第6章 色层分离法课件.ppt

第六章 色层分离法,6.1 概 述6.2 柱层析6.3 纸层析6.4 薄层层析,色层分离法又称层析法或色谱分离法，它的最大特点是分离效率高，能把各种性质及相近的物质彼此分离。现代的色谱分离技术就是在此基础上发展而来的。色层分离最早是由波兰植物学家M茨维特提出来的。他在叶绿素的石油醚溶液流经装有碳酸钙的管柱时，发现碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，于是在管柱中出现了不同颜色的色谱带，因此称这种分离方法为色层分离法或色谱分离法。,6.1 概 述,层析法的发展史,层析分离图示,“层析的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。” 马丁（A. J. P. Martin）（英）,一、层析法的条件 层析法应具备的因素或条件是： 1. 具有两相 固定相固定不动的一相 流动相即携带样品流过固定相的流动体。 2. 混合物中各组分的物理化学性质有差异 3. 多次展开,6.1 概 述,二、层析法的分类, 根据层析机理不同的划分, 根据操作技术的划分,二、层析法的分类, 根据固定相的状态划分：,二、层析法的分类, 根据流动相的物态不同的分类,二、层析法的分类,各种层析法的机理及优缺点,6.2 柱层析,一、吸附柱层析二、分配柱层析,柱层析分离的原理示意图,柱层析分离的基本原理示意图,t0,一、吸附柱层析 1. 原理 吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。,6.2 柱层析,一、吸附柱层析,吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其表面具有许多吸附中心（或称吸附位置），吸附中心的数量多少以及吸附能力强弱直接影响其吸附性能。当流动相载着溶质A缓缓流过层析柱时，溶质A在固定相和流动相中不断的进行吸附、脱附、再吸附、再脱附的过程。,6.2 柱层析,1、分配系数,在一定的温度下，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律： KD= Cs/Cm KD为分配系数 Cm，Cs 分别为流动相和固定相中的溶质A的浓度。应用条件：温度一定 低浓度,一、吸附柱层析,试样中各组分的分配系数有差异，分配系数大的组分，在柱中被吸附得较牢，在固定相中保留的时间较长，不易被洗脱下来，而分配系数小的组分被吸附得较不牢，在柱中保留时间较短，易被洗脱下来。洗脱时，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。,一、吸附柱层析2、吸附等温线 吸附等温线：某种组分在吸附剂表面的吸附规律。包括：线形和非线性。,（1）线性吸附等温线,Cm：溶质A在流动相中的浓度Cs：溶质A在固定相中的浓度当溶质A在随流动相缓慢流过层析柱的固定相时，在两相中不断吸附、脱附达到平衡 Cm Cs （吸附平衡） KD= Cs/Cm,Cs 固定相,Cm 流动相,洗脱曲线若测定流出液中A的浓度，绘制CV的曲线，则得到洗脱曲线（又叫洗提曲线）。为一对称的层析图谱 。,C,V,（2）非线性吸附等温线,吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数是不同的。吸附能力强的吸附中心，溶质在其上的分配系数KD较大，溶质分子将首先占据它们，其次再占据较弱的、弱的和最弱的吸附中心。随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心逐渐被饱和，其分配系数也渐变小。因此吸附等温线逐渐向下弯曲形成凸形。洗脱时，由于数量较多的弱的和较弱的吸附中心上的溶质先被洗下，因而溶质集中的区域前进较快，接着较少的强吸附中心的溶质后被洗下流出，出现拖尾峰。,3. 吸附剂的选择, 吸附剂应具有合适的吸附力。 颗粒均匀、大小适宜。 吸附与解吸可逆。 不含杂质。 不溶于所使用的溶剂（即洗脱剂），与欲分离的物质不发生化学反应。,常用吸附柱介质,无机物吸附介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。聚合物吸附介质有：琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等,（1）Al2O3（中性、酸性、碱性）,I） Al2O3分类中性：适用于醛，酮，醌，酯，内酯及苷的分离酸性：酸性化合物如酸性色素，氨基酸等碱性：生物碱，醇及其它中性和碱性物质一般地，能用酸性或碱性Al2O3分离的也能用中性Al2O3分离,II） Al2O3的活性 活度级I级增强 吸附能力 I 减弱 在不同的温度下活化氧化铝： 加热至 100150 活化有一定活性 150 III级 300400 IVVI 600 脱水开始烧结每一批Al2O3表面积和表面孔结构不一致，活性不同一般，分离极性较强的组分用活性弱的吸附剂；分离弱极性的组分用活性强的吸附剂。,（2）硅胶,弹性多聚硅酸脱水制的 硅氧烷不具吸附性表面孔穴较小的硅酸吸附能较强用途：微酸性，吸附能力较Al2O3 弱，可分离酸性和中性物质，如有机酸，氨基酸，萜类，甾（胆固醇及激素属于甾类化合物）类,弹性多聚硅酸脱水 OHOH SiOSi SiOH SiSi 硅氧烷 游离型硅酸醛 束缚型 活泼型 硅酸醛 硅酸醛 a b c d,（3）聚酰胺,乙内酰胺聚合：聚己内酰胺，锦纶可与酚类，酸类，醌类，硝类化合物形成氢键而分离。形成氢键基团的吸附能力大对、间位形成氢键邻位（空间位阻）芳香族由于共轭吸附能力大,由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 中性不带电水溶性线状多糖高亲水性，含大量羟基能制成多孔性凝胶，分离大分子制备： 去除带电琼胶成分 将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。 采用交联剂增加介质的机械强度,（4）琼脂糖,（5）葡聚糖,-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒。性质：（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）（2）化学稳定性及热稳定性好（3）孔度与机械强度与交联度有关（4）用于凝胶过滤分子筛应用：水溶液中分离蛋白质等,（6）纤维素,-1,4 相连的D-葡萄糖（偶而有1，6 键合）线性天然高聚物。（1）亲水（2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度大孔珠状纤维素（1）高孔度（2）高机械强度（3 ) 亲水性强 应用：离子交换分离蛋白质介质,性质： （1）丙烯酰胺与交联剂N, N-甲叉双丙烯酰 胺共聚。（2）烷烃骨架与酰胺侧链（3）控制交联剂比例可控制网格孔度（4）亲水好，但不如多糖介质 (5) 机械强度差应用：（1）凝胶过滤 （2） 电泳介质,（7）聚丙烯酰胺,4、流动相及其选择,(1)流动相洗脱过程的实质：流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性组分选强极性的流动性洗脱，反之相反。 (2)功能团极性： 有机分子基本母核相同时，取代基极性增强，整个分子极性增强；极性基团增多，整个分子极性增强。分子中双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力强。分子形成内氢键，吸附力弱于不能形成内氢键的化合物。,烷烃（CH3 ，CH2 ）烯烃（CH= CH）醚类（OCH3，OCH2）硝基化合物（NO2）二甲胺酯类（COOR）酮类（ C=O）醛类（CHO） 硫醇（SH）胺类（NH2） 酰胺 醇类（OH）酚类（ArOH）羧酸类（COOH）,（3）常用流动相极性： 石油醚环己烷二硫化碳CCl4三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸在某些情况下可用混合流动相聚酰胺柱层析可采用水溶液：乙醇水溶液，丙酮水溶液等溶解试样用的溶剂极性应与流动相相近,5. 洗脱方法及流出曲线 有色物质分离的洗脱方法 推出法：有色物质分离后，将吸附剂从柱中推出，用刀按层切开，分层洗脱再定量。 无色物质分离的洗脱方法及流出曲线 无色物质分层后，可采用流出曲线加以判断。 流出曲线：以物质浓度为纵座标，以收集的洗脱液体积为横座标，得出的曲线。,柱层析的洗脱方法,洗脱一般有三种方法：恒定洗脱法：逐次洗脱法：梯度洗脱法：梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。,恒定洗脱,分 步 洗 脱,梯 度 洗 脱,洗脱剂的选择, 样品在溶剂中具有一定溶解度。 一般采用无水溶剂，且与水不互溶。 溶剂沸点适宜。 纯度要高，无杂质。,二、分配柱层析,分配柱层析是根据欲分离组分在两种互不混溶或部分混溶的溶剂间的溶解度差异来实现分离的。这两种互不混溶的溶剂一个是流动相，另一个被吸收在载体中，被称为固定相。流动相载着试样中的各种组分沿着层析柱流动时，试样中的各种组分就在流动相和固定相间进行分配，当不同组分的分配系数有差异时，它们在层析柱中的前进速度就不相同，于是得以分离。,二、分配柱层析,1. 原理 分配层析是根据混合物中各组分在两种不相混溶的溶剂间溶解度（即分配系数）的不同，使各组分得以分离。 分配系数K：当溶质在两种不相混溶的溶剂中达到平衡时，溶质在两种溶剂（即两相）中的浓度比值为一常数，称分配系数。 各种组分具有各自的分配系数K，同一物质，温度不同时，K不同。 在分配的各组分中，某组分K，则固定相中浓度， K ，后出柱。,2. 固定相与流动相 固定相：由载体和一种溶剂（多为水）组成。 流动相：一般是与水互不相溶的有机溶剂 。 当流动相是水或水溶液，固定相液体是有机溶剂时，称为反相分配层析。,分配柱层析,常用的载体有：硅胶、纤维素、硅藻土等；常用的固定相有：水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂。流动相一般是与水互不相溶的有机溶剂，如正丁醇、正戊醇等。分配柱色谱常用来分离极性极强的、亲水性的物质，如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等。,3. 移动速率 主要是用于比较各组分移动速度的大小，即在同一时间内，各组分移动距离的大小，作为定性之用。 = =,6.3 纸层析,特点：微量操作技术，简便、分离效率高，但分离速度慢。,纸层析(Paper chromatography) 是在滤纸上进行的色谱分析法。 一、定义 将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性和定量的液-液分配层析法。 纸层析和萃取一样，也是根据不同物质在两相间的分配比不同而进行分离的（相当于逆流萃取）。,6.3 纸层析,6.3 纸层析,二、基本原理固定相滤纸是一种惰性载体，滤纸纤维素中吸附着的水或其它溶剂作固定相。 流动相（展开剂） ：沿着滤纸流动的溶剂 ( 一般为有机溶剂 )。试液点在滤纸上，在层析过程中，试液中各组分，因其在两相中的溶解度不同， ( 也就是 分配系数KD 不同 ) ，因而得到分离。其原理与萃取相似。它是一种分配层析。溶质在固定相与展开剂之间反复分配。在固定相中分配系数大而在展开剂中分配系数小的，在纸条上移动速度慢，停留在纸条的靠近原点端。,1.层析缸 2.滤纸 3.原点 4.展开剂 5.前沿 6.7.斑点,6.3 纸层析,1. 纸色谱的基本原理,x,y,Rf的计算,2. 比移值Rf,组份分离后,它们在滤纸上的位置用比移值Rf 表示。,定义:,6.3 纸层析,比移值Rf的大小取决于各组分在二相间的分配系数及滤纸的性质。不同的组分具有不同的分配系数, 因而也就有不同的Rf。这就是定性的依据。,6.3 纸层析,3. 影响Rf的因素,(1)欲分离物的性质:物质在两相的分配系数,决定了它的Rf大小;；(2)展开剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。通常应选这样的层析剂，使溶质的Rf在0.05 0.85之间,不同组分的Rf差值 0.05。(3)pH:影响它们的存在状态。(4)滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质,(5). 温度:在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过 0.5oC。(6). 展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf较小，环行法的 Rf也不大。,四、操作技术1、载体 (滤纸)（1）滤纸的选择 a. 要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐 b. 要求滤纸的纤维松紧适宜 c. 滤纸的杂质含量少,6.3 纸层析,（2）层析滤纸的性能与规格,（3）滤纸的处理 以0.1 0.4 mol/L HCl (或 2 mol/L HAc)浸泡数小时, 除去无机杂质后, 取出用蒸馏水洗净, 再将滤纸放在丙酮-乙醇( 1 : 1 )中浸泡一周时间, 除去有机杂质, 再取出风干备用。,6.3 纸层析,2、固定相 纸层析以吸着在纤维素上的水作固定相。反相纸层析用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。,3、 试样（1）试样的溶解 尽量避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体样可直接点样。,四、操作技术,（2）点样方法a、先用铅笔在距纸条一端2 3 cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下示意图：,b 点样工具：微量注射器、毛细滴管（0.5 mm),c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样的斑点直径为0.2 0.5 cm, 每次点样2 20 m于滤纸上，以冷风吹干；,d. 干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。,4、 展开 （1）展开剂的选择欲分离物在两相中的溶解度；展开剂的极性展开剂与欲分离物间应无化学反应欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在两相间能瞬间达到分配平衡常用的展开剂水、饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等。,（2）展层方法 展层前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。 方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。,A .上行展开法,将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但不能浸没点样处）上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3 4 cm 时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）。,对于 Rf 十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法。,纸条的上端暴露在层析缸外，以便令上升的溶剂挥发；只要保持纸条下端与溶剂面接触，溶剂便能不断地上升而挥发，展层过程就自动连续地进行；若溶剂沸点100oC，则可在纸条暴露部分用红外灯烘烤，促使溶剂挥发； 该法不能测量前沿，但可达分离的目的。,玻片,玻璃棒,原点,玻皿,剪成锯齿状，便于溶剂滴下,B.下行展开法,溶剂自滤纸条的上端向下降（借助于重力的作用），具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。,C. 环行法 又叫径向展开法。这是一种既快又方便的方法。取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。,D.双向展开法,有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。,若前后二次展开剂选择适当，可使各种组份完全分离。例如，氨基酸的分离可用此法。双向展开法也可以二次使用同一种展开剂展层。,5、 显色,展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作记号。,a. 有色物：直接观察各个色斑,无色物：物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。,6、分析A.定性分析：各组分有各自的Rf。为了查明未知物的组成，最好是在同样条件下与已知的纯物质做对照实验。,化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂，若被分离的物质含有羧酸，可喷酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。,x,y,Rf 的计算:Rf = x / y,x1,x2,y,Rf 的计算:Rf 1= x1 / yRf2 = x2 / y这样每一个斑点用两个Rf 来描述。,B.定量分析剪洗法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用各种仪器方法（如红外、紫外、原子吸收、发射光谱）测吸光度，也可将斑点剪下灰化，再用适当的溶剂溶解，测之。比较法：经纸色谱将各种组份分开后，可在相同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比较，确定其可能的含量。,五、纸层析的应用,例氨基酸的分离（固定相为水）,例2. 糖的分离(固定相为水),例脂肪酸的分离（固定相为水）,例4. 胺类的分离（固定相为水）,例5. 醇、酚的分离（固定相为水）,例 核酸降解物（核苷酸、嘌呤、嘧啶碱基）的分离（固定相为水）,例. 其它类的分离（固定相为水）,例8无机应用（固定相为水）,例9生物学应用,Fe,Cu,Co,Ni,Ni,Ni,Ni,Ti,Mo,黑毛,红毛,黄毛,白毛,兔毛的色谱图,以兔毛作实验，分离结果如右图。,取不同颜色兔毛(300 500 mg), 干法灰化, 溶于稀HCl 中,用丙酮 : 丁醇 : HCl = 10 : 4 : 2, 展开后,显色,6.4 薄层色谱,薄层层析,薄层层析：把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，层析就在玻璃板上的薄层中进行。把试样点在层析板的一端，把层析板放入层析缸中，使点有样品的一端浸入流动相展开剂中，试样中的各种组分沿着薄层在固定相和流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解再吸附的分配过程，以致相互分开。,6.4 薄层色谱法,一、薄层层析的特点,优点 快速：只需10-60 min 分离效率高，灵敏度高 装置简、操作方便 样品负荷量大、斑点扩散少缺点Rf值的重复性差克服办法标样和试样在同一块板上展开,二、固定相（吸附剂） 决定吸附性能的因素：吸附剂的化学组成、活性、表面积。,要求：合适的吸附力与展开剂、被吸附物质均不起化学反应粒度细小而且均匀（范氏方程，减少涡流扩散项）,6.4 薄层色谱法,(1). 氧化铝 氧化铝呈微弱碱性，酸性较强的化合物在氧化铝上吸附的很牢（所以，酸性物质分离不好），故通常用于分离碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定的中性物质、碱性物质。,一般要求薄板用的活性为 级,氧化铝的活性与含水量密切相关（含一定量的水份时，吸附剂表面的吸附中心回被水分子占据）。,故加热驱除水活化；吸附一定量的水失活,100 150oC, 除去Al2O3中与羟基结合的部分水份，使Al2O3有一定的活性；150 300oC， Al2O3活性达 级；300 400oC，Al2O3活性达 级； 600oC， Al2O3进一步脱水并开始烧结。,由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批生产的Al2O3 ，其表面积和表面孔穴结构并不一致，活性也不相同。,Al2O3活性的测定：取20 L染料溶液（偶氮苯30 mg、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各20 mg ，溶解于50 mL CCl4中），加到薄板上，用CCl4展层，根据下表确定活性。,市售的供薄层色谱用的Al2O3有:Al2O3 H氧化铝中无粘合剂Al2O3 G氧化铝中含煅石膏（一般5煅石膏） 煅石膏CaSO4，作为粘合剂Al2O3 HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示剂 （在254 nm下呈黄绿色荧光）Al2O3 GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示剂 （在254 nm下呈黄绿色荧光）上述商品可以直接调料涂敷（1份料，2份水调和）,（）硅胶（吸附性较Al2O3弱）,硅胶是微酸性吸附剂，且适用于酸性、中性物质的分离（如有机酸、氨基酸、萜类、甾体）。碱性物质则能与硅胶作用（当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好的分离）。,注:硅胶薄层的活化温度不能高于200oC,硅胶的结构为:,硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各40mg溶于100 mL 苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开10 cm，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，其Rf值分别为：二甲黄0.58，苏丹红0.19，靛酚蓝0.08（展层时间30 45 min），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与Al2O3活性 级相当。,薄层用商品硅胶有：硅胶H（不含粘结剂）硅胶G（含粘结剂煅石膏）硅胶HF254（含荧光物质的硅胶）硅胶GF254（含有煅石膏和荧光剂）,此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。,选择吸附剂的规律：,极性物质 被 极性表面的吸附剂吸附；亲水性的吸附剂适用于在非水溶液中吸附物质疏水性的吸附剂适用于在水溶液中吸附物质,三、铺层方法,1干法铺层“干板或软板” 适用于颗粒粗，分离效率差。氧化铝常用此法，2湿法铺层：加水或其它溶液调糊状“硬板”倾倒法：（根据玻璃面积及铺层厚度）称取一定量吸附剂，按比例加水（或其它溶液）调糊状，立即倾倒在玻璃上大致推开，轻轻颠动玻璃板，使其自动 成均匀薄层，水平放置1020min 结后阴干备用或活化后备用刮层法,（1）制板,A、玻璃板 a .平整、去油、去污（可用浓H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干）b. 玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选择，小的可用2.57.5cm的载玻片, 大的可用20 20cm的玻片。,B、涂布液 取一定量的吸附剂放入研钵中，加入需要的水或适当的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，即成胶状物，色泽洁白为最佳，立即倾入玻璃板上，用下述方法涂布。涂布方法 玻棒涂布 玻片刮涂 倾斜涂布（利用流平性）：简单，但均匀性差 涂布器,层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。,（2）活化 薄板首先风干，否则湿板一下加热到高温，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。 氧化铝G板在150 160oC, 烘4小时(级左右) 硅胶G板在110oC烘1小时 薄板经活化后，一定要储藏在密闭的干燥器或烘箱中备用。,四、展开剂、点样和展开,1展开剂的选择吸附层析：根据极性的不同来选择流动相a活度小b微量环技术c微型薄层分配层析：根据试样中各组分在展开剂中溶解度的不同和纸层析相似,展开剂的选择,2、点样：快，量适当适当的点样量，集中的斑点是得到一个好的层析的必要条件。如何才适当？不同的分离要求、不同的薄板（有厚有薄）、不同的吸附剂（性能不一），需要不同的点样量。从下图可见：点样量少了，不易检出；点样量多了，易拖尾或扩散，影响分离效果。,0.1,2,50,300,0.5,0.3,0.1,Rf,g,用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。,15cm,2.5cm,1.5cm,溶剂前沿,纯物质的鉴定，若又有高灵敏度的显色剂，点样量只需g或ng；若进行天然物或中间产物的分离时，点样量需50 g几百微克；若进行制备色谱，进样量可达1mg。点样时可用内径约1mm，管口平整的毛细管或微量吸管吸取试液后，轻轻接触板面，分数次滴加样品。,注意点：a.溶解试样的溶剂最好是挥发性的b.点样宜分几次点加,即点一次后, 用吹风机的冷风吹干, 再点, 再吹干, ., 反复,直到点完所要求的量c. 点样量的体积尽可能小些(2 10L左右)d. 点样最好是在密闭的室中或比较干燥的环境下完成, 避免薄板吸水降低活性.,3、展开薄层的展开需在密闭的器皿中进行，密闭容器应用展开溶剂预先饱和。展开方式和纸层析相同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平展开（与平面成1020o倾角）的上行或下行展层而不能垂直展层。,a.上行展开： 把点好样品的薄板浸入0.5cm深的适宜展开剂中，当展开剂移动至离起点约10 20cm处(约30min)，将薄板取出放平，用铅笔或小针记下溶剂前沿的位置后，在室温干燥或烘箱内干燥，测其Rf值。,注意：每次的展层距离要固定，以便Rf值的重复,五、薄层层析中定性检出和定量测定,1定性：展开完毕，取出记下展开剂前缘位置 A、显色： a. 紫外光照射 b. 蒸气熏：固体碘，浓氨水，溴 c. 喷显色剂：雾滴细而均匀防止损伤薄层表面 B、计算Rf值,与文献值对照 由于Rf值受诸多因素的影响，最好用标准物在 同一板上展开比较。,定性检出,a. 本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜色； b. 本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色的荧光 c. 薄板本身有荧光（硅胶HF254+366, 硅胶GF254, .), 欲测物吸收紫外线, 在荧光背景下呈暗色。 d.多数有机物, 喷10 50% H2SO4(或铬硫酸)并在100 120oC加热, 使有机物碳化, 观察加热中有机物颜色变化及碳化斑点位置, 可以推断物质的化学性质。e. 喷显色剂或荧光试剂（不含粘合剂的薄板不能喷，只能浸，以免把吸附剂吹散）,表 主要显色试剂,六目视比较半定量法,1试液与一系列不同浓度的标准溶液并排点样于同一薄层上展开后比较斑点的大小及颜色的深浅。例如检验药物中杂质是否超标2测量斑点面积：3从薄层上将组分洗脱下来测定4用薄层色谱扫描仪扫描定量,七、特点及应用,简单、方便、及操作费用低。可以在一块层析板上同时展开多个试样。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。试样一般不需经预处理即可分离。,缺点:,缺点：分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。应用：在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。,应用：,(1)氨基酸分离薄层:硅胶G板; 流动相: 正丁醇:醋酸:水=3:1:1Rf值:丙氨酸0.27, 氨基辛酸0.60, 精氨酸盐酸盐0.08, 磺基丙氨酸0.14, 胱氨酸盐酸盐0.16, 二羟基苯丙氨酸0.45, 甘氨酸0.22, 组氨酸盐酸盐0.06, 羟脯氨酸0.20, 亮氨酸0.47, 甲硫氨酸0.40, 颉氨酸0.36, 苯丙氨酸0.49, 脯氨酸0.19, 肌氨酸0.17, 苏氨酸0.25, 色氨酸0.56,(2)核苷,核苷酸, 寡核苷酸的分离薄层:硅胶F254 流动相: 正丁醇:HAc:H2O = 5:2:3Rf值:腺苷-5-磷酸0.35, 胞苷-5-磷酸0.24, 脱氧腺苷-5-磷酸三氯乙酯0.74, 脱氧胸苷酰(3,5)脱氧胸腺嘧啶核苷0.61, 5-甲基尿苷-5-磷酸酯(胸苷-5-磷酸)0.37, 5-0-磷酸基脱氧胸腺嘧啶核苷酰-(35)脱氧胸腺苷酰-(3,5)脱氧胸苷0.19, 5-0-三氯乙基-磷酸脱氧腺苷酰(3,5)脱氧腺苷0.68, 尿苷-5-磷酸0.30,(3)类固醇、固醇的分离薄层：Al2O3 流动相：C6H6:乙酸乙酯=4:1Rf值: 胆甾醇0.83, 别色胆甾醇0.77, -谷甾醇0.63, 豆甾醇0.62, -谷甾烷醇0.44(4)碱金属的分离薄层: 硅胶卷 流动相：含0.1mol/L I2 的硝基甲烷: C6H6 = 40:60Rf值:Cs+0.55, Rb+ 0.47, K+ 0.36, NH4+ 0.24, Na+ 0.18, Li+ 0.06,