蛋白质迁移率不同而分为不同的区带。,（二）电泳的基本原理及其影响因素,I基本原理,电泳（）:带电颗粒在电场中通过液体介质的移动，称为电泳。,蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团，在一定值条件下，使,1.颗粒（蛋白）本身特性：两性、大小、形状2.载体性质：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶 3.电场强度 4.溶液值及离子强度缓冲液的作用 最适电泳缓冲液0.05M，8.6 巴比妥缓冲液,.电泳的影响因素,1.颗粒（蛋白）本身特性：两性、大小、形状.电泳的影响因,5.电渗（主要与载体特性有关） 电渗定义 电渗方向与电泳方向的关系J 电泳迁移率：指在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。6.电源,5.电渗（主要与载体特性有关）,定 义：区带电泳 + 免疫双扩散(K)基本原理：在电场作用下，将标本于琼脂凝胶中进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂板旁挖一长形槽，加入相应抗血清，抗体呈直线扩散，电泳分离后的各种抗原呈放射状扩散，反应生成弧状沉淀线。,1.免疫电泳,三、介绍几种经典的免疫电泳技术,定 义：区带电泳 + 免疫双扩散(K)1.免疫电泳,免疫电泳,将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原彼此分离。,撤去电压，在与电泳方向平行的琼脂打槽并加入相应抗体进行双向免疫分散。,分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成弧形沉淀线。,据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。(K),免疫电泳将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原彼此分,免疫电泳操作步骤：,免疫电泳操作步骤：,结果复杂(经验判断)可不生成沉淀线（浓度太高或太低），或沉淀线重合,技术评价：,结果复杂(经验判断)技术评价：,（1）量及单克隆性与沉淀线致密度关系 （2）量与抗体槽距离之间的关系：抗原抗体最适比关系,结查分析（K）,（1）量及单克隆性与沉淀线致密度关系结查分析（K）,血清蛋白的分析，如多发性骨髓瘤、 r 球蛋白缺乏症,应用：,血清蛋白的分析，如多发性骨髓瘤、 r 球蛋白缺乏症应,2. 对流免疫电泳,定义：定向加速度的免疫双扩散技术（K）,对流免疫电泳示意图,在8.0的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。,电渗：指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。,2. 对流免疫电泳定义：定向加速度的免疫双扩散技术（K）对流,出现沉淀线洗涤、染色、分析结果,对流免疫电泳操作步骤：,制琼脂板打孔加样电泳,出现沉淀线洗涤、染色、分析结果对流免疫电泳操作步骤：制琼脂,高电渗为特点，但电渗过强会使蛋白质向阴极移动（K）对流免疫电泳简便、快速、敏感度较高抗原、抗体比例要求严格抗原或抗体相近或迁移率非常接近，不宜做对流免疫电泳,技术评价：,高电渗为特点，但电渗过强会使蛋白质向阴极移动（K）技术评价,可用于乙肝病人血清鉴定；甲胎蛋白的测定，但近年多以替代。,应用：,可用于乙肝病人血清鉴定；甲胎蛋白的测定，但近年,定义：加速度的单向扩散（J）,3.火箭免疫电泳,火箭免疫电泳示意图,基本原理：琼脂凝胶中的抗体不发生移动(K)，样品孔中的抗原向正极泳动，随抗原含量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰。,定义：加速度的单向扩散（J）3.火箭免疫电泳火箭免疫电泳示意,制备含抗体的琼脂板(K)打孔加样电泳出现火箭形沉淀线洗涤、染色、分析结果,火箭免疫电泳操作步骤：,制备含抗体的琼脂板(K)打孔加样电泳出现火箭形,“ 峰高浓度标准”曲线：以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。 唯一的定量方法（K）,火箭免疫电泳的定量测定,“ 峰高浓度标准”曲线：以不同稀释度标准抗原泳动后形,l电渗小2电泳终点时间较难掌握3开启小电流后再加样，否则形成宽底峰4电泳应先将其甲酰化，使只带负电荷,火箭电泳操作时应注意以下几点：,l电渗小火箭电泳操作时应注意以下几点：, 8.6时，分析蛋白质抗原带有负电荷免球测定应先甲酰化，以增加其净负电荷量,技术评价：, 8.6时，分析蛋白质抗原带有负电荷技术评价：,大多数蛋白质均可用这一方法进行测定，但目前已被敏感度高，特异性好的等方法代替。,应用：,大多数蛋白质均可用这一方法进行测定，但目前已被,基本原理：将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合而固定的某种蛋白。,5.免疫固定电泳(K)（ 。）,（ 型）,基本原理：5.免疫固定电泳(K)（ 型）,海伦娜免疫固定仪,海伦娜免疫固定仪,免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。 鉴定方法：先将患者血清在琼脂上等作区带电泳，之后，加抗血清，依次加抗、抗、抗、抗K轻链和抗L轻链。必要时还可加抗、抗等特殊抗血清，作用后，洗涤，染色后分析固定的M蛋白成分。该方法可用于各种蛋白水平的定性检测。,应用：,免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。应用：,1电泳载体的选择 与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电泳物质分子量大小等决定。 2凝胶打孔及处理 用打孔器在凝胶板上打孔后，要用琼脂溶液封底，以免样品渗漏。,四、凝胶免疫电泳的技术要点,1电泳载体的选择四、凝胶免疫电泳的技术要点,3加样 加样时琼脂板应先通上微弱电流，以免样品过多自由扩散。 4选择抗原与抗体比例 适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物，选择抗原和抗体的比例尽量减少前后带现象的发生。,3加样,5检测方法 如果沉淀线理想，通过肉眼观察即可定性。 在一些定量测定中，往往辅助以下方法来提高检测的敏感度。 (1)染色 (2)光密度测定法 (3)放射性自显影,5检测方法,6干燥与保存 （1）除盐及游离蛋白质后，干燥 （2）保存 将染色片浸泡在 5l0甘油中30，保存效果更好。,6干燥与保存,五、免疫增殖性疾病及免疫检测(重点：临床和检验特点),免疫增殖病淋巴细胞异常增殖,免疫球蛋白异常增生性疾病（浆细胞异常增殖 ）,良性增殖：常多克隆增殖,恶性增殖：常单克隆增殖,五、免疫增殖性疾病及免疫检测(重点：临床和检验特点)免疫增殖,免疫球蛋白恶性增生性疾病的免疫损伤,1.免疫球蛋白合成异常,血液粘稠增加,2.正常体液免疫抑制,3.免疫球蛋白或其片段可以沉积于组织，激活细胞免 疫或补体系统,造成器官损伤,4.浆细胞瘤的浸润性生长,溶骨性病变,免疫球蛋白恶性增生性疾病的免疫损伤 1.免疫球蛋白合成异常,多发性骨髓瘤（）,特点,I. 介绍几种免疫球蛋白异常增生性疾病,贫血,肾功损害,免疫功能障碍,骨痛,高粘血症,临床特点,检查特点,正常的免疫球蛋白含量明显降低,血M蛋白或尿本周蛋白,骨髓发现大量浆细胞,溶骨性损害,多发性骨髓瘤（）特点I. 介绍几种免疫球蛋白异常增生性疾病贫,检测方法：火箭和对流用于检测有无抗体，检测效果不好（K）,1.血清蛋白电泳M蛋白,2.尿本周氏蛋白检测,3.免疫检测方法,免疫电泳,免疫固定电泳,免疫球蛋白及轻、重链定量,检测方法：火箭和对流用于检测有无抗体，检测效果不好（K）1.,免疫固定电泳,免疫电泳,免疫球蛋白定量,免疫固定电泳 免疫电泳 免疫球蛋白定量,巨球蛋白血症,特点,好发于老年男性,血粘滞过高综合征,临床特点,检查特点,其它免疫球蛋白常在正常范围,血蛋白,淋巴结、肝和脾肿大,巨球蛋白血症特点好发于老年男性 血粘滞过高综合征 临床特点检,重链病：重链的不同可分为型 、型 、型,特点,贫血,细菌感染,淋巴结肿大,临床特点,检查特点,正常的免疫球蛋白含量可降低,重链 ,重链病：重链的不同可分为型 、型 、型 特点贫血细菌感,轻链病：型、型（此型预后差）,特点,发热,肾功能损害,临床特点,检查特点,免疫球蛋白水平可降低或正常,轻链 ,贫血,溶骨性损害,轻链病：型、型（此型预后差）特点发热肾功能损害临床特点检,良性单克隆免疫球蛋白增殖病,特点,无明显临床症状,临床特点：,检查特点,其它免疫球蛋白常在正常范围,有M蛋白，但其并不呈进行性增加,良性单克隆免疫球蛋白增殖病特点无明显临床症状 临床特点：检查,小结,免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳和免疫固定电泳的定义、原理及技术要点,几种免疫增殖性疾病的临床特点和检验特点,小结免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳和免疫固定电泳的定义,谢 谢,谢 谢,谢谢！,谢谢！,