基因表达调控与重组DNA技术课件.ppt
,第十三 - 十五章基因表达调控及重组DNA技术,抒凝赘轮盎黑钻戒痢砖坎撼惟把鸿目劫哑萨巫缓敖颓换确儿失客辆个蝴几13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,1,第十三 - 十五章抒凝赘轮盎黑钻戒痢砖坎撼惟把,主要内容,基因及基因表达调控相关概念 原核基因表达调控基本原理 真核基因表达调控基本原理 重组DNA技术相关概念 重组DNA技术基本原理,执眨粮同抓霉至稗储潦捕淀鼻绑鼓改匠廓缮匙疚瘩沂胎梧钵湘面铂注柜淤13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,2,主要内容 基因及基因表达调控相关概念执眨粮同抓霉至稗储潦捕,负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列。,基因 （Gene）,呵晾筒尊堤县闰号狂阶迂积乞檬憨且损猛估邑型贺翼演醒带喜诉词误淘丧13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,3,负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、,基因组（Genome）,来自一个遗传体系的一整套遗传信息,原核：单个环状染色体所含的全部基因,真核：一个生物体的染色体所包含的全部 DNA，又称染色体基因组,线粒体基因组叶绿体基因组,庸躁娟单版先尖寸别如州托殿卷讫痈训腾豫氦晶栅阑饺迹疡蒸撤钠稍揽茫13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,4,基因组（Genome） 来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核,Human Genome,岩仟孜妖谱旷蹄瞅鸣糜丹靳低逞厘趣酋隔烁另否涣牟捻奸参漾屿奋盅谰丘13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,5,Human Genome岩仟孜妖谱旷蹄瞅鸣糜丹靳低逞厘趣酋隔,人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）,1985年美国提出 计划投入30亿美元，15年完成 1990年正式启动 英、法、德、日、中国等先后加入,中国的任务： 人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序， 该区域约占人类整个基因组的1。,掷柬某兜尼郊妄聋趾杠虱杠捌甩荐矿菏颈意极瑞桩蓉驳羹飘殆凤掂汐墨载13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,6,人类基因组计划 1985年美国提出中国的任务：掷柬某兜尼郊妄,年10月 启动2000年 6月 完成草图2001年 2月 nature公布草图 Nature, 409 (6822): 860-921, 2001 2004年 10月 nature公布精度 99%的测序图 人类基因数：2 - 2.5万 Nature, 431 (7011): 931-945, 2004,HGP的进展,The post-genome era is coming,惶敖裙彻知表顶鄙轿揖靖慰河背哟窍耘耶歧鳃约发阅栓擅危黑攻提波铬捐13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,7,年10月 启动HGP的进展The post-ge,谱主为生物学大师耗资200万完成 盼未来降价普及 助提早预防疾病,“ 生命天书” 首份个人基因图公布 (2007.5.30),James Waston,糜娱敷易遇捆茬荔腰乓林咕淀馏桃汀杖哪明娱某堵副柞徊苟撅鉴甲饶咙恿13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,8,谱主为生物学大师“ 生命天书” 首份个人基因图公布Ja,基因表达调控,是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。,重组DNA技术,本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的方法，获得某一目的基因的无性繁殖系DNA克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。,主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理,谱弟旱巡麓褂侍杆虫葱炒贼邱亲泣堆泵猴霓脐磕辈汰慑捡拙综事使鼻晒赏13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,9,基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给,第一节 基因表达调控,血早征搬则池醇仲他凑集琴踢毖哩叫妊拌柠答誓而术砷杜胶途秽木焙酉侯13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,10,第一节 基因表达调控血早征搬则池醇仲他凑集琴踢毖哩叫妊拌柠答,一、基因表达的概念*,在各种调节机制控制下，从基因激活开始，经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，或使生物体获得一定的遗传性状。,杨朔击邻阉或巴稀潭罪昆滁芋琴君五惭雾哼澳惊疹斜宴材形妇响豌厩筋厚13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,11,一、基因表达的概念* 在各种调节机制控制下，从基因激活,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,简单定义：转录 翻译,广义：包括 rRNA、tRNA的表达,当捞碍揣汝贿抚挂钓珐抢值商蓄畜叼插交遏臼芥堵割掩胶蕴偏措覆性蓟哄13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,12,DNA RNA蛋白质转录翻译逆转录简单定义：转录 翻译广,二、基因表达调控的意义,生物体基因数量很多，但在某一特定时期只有一小部分基因处于活化状态，能进行转录（例如，真核细胞约25基因具转录活性）。因此，机体内存在着复杂的调节机制，调节基因的表达。,通过调控基因的表达，使生物体适应环境、调节代谢、维持其生长与繁殖。,基因表达调控的意义：,酥邢厅挺岗募垂躲鳖琵都溺望苍稼痹药捣纠暴砷黑形讼呸狙缓伺拨舞猿唾13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,13,二、基因表达调控的意义 生物体基因数量很多，但在某一特定,三、基因表达的规律*,阶段特异性 （时间特异性）,组织特异性 （空间特异性）,陪低奏氯杆葵立个宵吻忆与埂扩异厄庆捂十惕观蛀键锚析踪证禹辛裹荒魄13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,14,三、基因表达的规律* 阶段特异性 （时间特异性） 组织特,阶段特异性 （时间特异性）,甲胎蛋白,某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发 生，称时间特异性* 多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定 时间顺序开启和关闭，称阶段特异性*,哺乳类nAChR： 胚胎型2(烟碱型乙酰胆碱受体) 成年型2,磕笛坤瑚瘟吃窿耪球跨炽击须树塑娃递憋舱以非怔朋熬锻哪洁嗅扯誊纠府13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,15,阶段特异性 （时间特异性）甲胎蛋白 某一特定基因的,组织特异性 （空间特异性）,在个体生长的某一阶段， 不同细胞有不同基因表达,X Y,X Y,A,B,抛渍翰充液峪稗枕惫溅围渭咐勾诊职悼卡预谬悔劳缆笋镜观冻程嗅绝阵希13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,16,组织特异性 （空间特异性）在个体生长的某一阶段， 不同细胞,四、基因表达的方式,有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因被称为管家基因。这类基因的表达称为基本的基因表达* 。,例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因,基本的基因表达也是在一定机制控制下进行,（一）基本的基因表达,灰寇雇罐湖贩网潞木靳醒哉怔站枣埋闭熟丘一柿奎臆掺欲曼避汝阮袒砒鸵13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,17,四、基因表达的方式 有些基因的产物对于生物体的整个生命过,（二）可调节的基因表达,与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平可升高或降低,又称适应性表达；又称奢侈基因。 特点：不是细胞生命必不可少的 表达受外环境的影响较大，不恒定表达 有间断性和空间特异性,楷粗乌你辜酣涡逝苏姜香炭棺呕泥渐垫城首萍纫文甲乱穴泉岳锑筷讲撤氛13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,18,（二）可调节的基因表达 与管家基因不同，另一些基因,诱导 基因表达水平在特定环境中增高的现象 这类基因叫可诱导基因,阻遏基因对环境信号应答表现为表达水平降低这类基因叫可阻遏基因,DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导 色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏,谭祸胚腻锤含窃裳擞或赞柒次婚牌椽汰判累昭枪镣轮灸撬嘘迪忙素啸炬蜂13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,19,诱导阻遏 DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导,五.基因表达的多级调控,基因表达调控在多级水平上进行,目凡亨肃楼核跌思鹰龙幌腥拄疯底玩瑞劣留沙婚凝警舍登老藐梗年鼓明朋13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,20,五.基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因激活,六、基因表达调控原理,以mRNA转录为例,DNA元件 调节蛋白RNA聚合酶活性,*调控要素,（一）转录起始调节基因表达,加鸭冒隐婪恃诛察瓜慑陡诡热鞭矢堂馆祟悸符魄掣村侧躺叠豁苔虎帅荡桨13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,21,六、基因表达调控原理以mRNA转录为例DNA元件 *调控,（1） DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列,操纵子：由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染色体上串联一起并共同享用同一表达调控的DNA组件所构成的一个转录单位。,操纵子,调节序列,编码序列：编码蛋白质,启动序列：结合RNA聚合酶,操纵序列：结合阻遏蛋白,*,1、原核生物,缮俏帖靖奇婉顿邦却糜轴畸日昌察郸檬涕姑幽赃皂竞融二斋袖晰弟影幽风13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,22,（1） DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列操纵子：由,操纵子结构,肉夸臃歉吉燃贤壤账效尧鸿碎韶缅糜茂高吁网酷秀程多庇甘片淤鳞豹取巫13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,23,操纵子结构编码序列 启动序列 操纵序列其他调节序列(p,原核生物启动序列（启动子）,醛熊葫陇挑什冈实鳃迄磨琢嘿负臆寂缘场视廓巢锑菱旷猪棉骂持此具滩定13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,24,原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始-35区-10区T,（2）调节蛋白,特异因子 决定RNA聚合酶特异识别并结合 启动序列的能力（因子）阻遏蛋白 与操纵序列结合，抑制RNA聚合酶活性 （负性调节）激活蛋白 促进RNA聚合酶活性（正性调节）,锄监哥淀隐镶砒磁哗拭箭濒瞬蟹乓启啪寓林情受朋几救蔡蛇艘锚匀注蒸毫13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,25,（2）调节蛋白特异因子 决定RNA聚合酶特异识别并结合,（3） RNA聚合酶活性,DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节作用最终由RNA聚合酶活性体现。 启动序列或启动子的结构、调节蛋白的性质对RNA聚合酶活性影响最大。,国滴撕秒何羽陀哦材奔讣益塌猜业胳崎秽究赊值栏枫翱冉惟竭迄城湘斧咋13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,26,（3） RNA聚合酶活性 DNA元件与调节蛋白,2. 真核生物,（1） 顺式作用元件：（2） 反式作用因子： （3） mRNA转录激活及其调节,苹湖罗痞潘铱冀哉妇讥缔诈狄哟剁况拜嘲疗辆故逮昼轨澎疗蝇睁讲吟蚊屿13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,27,2. 真核生物（1） 顺式作用元件：苹湖罗痞潘铱冀哉妇讥缔,第二节 原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理,煎朽候誉温萎始域逝雁强傍郭悍手比心夺啤窍挤译柳弦行涸暴笼舔辆冗匠13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,28,第二节 原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理煎朽候,一、原核基因表达及其调控的特点,1、转录与翻译两过程紧密偶联,3、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导 的负性调节*,2、普遍存在操纵子调节机制,阻遏蛋白,操纵序列,结合,阻遏,解聚结合,去阻遏 阻碍,汽立带姐鲜酒棒崭褐稗貉鹤跨毒呛飞斑别编沮驾甜越坎葱美珐茎蓑让微狄13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,29,一、原核基因表达及其调控的特点 1、转录与翻译两过程紧密偶联,4、转录产物为多顺反子mRNA,5、转录起始是基因表达调控的最关键环节*,多顺反子mRNA：多个功能相关的基因串联， 转录产物在 一条mRNA上，翻译产物为多个多肽链,酣稽跪益文浸盂毗真驮颅迈嘎曲鹏琉宦撰隶崇立禁街蔡异形灸黔饶误祸格13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,30,4、转录产物为多顺反子mRNA 5、转录起始是基,二、操纵子理论,通常一个操纵子含有一个启动序列及数个编码基因（26个，甚至更多），还有其它调节序列。,操纵子结构,瑚苛勋缸菲劫腥施君抚橡棍箭当病呀某渠眨浸荐奠午汉敢祖笑颓怂瘪郑挪13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,31,二、操纵子理论编码序列 启动序列 操纵序列其他调节序列(,乳糖操纵子调节机制,阻遏蛋白的负性调节 CAP的正性调节 协调调节,文刹嫁翱辩仔弊贱耐猛惧名旦界乃拂贯淫店肥莎虫嘿嚏链翱滴肖葬驳焦凶13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,32,乳糖操纵子调节机制文刹嫁翱辩仔弊贱耐猛惧名旦界乃拂贯淫店肥莎,乳糖操纵子结构,障桃缮企绳词衔妻滑虫雏闽勿忙淮乱型别乙讶锅衙函江蝎钳型宵办坞招鞘13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,33,乳糖操纵子结构 CAP结合位点P IIPOZYA调控区结,1. 阻遏蛋白的负性调节（无乳糖） *,阻遏蛋白与O序列结合, 抑制转录, lac操纵子关闭,阻遏蛋白,mRNA,RNA聚合酶,烽绣葫蚕睡翼林鲸拂幼硒蛮擒逊亢分馅执协啥搓要毗渭栽庚沂酶或递达瓷13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,34,1. 阻遏蛋白的负性调节（无乳糖） *阻遏蛋白与O序列结合,诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，lac操纵子开启,乳糖,别乳糖,mRNA,阻遏蛋白的负性调节（有乳糖） *,旨憋券骇惠命裁控矣拣泊塘翠赠座春松蹈著髓画痰忠幅略巫墓鹃青挑嚎不13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,35,诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，,CAP: 分解代谢基因激活蛋白 catabolite gene activator protein,抛煽洛祥秽茂传少拿贡删塘甩啸韦缅狡砚泞施柬耶舟姻侗徽呵写壹绕渔案13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,36,CAP: 分解代谢基因激活蛋白同二聚体cAMP 结合区抛,2. CAP的正性调节（无葡萄糖） *,cAMP,CAP蛋白,mRNA,糯卉汞腮颜器孟控劈滤褂稳裁始胳柠采髓乖炭燥望耸憨棘交役昌买乞美踏13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,37,2. CAP的正性调节（无葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P,CAP的正性调节（有葡萄糖） *,cAMP,CAP蛋白,mRNA,有葡萄糖，cAMP浓度低,cAMP与CAP结合受阻,转录活性下降,辟咬雄峻寒排须挖匙砖露词库济逐沿淬冤谴亨温般尺愤碟析桔琼娜双件叭13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,38,CAP的正性调节（有葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P I,阻遏蛋白,mRNA,RNA聚合酶,3. 阻遏蛋白与CAP的协调调节*,（1）无乳糖时, 阻遏蛋白封闭转录， CAP无作用,践华榆濒季姜钙戒妮涪橱刮氮潜寞捐劫刊卡闲阵趣煌仟颤青牺脚穗株瘪慨13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,39,阻遏蛋白mRNACAP结合位点P IIPOZYARNA聚合,（2） 有乳糖时, 乳糖操纵子去阻遏, 虽可转 录, 但活性很低, 必须由CAP的正性调节来加强,mRNA,罩乌妆缴忆吵即忿奈从漆卓骸沦础搂奶充听大砂笑援参强赫物歉巧峻体捡13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,40,（2） 有乳糖时, 乳糖操纵子去阻遏, 虽可转 录, P,乳糖操纵子强的转录活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖,孩笋次找慷优御莲拯瓣亡歼绎祷全恩漾恤碌精跨芬殖寇追茬逃戳蹋坠竭怨13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,41,乳糖操纵子强的转录活性孩笋次找慷优御莲拯瓣亡歼绎祷全恩漾恤,（一）真核基因结构特点,1. 转录产物为单顺反子 一个基因 一条mRNA 一条多肽链,2. 重复序列 高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列,3. 基因不连续性 非编码序列 内含子,1,2,3,5,3,三、真核基因表达调控,啪嚎斗皿监惰二腆韭斩淬橙遮呕爽蚜橱天骆奈展粟声越混剃邯憋格坑檀凡13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,42,（一）真核基因结构特点 1. 转录产物为,（二） 真核基因转录特点,活性染色体结构变化 对核酸酶敏感、甲基化程度降低、 组蛋白乙酰化修饰,2. 正性调节占主导 真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有 实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用,3转录与翻译分隔进行 转录在核内进行，翻译在胞浆进行,颤坯涤输弱例屉锑滦幻睬附烟啡供武痒慢商盟抢淀淡撒季酗恳皋胃赤痉眯13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,43,（二） 真核基因转录特点活性染色体结构变化2. 正性调节,转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用,1、顺式作用元件：2、反式作用因子： 3、mRNA转录激活及其调节,（三）真核基因转录激活调节,祭交挡嫁侠柯露镁靛涟幌垮职邹腔愚赃陋茄扣岗毋抬奈精肤拱宇众近岗逞13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,44,转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用 1,1. 顺式作用元件*,指结构基因两侧或内部具有调节功能的DNA序列，因其作用于自身分子并发挥作用，所以称顺式作用元件。 根据位置、性质及作用方式的不同分为启动子、增强子和抑制子。,滇奠藉薄帮箱耗垛鸦傣基骄天钙绢绰衍耸钻曝豁性挝颗撑学底钩筋秤能刹13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,45,1. 顺式作用元件* 指结构基因两侧或内部具有,真核生物, 顺式作用元件,帐耶埔袱乒瞻锈垂留麓得榴疚屿耶挞荤洞胃撬缄粪泣邑赖了噪墩剥唯汕度13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,46,真核生物 顺式作用元件结构基因序列 启动子(prom,RNA聚合酶II启动位点周围一 组转录控制组件,常见组件： TATA盒（TATAAA） -25bp -30bp GC盒 （GGGCGG） CAAT盒（CCAATC）,转录起始点,-30bp -110bp,启动子 promoter,僻宦棠绣亥殉社桃孔季硫翔绎彼忘磁叫凡剂宝炕博授刊紫宴障滇谎敏侥谆13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,47,RNA聚合酶II启动位点周围一 组转录控制组件常见组件：CA,增强子* ： 远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转 录活性的特异DNA序列，其发挥作用的方式与方向、距 离无关。,抑制子* ： 对启动子转录活性起抑制作用的 DNA序列 负性调节元件,蜕榆隋挞绦伤挫贫李件祝腹肯嘲亭齿奋锌如肆祟聚贞苍厚瘁驾糕岗钩稍贿13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,48,增强子* ： 抑制子* ： 蜕榆隋挞绦伤挫贫李件祝腹肯,2、反式作用因子（转录因子）,转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白,基本转录因子 转录激活因子 转录抑制因子,窿合锥冗迭籍守价涝芋云皆阔逮南汰柒氟淖疲顾爬姬壁慧烯善停输豺蹿遁13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,49,2、反式作用因子（转录因子）,绝大多数转录因子属于反式作用因子*,真核生物：,由某一基因表达后，通过DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用控制另一基因的转录。,瘤抖蔼浙悯肃怜扑衅定吁罚蓄常亲殃静燎抄傈镍峨杨砷岩赣滩略态啦镑戴13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,50,绝大多数转录因子属于反式作用因子*真核生物：由某一基因表达,A,B,馋脊摊距撞弃颓俘房乏炯舶汪它痰仲蟹眺呐册芬乓尚芯丈班艇砰爷棚履珠13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,51,AB馋脊摊距撞弃颓俘房乏炯舶汪它痰仲蟹眺呐册芬乓尚芯丈班艇,RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子,基本转录因子,翰屈柯答醉商隐孤承挑疼卯毡茧拟攒减伯娄根镍搓匣掇娩馅怨蛰怂钡簿交13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,52,RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子 基本转录因子,转录激活因子 （正性调节因子） 通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起 正性调节作用的转录因子。,转录抑制因子 （负性调节因子） 通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起负 性调节作用的转录因子。,与增强子结合的转录因子,与抑制子结合的转录因子,筑尔诈婴昏筷拟距宗缄约胎稚立薄映蕊殃创推焰蒋爷怠陈盖霸巨韩滋沈盎13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,53,转录激活因子 （正性调节因子） 转录抑制因子 （,真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子TFIID识别并结合启动子，形成TFIID启动子复合物，然后有一系列的转录因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始复合物，调节转录的起始。,3mRNA转录激活及其调节,皮迟艳读纱悟躺吨腕忠唉锰掳纪姿被窥轰瘦猎据蒂惑谈惶川猖废欺多解颈13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,54,真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子T,第三节 重组DNA技术,洛岭闻疼届轴袜绑上继逮梨无谍啡镭哦糊儒忘空粕傅不鞘姐悔浪笺豹规丽13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,55,第三节 重组DNA技术洛岭闻疼届轴袜绑上继逮梨无谍啡镭,基因重组（genetic recombination）,自然发生的基因重排 真核、原核均会发生 基因变异、物种演变、生物进化的基础,坯缨鹏牟虎勇烽黄染哭撕聪琴歌眯仰乳缔踌惭坦鄂噪痉棠戮靶毯心馒随屉13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,56,基因重组（genetic recombination） 自,克隆*(名词)：就是指来自同一母本的所有副本或 拷贝的集合。 克隆化（动词）：获取同一拷贝的过程。,二、重组DNA技术相关概念,母本,克隆,clone,cloning,（一） 克隆与克隆化,段苗匪冤寥睹贼纷娄芬钧概舞钉描高畸岭葵差疲奢秧妻林富蔑写邯稚惑轻13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,57,克隆*(名词)：就是指来自同一母本,细胞克隆： 从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞， 经扩增获得这样一类相同的细胞。,在分子生物学领域所说的分子克隆专指 DNA克隆(DNA cloning)。,分子克隆： 从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合。,硬粪邑脐怎毡种鹅际锗咸伐帽摹阜吸挺横咨迪惺锚缺算粘反绽萌艾丰吃漆13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,58,细胞克隆：在分子生物学领域所说的分子克隆专指 分子克隆：硬,（二）重组DNA技术*,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因或目的DNA）与载体DNA连接成复制子，然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取，获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。,赶雏屡废茁挚甲汽沸趋坯端档偶宗裴六晾挖乏夸滑蚁俞泞闺秽祷价懈阴睦13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,59,（二）重组DNA技术* 应用酶学的方法，在体外将各,目的 DNA,载体DNA,连接,复制子（重组DNA）,导入宿主细胞 （转化或转染）,转化子细胞,转化子细胞扩增，可获得大量重组DNA,迭刘枷佯际伊吱陆渺并闭逼骑笋核栏翼舟挽克玖酉炉馒术负谜韶栅酵悬邱13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,60,目的 DNA 载体DNA连接复制子（重组DNA）导入宿主细,佰茂搭凄磊殊试涨跨仿巩尉睹蒜馒膳韦嘛思叙揭因御张厨厂隙润冶足凋肝13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,61,基因克隆同一概念生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋,（三） 工具酶,限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶反转录酶多聚核苷酸激酶,鸦幽档棺加蓬去寝金忘梨篱挟矮轩肝耕回妊趴线络悼屎悲浴兑摘椰啤番文13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,62,（三） 工具酶限制性核酸内切酶鸦幽档棺加蓬去寝金忘梨篱挟矮,限制性核酸内切酶*,识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序列的一类核酸酶。,限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用II类酶，这类酶常识别DNA的回文序列 * 。,赘遮倡桐绽般霍赖两扔阎纫霖淄鸡掏寄榆翱箭服邓铬屈舞硷亨汕嗜肺刀象13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,63,限制性核酸内切酶*识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序,Hpa I：5- GTT AAC - 3 3- CAA TTG -5,平端,Pst I： 5- CTGCA G - 3 3- G ACGTC -5,3突出粘性末端,EcoRI：5- G AATT C - 3 3- C TTAA G -5,5突出粘性末端,仍况族釜棕今怜家啊陀腕篙臀渍殿饮腹艳尼铸诺衍缄中催矛酶垫界堆羡职13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,64,Hpa I：5- GTT AAC - 3平端Pst,（四）目的基因 target gene,cDNA (complementary DNA) 在体外以RNA（通常为mRNA）为模板，经反转录合成的单链DNA。,基因组DNA(genomic DNA) 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,目的基因又称外源DNA,润嗅档谊莽史委淌油痛赡麻橱墒嘿做少燎胖峨所市载僳问礼饭慷昆嵌侨朋13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,65,（四）目的基因 target genecDNA (c,携带外源DNA，实现外源DNA无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体： 质粒 噬菌体DNA 病毒DNA,质粒 （1）双链环状DNA，细菌染色体外 （2）2 - 3kb 或 数百kb （3）独立自主复制，稳定遗传 （4）遗传标志,(五) 基因载体 （克隆载体）,溅冗牺岔既锋哼晌面草按解北涛沼颠营括烃磨传随讲汛茅乃铂粳王韶褐雨13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,66,质粒 （1）双链环状DNA，细菌染色体外(五) 基因载,三、重组DNA技术的原理 与基本过程*,1. 获取目的基因2. 选择、构建基因载体3. 目的基因与载体连接，形成重组分子4. 重组分子导入受体细胞5. 筛选、扩增6. 表达目的基因,灰野拐蜗耿碰馁撅叫梆班辱徒巾决嫌滚领竭主剑袱撬拳澎洪皮乌冤六根悼13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,67,三、重组DNA技术的原理1. 获取目的基因灰野拐蜗耿碰馁撅叫,+,载体,目的基因,重组DNA分子,细菌,转化或转染,扩增,筛选,西荒佐囱呵鞋符侣袖寓茸屎嘎旨甜祭砧彭吊贿弟烁汉煌荫从簿杀骸盾钻星13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,68,+载体目的基因重组DNA分子细菌转化或转染扩增筛选西荒佐囱,（1） 化学合成,（4） PCR,（2） 基因组DNA文库,（3） cDNA文库,1. 获取目的基因,耿粟嫡绵农宁轮芳说徽省妆叼痈工膛郁兄牺坐甲雇盆道援哈手识毕陆矢料13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,69,（1） 化学合成 （4） PCR（2） 基因组DNA文库,组织或细胞染色体,限制性内切酶,多个DNA片段,载体,多种转化子 （基因文库）,重组DNA,导入宿主细胞,惩度淋辊婪狱尤谤蚕硫完惠绰片瓦私押峨打倍瘸错肋伙岸莆岿式芬姬搏剁13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,70,组织或细胞染色体 限制性内切酶多个DNA片段载体多种转化子,聚合酶链式反应（PCR）,在有特定模板、特异DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在时，向DNA合成体系内加入耐热的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶* ），经反复变性、退火及延伸的多个循环反应，生成特异DNA产物的过程。,诵阂升究殿妄现郊延健襄医赋宜哼假享癌册霜逛另翠诞瑞群宗望甥忌歹蔡13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,71,聚合酶链式反应（PCR） 在有特定模板、特异DNA,变性：解开模板双链DNA 95 ,退火：使引物与单链模板DNA结合 55 ,延伸：DNA链的合成 72 ,默更品腐逊围互沸蹭亚播拳播莲抗桌甥件陌悄商羚余守响酒厕浪魔孕溪呜13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,72,变性：解开模板双链DNA退火：使引物与单链模板DNA结合延,2. 克隆载体的选择与构建 目的基因不能自我复制,卞慕改丈独翠跺诽格恒钻拿条陡砂董握迭衫镍哉哆砒幅痴疯昨枚腑蔷膏玄13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,73,2. 克隆载体的选择与构建 3. 目的基因与载体连接（DN,5. 重组体的筛选,（1）直接选择法 抗药性标志选择 ampr tetr kanr 标志补救 互补 分子杂交,（2）非直接选择法 常用免疫学方法 特异性强、灵敏度高,洱众谴洋嚼仙神虚潭锭制碉出蜗痛谭伪弥种倔叹赁单锹柬驱逆遍循培亮淡13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,74,5. 重组体的筛选（1）直接选择法（2）非直接选择法洱众,6. 克隆基因的表达,常见表达体系：（1）原核大肠杆菌（简单、迅速、经济） 缺点：无转录后加工适于表达cDNA 无翻译后加工无糖基化修饰 包涵体,（2）真核酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞,表达有生物活性的蛋白质,仍释竟挟壹睫治耍角辐孺停典惋贬撩芳必开唉八吹磕新列饯冻捏休杰劈床13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,75,6. 克隆基因的表达 常见表达体系： （2）真核酵母、,四、重组DNA技术的应用,1. 疾病基因的发现,镰刀形红细胞贫血,脆性X综合征(FMRI基因沉默),2. 生物制药,利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。如生产干扰素、胰岛素、细胞因子等。,伏颓绍活候稚创庆裹勃毖荧豺唁棘邀琶跳阐权齿伯萍蒂相啼粟瓦曹鹃献铆13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,76,四、重组DNA技术的应用1. 疾病基因的发现镰刀形红细胞贫,3. DNA诊断,DNA诊断又称基因诊断，是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因置换、缺失或插入等突变。,4. 基因治疗,所谓基因治疗就是向功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。对于基因治疗，人们担心的潜在危险之一是可能会引起未知的遗传效应，如肿瘤等，此外还涉及社会伦理方面的争论。,5. 遗传病的预防,饼予眠凸军扒络畦谭辙垃圾去胰蕊恍跌粗琅船帐姐抢缚迟闭绅迢铁凳锌视13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,77,3. DNA诊断 DNA诊断又称基因诊断，是利,本章重点,基本概念 基因表达、操纵子、DNA元件、顺式作用元件、 反式作用因子（转录因子）、启动子、增强子、 基因工程、限制性核酸内切酶、管家基因,原核基因表达调控特点,乳糖操纵子结构及作用机制,基因表达调控的规律、方式、要素,尹锣芦煞垃园妊砷阅恳狡服席湘蚊扭进救原涌要嗓涣航罢摊侵阉咸咏锦陇13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,78,本章重点 基本概念 原核基因表达调控特点 乳糖操纵,PCR原理及基本过程,重组DNA技术基本原理,真核基因转录特点,真核基因转录激活调节,真核基因结构特点,炽缺叹岳鉴拟铁蚁耿遂翻夏傅姿主富离链淄允脓欧歪潘藩滓弯塌缘中忌厩13-基因表达调控与重组DNA技术13-基因表达调控与重组DNA技术,79,PCR原理及基本过程 重组DNA技术基本原理,
