免疫原和抗血清的制备多媒体课件.ppt

第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备,第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制,第三节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法,第一节 免疫原的制备第二节 免疫佐剂第三节 抗血清的制备,第四节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存,第五节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清,思考题小结,第四节 抗血清的鉴定和保存第五节 抗血清的纯化思考题,基本要求：掌握：免疫原、抗血清的制备过程。掌握：抗血清的鉴定方法、抗血清的纯化方法,基本要求：,抗原抗体是免疫学检测的重要因素。抗原纯化是制备特异性抗体的先决条件。制备高效价高特异性的抗血清必须有理想的免疫原。通过抗血清的制备而获得特异性的抗体可用于纯化抗原和检测或鉴定抗原。抗体有来自单克隆抗体、免疫动物的多克隆抗体和基因工程的抗体。,抗原抗体是免疫学检测的重要因素。,第一节 免疫原的制备,免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。颗粒性抗原细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸,第一节 免疫原的制备 免疫原(immunogen)是,细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵,一、颗粒性抗原的制备,细胞抗原：绵羊红细胞 一、颗粒性抗原的制备,颗粒性抗原的制备,颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及各种细菌抗原和寄生虫体抗原。 细胞抗原：（绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水洗净，配制一定浓度的细胞悬液，即可应用。,颗粒性抗原的制备,免疫原的制备,细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。鞭毛抗原需用03%05%的甲醛处理；菌体抗原加温100225h去除鞭毛抗原；毒素抗原则在杀菌后再加05%10%氯化钙溶液等。颗粒抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。,免疫原的制备细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。,蛋白质、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体和核酸都是良好的可溶性抗原。这些蛋白质多为复杂的蛋白组成，免疫前需进行纯化。,二、可溶性抗原的制备和纯化,二、可溶性抗原的制备和纯化,组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法组织捣碎机捣碎 研磨法用玻璃匀浆器或乳钵研磨,（一）,二、可溶性抗原的制备和纯化,组织细胞抗原的制备：二、可溶性抗原的制备和纯化,高速组织捣碎机法：将组织加盐水装入捣碎机筒内，间断进行离心，每次30到6 0分钟，时间过长会导致产热。研磨法：用玻璃均浆器或乳钵研磨，经过旋转、压挤将组织粉碎。组织均浆液要离心沉淀，沉淀物组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。,二、可溶性抗原的制备和纯化,高速组织捣碎机法：二、可溶性抗原的制备和纯化,组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备制备抗原的细胞包括正常的细胞、传代细胞或肿瘤细胞。细胞抗原一般分为三个部分：膜蛋白抗原、细胞质抗原（细胞器）和细胞核与核膜抗原。,二、可溶性抗原的制备和纯化,组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化,免疫原和抗血清的制备多媒体课件,组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 反复冻融法-20冻结，然后室温融化 超声破碎法超声波（120kHz） 自溶法自身酶系 酶处理法溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴,组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：,反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可冻融破碎。超声破碎法：利用超声波机械振动的原理使细胞破碎。常用于处理微生物和组织的细胞。,反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20冰箱内冻结，然后置室温,自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一定PH和温度下，使其细胞裂解。酶处理法：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等，在一定的条件下能消化细菌和组织细胞。表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。,自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一定PH和温度下，使,超速离心法： 差速离心法低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法区带离心法,（二）可溶性抗原的纯化,超速离心法：（二）可溶性抗原的纯化,超速离心分离法,常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。差速离心法：用于分离大小差异较大的抗原颗粒梯度密度离心法：区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒分离。（梯度柱）。,超速离心分离法常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。,选择性沉淀法： 核酸去除法氯化锰、硫酸鱼精蛋白、链霉素 盐析法硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮 聚合物沉淀法聚乙二醇,选择性沉淀法：,选择沉淀法,采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分沉淀的方法。核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简单（采用DNA或RNA酶）有机溶剂沉淀法：使用的有机溶剂多为乙醇或丙酮。,选择沉淀法采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分沉淀的方法。,选择沉淀法,盐析沉淀法 经典的蛋白质纯化分离技术 抗原的初筛：用不同饱和度的硫酸钠或硫酸铵使蛋白抗原进行初筛。提取丙种球蛋白:（IgG95%以上）将33%50%饱和度硫酸胺沉淀物经去盐后可直接用于抗体试剂。抗原的浓缩：通过加入硫酸铵，将其沉淀下来，以利于进一步纯化。,选择沉淀法盐析沉淀法 经典的蛋白质纯化分离技术,离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂： 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂,凝胶过滤法： 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离,离子交换层析法：凝胶过滤法：,凝胶过滤,分子筛层析，具有三维空间 多孔网状结构的物质。将含多种分子量的样品溶液 缓慢流经凝胶柱时，各分子 在柱内进行两种不同运动， 垂直向下移动和无定向扩散运动。通过凝胶分子筛作用，大、中、 小三类分子彼此较易分开。,凝胶过滤分子筛层析，具有三维空间,离子交换层析,离子交换层析是利用一些带电离子集团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。1、具有离子交换集团的纤维素。2、具有离子交换集团的交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺。3、被覆以离子化物质的细粉。4、凝胶合成的高度交联树脂。,离子交换层析离子交换层析是利用一些带电离子集团的凝胶或纤维素,亲和层析,是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间具有的专一性亲和力的层析技术。在一定条件下，二者能紧密结合成复合物，如将复合物的已知一方固定在固相载体上，则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。,亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间具有的,亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择：非特异性吸附低；液体流速快；在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结 合；有丰富的微孔，以增加结合容量。最常用的支持物是Separose4B（琼脂糖珠）,亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力,(2)配体的选择条件：抗原或抗体必须单一特异性；抗原与抗体必须具有较高的亲和力；配体必须有一个适当的化学基团。,(2)配体的选择条件：,亲和层析,抗原或抗体与支持物的结合将抗原或抗体结合到支持物上的方法达数十种，可归纳为载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法。结合法的步骤是先活化支持物上的功能集团，抗原抗体连接到这些活化的集团上。,亲和层析抗原或抗体与支持物的结合,(4)亲和层析条件的选择： 封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺过柱；除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；解脱剂：3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液,(4)亲和层析条件的选择：,制备菌体抗原的方法是A 100加温2小时 B 0.5%甲醛C 75%乙醇 D 1%氯化钙E 2氯仿,制备菌体抗原的方法是,分离亚细胞成分最常用的方法是A 凝胶过滤法 B 低速离心法C 超速离心法 D 选择性沉淀法E 高速离心法,分离亚细胞成分最常用的方法是,配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为A 103ml B 104ml C 105ml D 106ml E 107ml,配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为,颗粒性抗原免疫接种的方法通常采用A 皮下注射 B 淋巴结注射C 肌肉注射 D 皮内注射E 静脉注射,颗粒性抗原免疫接种的方法通常采用,免疫球蛋白片段的制备,免疫球蛋白具有抗体活性，五类免疫球蛋白都能用纯化的方法提取出来。将其分解成片段，如Fab段、Fc段和轻链等作为免疫原制备抗血清，能制得分辨能力更高的特异性抗体，制备方法如下：,免疫球蛋白片段的制备免疫球蛋白具有抗体活性，五类免疫球蛋白都,免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法改变pH 、利用强变性剂 共价键解离法氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法木瓜酶 、胃蛋白酶,免疫球蛋白片段的制备：,酶裂解法,酶对免疫球蛋白的水解有极好的专一性。如木瓜蛋白酶可将IgG裂解成一个Fc和两个Fab片段；胃蛋白酶可将水解成F（ab）2和数个小片段；胰蛋白酶将IgG切成不规则肽链。用木瓜酶水解得到的Fc段作为抗原制备重链血清，胃蛋白酶水解抗体试剂用。,酶裂解法酶对免疫球蛋白的水解有极好的专一性。,免疫原和抗血清的制备多媒体课件,（三）纯化抗原的鉴定,蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA,（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试,三、半抗原性免疫原的制备,半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等,载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质,三、半抗原性免疫原的制备 半抗原(hapten)：仅,蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白 牛甲状腺球蛋白 血蓝蛋白多肽聚合物：多聚赖氨酸（polylysine） 大分子聚合物：羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC) 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）,（一）载体,蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白（一）载体,物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原 吸附的载体有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等,（二）半抗原与载体的连接方法,化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法 戊二醛法 混和酸酐法 过碘酸氧化法 不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与载体连接,物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原（二）半抗原与载体的,（三）半抗原性免疫原的鉴定,一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子,半抗原与载体的比例测定：吸收光谱分析法放射性核素标记半抗原渗入法,（三）半抗原性免疫原的鉴定一个载体分子至少要连接20个以上的,制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体是A 牛血清白蛋白 B牛甲状腺球球蛋白C 人血清白蛋白 D 人甲状腺球蛋白E 兔血清白蛋白,制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体是,第二节 免疫佐剂,免疫佐剂：那些与抗原一起或先于抗原注入机体后，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂.,第二节 免疫佐剂免疫佐剂：那些与抗原一起或先于抗原注入机体后,非免疫原性的佐剂:氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、人工合成的多聚肌苷酸和胞壁肽。 具有免疫原性的佐剂:如卡介苗、枯草分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰氏阴性杆菌内毒素（脂多糖）和细胞因子。,用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly IC、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freunds adjuvant),一、佐剂的种类,非免疫原性的佐剂:氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、,弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)：弗氏完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗,乳化方法： 研磨法和搅拌混合法,弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)：乳化方法：,细胞因子佐剂与抗原合用，可以更有效激发机体免疫功能，增强免疫反应。白细胞介素2（IL2）、IL1、干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（CSF，GMCSF）具有佐剂作用。抗寄生虫或肿瘤疫苗研究应用中，在细胞因子佐剂辅助下，刺激机体产生具保护作用的细胞免疫。,一、佐剂的种类,细胞因子佐剂与抗原合用，可以更有效激发机体免疫功能，增强免疫,1、增强免疫原性 使弱免疫原性物质变成持久或强的免疫原。2、增加抗体的滴度 提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度。3、引起或增强迟发性超敏反应 由于佐剂作用引起过强的免疫应答导致病理生理反应。,二、佐剂的免疫生物学作用,1、增强免疫原性 使弱免疫原性物质变成持久或强的免疫原。,改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。 刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。 刺激淋巴细胞增殖和分化。,三、佐剂的作用机制,改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。,第三节 抗血清的制备,抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体,第三节 抗血清的制备 抗血清的制备是将制备好的免疫,多克隆抗体的产生示意图,多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物,多克隆抗体的产生示意图多克隆抗体(polyclonal an,抗原来源与动物种属的关系 种属差异越远，免疫原性越强 动物个体的选择 适龄、健康、体重符合要求 抗原的性质IgE对绵羊，胰岛素对家兔免疫后不易出现抗体,一、免疫动物的选择,抗原来源与动物种属的关系一、免疫动物的选择,免疫原的剂量 中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 免疫间隔时间 第一次和第二次间隔1020天，三次及以后间隔710天免疫途径 皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结,二、免疫方法和途径,免疫原的剂量二、免疫方法和途径,抗体产生的阶段：1、静止期（2天）血液中无抗体，仅有抗原。2、指数期（4天）动物体内抗体水平上升，抗体含量67天达高峰3、稳定期（24周）相对稳定水平4、下降期（几个月至一到两年）,二、免疫方法和途径,抗体产生的阶段：二、免疫方法和途径,颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊,三、动物采血法,颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 三、动物采血法,第四节 抗血清的鉴定和保存,第四节 抗血清的鉴定和保存,抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验,一、抗血清的鉴定,抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法一、抗血清的鉴定,在琼脂平皿上打两排孔，一排放抗原粗提物和纯化抗原，另一排加抗血清，37温箱，进行双向扩散1824h后，观察两排孔的沉淀线。抗血清与粗抗原出现一条线，产生单价特异性抗体,双向免疫扩散对抗体特异性鉴定,双向免疫扩散对抗体特异性鉴定,双向免疫扩散法对抗体效价的鉴定,测定抗体效价有两种稀释方法：1、稀释抗血清，倍比稀释，分别与一个浓度的纯抗原反应。2、同时稀释抗原和抗血清，即将抗原作倍比稀释或按浓度稀释，分别与不同浓度抗血清进行双扩散试验。鉴定纯化方法：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）,双向免疫扩散法对抗体效价的鉴定测定抗体效价有两种稀释方法：,28保存：短期保存冰冻保存：保存5年真空干燥保存：保存510年,二、抗血清的保存,28保存：短期保存二、抗血清的保存,第五节 抗血清的纯化,抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。,第五节 抗血清的纯化 抗原免疫动物制备的抗血清是成分复,盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层析柱,一、特异性IgG抗体,盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 一、特异性IgG抗体,单价特异性抗血清,血清只与其特异性抗原发生反应。免疫原不纯，含有微量的杂抗原，制备出的抗血清出现23种杂抗体。即使用纯抗原，用高度纯的IgG免疫动物，出现的抗体总会有抗r重链的抗体。,单价特异性抗血清血清只与其特异性抗原发生反应。,亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗 原混合液制成固相吸附剂,二、单价特异性抗血清,亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱二、单价特异,1什么是免疫原？ 2如何制备可溶性抗原？ 3常用的细胞破碎方法有哪些？ 4连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方法有哪些5什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的作用机制有哪些 6抗血清的鉴定包括哪些内容？,思考题,1什么是免疫原？ 思考题,弗氏完全佐剂的组成包括A 液体石蜡、羊毛脂、卡介苗B 液体石蜡、羊毛脂C 液体石蜡、卡介苗D 羊毛脂、卡介苗E羊毛脂、卡介苗、氢氧化钠,弗氏完全佐剂的组成包括,A 反复冻融法 B 研磨法C 酶处理法 D 超声破碎法E 表面活性剂处理哪项不属于可溶性抗原的制备方法制备蛋白质抗原时，破碎组织细胞最常用的方法是,A 反复冻融法 B 研磨法,制备免疫球蛋白重链片段时，用于裂解免疫球蛋白的酶最好选用A 木瓜蛋白酶 B 胃蛋白酶C 限制性核酸内切酶 D 胰蛋白酶E 胰肽酶,制备免疫球蛋白重链片段时，用于裂解免疫球蛋白的酶最好选用,制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体是A 牛血清白蛋白 B牛甲状腺球球蛋白C 人血清白蛋白 D 人甲状腺球蛋白E 兔血清白蛋白,制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体是,免疫小鼠采血通常采用的方法是A 颈静脉采血法 B 耳颈静脉采血法 C 摘除眼球或断尾法 D 心脏采血法 E颈动脉采血法,免疫小鼠采血通常采用的方法是,小 结,免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质，与载体结合后可具有免疫原性。 免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。 特异性IgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。,小 结 免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物,