973 XXXXCB113900-G主要蔬菜重要品质性状形成的遗传机理与分子改良.docx

项目名称：主要蔬菜重要品质性状形成的遗传机理与分子改良首席科学家：黄三文 中国农业科学院蔬菜花卉研究所起止年限：2012.1-2016.8依托部门：农业部一、关键科学问题及研究内容（一）拟解决的关键科学问题围绕我国蔬菜产业发展中对优质品种的迫切需求，从已有的蔬菜基因组学研究的基础出发，针对决定蔬菜商品品质的产品器官发生发育和决定风味品质的风味物质合成积累的遗传机理开展深入研究。科学问题1：蔬菜商品和风味品质性状形成的遗传构成蔬菜产品器官的形成和风味物质的合成与积累是由多基因控制的性状。哪些关键基因控制了叶球的形态建成，果实形态的丰富变异的遗传基础是什么，风味物质代谢的关键酶基因是什么，解决控制这些品质性状形成遗传构成的问题是进一步研究其调控机制的基础。科学问题2：蔬菜商品和风味品质性状形成的基因调控机制产品器官形成和风味物质代谢的生物学过程受到基因网络及环境因素的调控。关键品质功能基因是如何表达调控的，它们之间又是如何相互作用的，温度与光周期等环境因素是如何影响它们的表达，解决这些品质性状形成调控机制的问题是培育优质品种和生产优质蔬菜产品的理论基础与技术支撑。通过对上述两个关键科学问题的深入研究，探索在全基因组序列基础上阐明优质关键基因的结构、功能和互作效应及调控机制，在此基础上建立现有主要蔬菜品质改良全基因组分子设计的理论和方法体系，将提升我国蔬菜品质育种的水平，为推动蔬菜产业转型升级提供科学依据。（二）主要研究内容为了保证在有限方向进行重点突破，本项目针对生产中存在的白菜和甘蓝未熟抽薹、结球不紧实和裂球问题、黄瓜和番茄的畸形果和裂果问题，以及黄瓜清香味缺乏和苦味发生的问题，集中力量研究白菜和甘蓝叶球形成、黄瓜和番茄果实形成，以及黄瓜风味形成的遗传构成和基因调控机制，并在此基础上建立这些蔬菜品质改良的全基因组分子设计体系。主要包括以下三大内容：（1） 蔬菜商品和风味品质性状形成的遗传构成在白菜、甘蓝、黄瓜、番茄的全基因组序列基础上，利用核心种质资源和现有主要亲本的重测序数据，构建这些蔬菜的全基因组遗传变异图谱；继而利用全基因组关联分析（GWAS）确定白菜和甘蓝叶球的形态建成、黄瓜和番茄果实的形态建成，以及黄瓜苦味和清香味物质代谢的关键遗传位点。在确定关键遗传位点的基础上，构建重组自交系、近等基因系等分离群体，利用图位克隆和候选基因等方法分离控制叶球、果实形成和风味物质代谢的关键基因，并利用突变体和转基因方法鉴定这些关键基因的功能。（2） 蔬菜商品和风味品质性状形成的基因表达与调控机制在关键基因分离和鉴定的基础上，通过功能基因组学、分子生物学、生理生化的技术手段，重点研究蔬菜叶球、果实和风味形成过程中基因的表达调控模式、基因之间的相互作用，以及环境因素对其表达的影响，探讨品质性状形成的基因调控途径。（3） 主要蔬菜品质改良的全基因组分子设计在全基因组遗传变异图谱的基础上，开发背景选择的SNP芯片用于在回交育种和系谱选择时保留现有主要亲本的已有优异遗传背景；在蔬菜品质性状形成的遗传构成与调控机制研究的基础上，开发前景选择分子标记用于快速导入新基因来定向改良现有主要亲本；并将前景背景选择的分子改良技术体系与国内白菜、甘蓝、番茄和黄瓜育种优势单位的育种实践相结合，选育优质新品种。二、预期目标（一）总体目标通过本项目的实施，阐明蔬菜作物产品器官形成和风味物质代谢的遗传构成和调控机制，开发形成以高通量背景选择和前景选择相结合的品质改良全基因组分子设计技术平台，大规模改良现有主要亲本，创制优质新种质，培育有自主知识产权的优质新品种，从而实现提升我国蔬菜育种的自主创新能力和核心竞争力，保障我国蔬菜产业转型升级提供科学支撑的总体目标。（二）五年预期目标（1）揭示白菜、甘蓝、黄瓜及番茄遗传变异的主要形式，建立这些主要蔬菜作物的全基因组遗传变异图谱，每种蔬菜至少鉴定100万个SNP位点和10万个SV位点，为解析多基因控制性状的遗传构成提供基础工具，也为分子改良所需的背景选择SNP芯片的设计提供技术依据。（2）阐明白菜和甘蓝叶球形成的遗传构成和基因调控机制，揭示小RNA在叶球发育中的重要地位，分离和鉴定34个控制叶球形成的关键基因，探明这些关键基因如何与诱发环境因素互作来控制未熟抽薹、裂球和结球不紧实。（3）阐明黄瓜和番茄果实形成的遗传构成和调控机制，分离和鉴定34个控制果实形成的关键基因，探明这些关键基因如何与诱发环境因素互作来控制裂果、畸形发育。（4）阐明黄瓜黄瓜风味形成的遗传构成和代谢调控机制，分离和鉴定34个控制黄瓜葫芦素（苦味物质）和壬二烯醛（清香味物质）等风味物质代谢的关键基因。（5）建立主要蔬菜品质改良全基因组分子设计的理论和技术体系，包括根据全基因组遗传变异图谱开发的背景选择SNP芯片和根据上述商品和风味品质性状遗传机理研究结果开发的前景选择分子标记；系统改良现有主要亲本，培育有自主知识产权的优质新品种。创制40份优质新种质，培育出5 8个优质新品种或组合。（6）凝聚和培养一支蔬菜基因组学、分子遗传及育种的创新团队，培养一批有国际影响的中青年学科带头人和学术骨干，培养60 80名研究生和10 15名博士后。丰富和发展我国蔬菜品质育种的科学理论与实践，提升我国蔬菜育种界的源头创新和集成创新能力。（7）发表核心刊物论文150篇以上，SCI论文80篇以上，其中影响因子高于5的论文10篇以上；申请专利20 30项。三、研究方案（一）总体学术思路和技术途径本项目针对生产中存在的蔬菜商品品质和风味品质的突出问题，选取全基因组序列已经测定、常规育种基础好的大宗蔬菜白菜、甘蓝、黄瓜和番茄为研究对象，从与商品和风味品质密切相关的产品器官形成和风味物质代谢调控的生物学过程入手，深入蔬菜重要品质性状形成的遗传构成和基因调控机制，建立品质改良的全基因组分子设计的理论和方法体系，创制优质新材料，培育优质新品种，力图实现“从基因组到品种”的整体构想。针对品质性状形成遗传构成的关键科学问题（科学问题1），在基因组框架图的基础上，利用核心资源和现有主要亲本重测序数据，构建全基因组遗传变异图谱；结合对重要品质性状的详细调查和分析，确定控制叶球形成、果实形成和风味形成的关键遗传位点；结合图位克隆、候选基因分析、突变体分析和转基因验证等技术手段，分离和鉴定品质性状形成的关键基因，回答哪些基因控制了品质性状形成的科学问题。针对品质性状形成基因调控机制的关键科学问题（科学问题2），选择已经详细鉴定过表型的自然和人工突变体以及转基因材料，对叶球和果实的不同发育阶段以及不同环境条件下的转录组（包括小RNA）进行分析，从全基因组水平确定与关键基因共表达或者反向表达的基因集，构建关键基因的表达网络；不少已经发现的形态建成基因是转录因子，项目将确定参与叶球和果实形成转录因子的下游受控基因；通过酵母双杂交等技术手段确定与关键基因有蛋白互作的基因；通过突变体的遗传分析，确定关键基因的上下游基因，确定其信号传导途径；分析风味形成基因参与的代谢网络；综合上述分析手段，探明叶球和果实形成和风味物质代谢的基因调控机制。利用上述研究中关键基因的序列开发前景选择分子标记，为现有主要亲本的定向品质改良提供选择工具；利用全基因组遗传变异图谱开发背景选择SNP芯片，用于在育种中保持现有主要亲本的良好遗传背景；并且将这套全基因组分子设计的技术体系应用在优质新品种培育的实践上，实现“从基因组到品种”的战略构想。上述研究将为蔬菜品种改良的国家支撑计划和“863”等科技计划的顺利实施提供依据与支撑，为蔬菜学学科体系的发展提供新理论、新技术与新方法。总体学术思路和技术途径如下图（图1）所示：图1. 总体学术思路与主要技术途径（二）创新点与特色（1）以国家重大需求为导向：本项目以大面积种植的白菜、甘蓝、番茄和黄瓜为主要研究对象，针对生产中亟待解决的未熟抽薹、裂球裂果、风味不佳等商品和风味品质问题，紧密围绕产品器官形成和风味物质代谢的遗传构成和基因调控机制的关键科学问题，进行深入的研究。这些均属推动优质蔬菜品种国产化、实现产业转型升级中亟待解决的重大科学问题，体现了国家的重大需求。（2）以多基因控制品质性状的遗传构成为科学突破口：蔬菜的商品和风味品质性状是由多基因控制的，其遗传构成的问题是蔬菜学科多年来没有得到有效解决的难题。人类复杂疾病的研究表明，基因组序列是解析复杂性状遗传的必须工具。在本项目研究的四种蔬菜中，黄瓜、白菜和甘蓝的基因组框架图都是由项目申请单位主导完成的，并且也基本完成了核心资源的重测序工作，这使得本项目团队在研究蔬菜品质性状遗传构成上取得了先机，有可能实现重大突破。（3）以叶球形态建成的基因调控机制为理论突破口：以往对植物的研究大多以拟南芥和水稻等模式植物为实验材料，蔬菜作物产品器官的形态和生理特性与模式植物有很大区别，其遗传基础和基因表达调控的机制有其自身的特点。前期研究发现一批新的与白菜叶球形态建成有关的miRNA和功能基因，本项目将在基因组框架图的基础上，对miRNA的靶标位点和已知功能基因的表达调控网络进行新颖细致的分析，提出叶球发育遗传调控的新理论。（4）以假说和数据联合驱动为科学方法论：生物学研究主要依赖假说驱动的科学方法论，即根据已有的知识建立工作假说、设计实验加以验证。测序技术的飞速发展导致海量基因组（包括基因组、转录组、甲基化等）数据的产生，数据驱动的科学方法论（通过生物信息学寻找基因组数据自身的规律）将发挥更大的辅助作用。两种方法论的互补将导致大量的科学发现，这一点在现代物理学研究中已经得到验证。在本项目中将采用假说和数据联合驱动的科学方法论，研究内容1主要通过基因组数据和表型数据进行关联分析，属于数据驱动；研究内容2主要通过对叶球和果实形成以及风味物质代谢的已有知识进行总结和归纳，提供新的工作假说，进行验证，属于假说驱动。两种方法论穿插交织在整个研究过程中，将会得到新的科学发现。（5）以“从基因组到品种”为产业突破口：DNA测序成本的快速降低为农业基因组学的研究和应用带来历史性的机遇，如何利用基因组学的方法手段加快育种进程是目前农业科研界面临的共同难题。本项目在主要蔬菜全基因组测序已经完成的基础上，将前沿的基因组学及生物信息学与蔬菜育种实践紧密联系起来，利用白菜、黄瓜和番茄等蔬菜生命世代短（34个月）和国内遗传育种基础较好的优势，开发品质改良的全基因组分子设计技术体系，培育优质新品种, 为产业转型升级提供科学和技术支撑。（三）取得重大突破的可行性分析（1）研究目标明确，立论依据充分围绕国家重大需求和学科前沿，瞄准蔬菜品质育种必须解决的两大基础科学问题，开展本项研究。借鉴了国内外大田作物和模式生物研究多基因控制性状的最新成果和进展，具有可靠的立论依据。（2）研究材料完备，方法成熟先进项目申请单位是国家蔬菜种质资源中期库的依托单位，拥有近一万份白菜、甘蓝、黄瓜和番茄种质资源，前期已经对资源进行初步的品质性状调查，从中发掘和培育出一批具备优异品质性状的种质资源，并已构建了各种分离群体（包括近等基因系、重组自交系群体等），黄瓜和番茄的突变体群体也基本完成，为后续遗传分析和基因鉴定带来了很大的便利。项目综合采用基因组学、生物信息学、群体遗传学、分子生物学等学科的最新技术，方法成熟、先进。 （3）研究基础坚实，队伍精干合理项目团队先后组织完成了黄瓜、白菜和甘蓝基因组测序，并参与了番茄基因组测序，基本确立了我国在蔬菜基因组学领域的暂时领先地位。基因组学的优势为我国在蔬菜分子遗传学的发展打下了很好的基础，先后构建了多张蔬菜分子标记连锁遗传图谱，其中黄瓜图谱是葫芦科首张遗传细胞遗传整合图谱，包含近1000个SSR标记。项目团队已经分离鉴定或精细定位了多个蔬菜产品器官形成和风味代谢的关键基因。实现了不同学科的交叉和融合，集中了中国农业科学院、中国科学院、上海交大、中国农大、南京农大等相关重点科研院校在本领域的优秀人才，组成了精干、高效、务实的研究团队，为本项目的顺利完成提供了人才保障。团队配置体现了“从基因组到品种”整体构想的需要，既有从事基因组学和分子生物学的中青年科技骨干，也有具备多年田间实践经验的育种专家。（4）支撑体系强大，国际合作密切依托国家蔬菜改良中心和4个密切相关的国家重点实验室及多个部门重点开放实验室，拥有较好的研究条件和设备，为本项研究提供了坚实的物质基础。“十一五”期间，项目主持单位主办了多次葫芦科和十字花科基因组国际研讨会，在蔬菜基因组学领域具有广泛的国际影响。例如，2008年11月举办的“国际葫芦科基因组学和生物学会议”吸引了美国康奈尔大学、威斯康星大学、西班牙农科院、日本蔬菜茶叶研究所、澳大利亚多态性芯片技术中心等多家知名大学和科研机构参加。这些学术活动一方面能及时获取国外最新学术思路、技术和资源，另一方面为国际合作奠定基础，获得一批有重要理论和应用价值的成果。2013年项目申请单位（中国农业科学院和中国科学院遗传与发育生物学研究所）将举办“国际茄科基因组大会”，估计将有200多名国际同行和300多名国内同行参加。这种密切的国际合作为本项目的研究提供了国际视野，也提升了我国科学研究在国际的影响力。（四）课题设置基于项目拟达到的总体目标，以“蔬菜商品和风味品质性状形成的遗传构成和基因调控机制”的关键科学问题为切入点，共设置6个研究课题。课题1 蔬菜品质性状全基因组关联分析蔬菜品质性状是多基因控制性状，而全基因组关联分析（GWAS）是研究多基因性状的有力手段。全基因组遗传变异图谱，是GWAS的必需“蓝图”。本课题重点开展以下研究：1 主要研究内容种质资源品质性状的观察分析：对白菜、甘蓝、黄瓜和番茄种质资源的品质性状，包括白菜和甘蓝的结球习性和紧实度、未熟抽薹和裂球率，黄瓜瓜把长度、畸形果率，番茄果实形状、大小、畸形果率、裂果率，黄瓜果实苦味和清香味等风味物质的化学成份等，进行观察测定。全基因组遗传变异图谱构建：在白菜、甘蓝、黄瓜、番茄的全基因组序列基础上，利用不同种质资源的重测序数据，定位所有SNP位点和结构变异位点（Structural variation, SV），确定全基因组范围内的连锁不平衡区块。全基因组关联分析： 在性状调查和全基因组变异图谱的基础上，通过关联分析，确定白菜、甘蓝叶球的形态建成、黄瓜和番茄果实的形态建成，以及黄瓜苦味和清香味物质代谢的关键遗传位点。2. 研究目标创建白菜、甘蓝、黄瓜和番茄的全基因组遗传变异图谱，包含至少100万个SNP标记和5万个SV标记，确定控制叶球、果实形成、风味物质代谢的关键遗传位点，为关键基因的分离和鉴定提供候选基因。 课题承担单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京师范大学 浙江大学课题负责人：黄三文研究员学术骨干：林魁，曹家树，张忠华， 程峰经费比例：18.6%课题2 蔬菜品质性状形成关键基因的分离与鉴定关键基因的克隆是研究其互作、调控机制的前提。在确定关键遗传位点的基础上，针对性状表现选择用于精细遗传作图的重组自交系、近等基因系等分离群体，通过图位克隆和候选基因等方法分离控制白菜和甘蓝叶球、黄瓜和番茄果实形成，以及黄瓜风味物质代谢的关键基因，并利用突变体和转基因方法鉴定这些关键基因的功能。1 主要研究内容白菜和甘蓝叶球形成的关键基因分离和鉴定：利用白菜类蔬菜和甘蓝类蔬菜亚种间丰富的形态变异，在大白菜和甘蓝基因组框架图的基础上，对其它亚种进行重测序，结合图位克隆和转基因鉴定，克隆甘蓝和白菜叶球形态建成的关键基因；利用拟南芥已知的开花控制基因作为候选基因的目标，克隆甘蓝和白菜控制抽薹开花的关键基因。黄瓜果实形态性状关键基因的分离与鉴定：利用多种遗传群体材料，构建饱和度高的遗传连锁图，对黄瓜果实外观品质形成有关的农艺性状，包括黄瓜瓜把长短、畸形果率、果皮光泽和薄厚、种子腔直径、果肉厚度等，进行精细定位，结合课题1的基因组关联分析以及突变体分析和转基因验证，克隆包括主要瓜把长度主效QTL（Gb6.1)在内的关键基因。番茄果实形成的关键基因分离和鉴定：通过图位克隆技术分离控制番茄果实大小的RG基因、控制果实形状的PST基因，以及从课题1 得到的主效QTL。利用转基因互补实验、过量表达和RNAi基因表达抑制等技术手段来鉴定这些基因在果实生长中的功能，重点分析其在引起畸形果、裂果等不正常果中的作用。黄瓜风味形成关键基因的分离与鉴定：通过图位克隆技术分离黄瓜苦味形成的关键基因Bi和Bt；在课题1关联分析的结果，通过图位克隆和候选基因相结合的方法，鉴定黄瓜清香味形成中壬二烯醛代谢的关键酶基因。2. 研究目标通过图位克隆、候选基因法、突变体分析和转基因验证，分离和鉴定56个控制叶球和果实形态的关键基因以及34个控制黄瓜风味品质的关键基因，为后续基因调控网络研究打下基础。课题承担单位：上海交通大学 西南大学 中国科学院遗传与发育生物学研究所 中国农业大学 扬州大学课题负责人：蔡润教授学术骨干：王小佳，杨文才，陈学好，王保经费比例：16.0%课题3 大白菜和甘蓝叶球形成的基因表达调控机制大白菜和甘蓝叶球的形态建成取决于一系列基因的时空表达和调控作用。针对生产中出现的未熟抽薹、结球不紧实、裂球等问题，本课题将研究叶球形态建成相关基因的生物学功能，探讨这些关键基因如何调节叶卷曲和叶球形成的遗传机制，以及诱发环境因素如何调控这些关键基因的表达。重点开展以下研究： 1 主要研究内容白菜和甘蓝叶球形成的转录组分析：选择已经详细鉴定过表型的白菜和甘蓝自然和人工突变体以及转基因材料，对叶球的不同发育阶段以及不同环境条件下的转录组（包括小RNA）进行分析，从全基因组水平确定与关键基因共表达或者反向表达的基因集，构建关键基因的表达网络，研究其时空表达模式以及基因间的相互作用，阐明温度和光周期等环境条件调控叶球商品性状的分子机制。白菜叶球形成相关基因对结球性状的调控作用：根据突变体和转基因植株的形态表现，研究目的基因对叶球发生时间、成熟速度、紧实度、形状、大小和整齐度等商品品质的调节作用。比较叶球形成相关基因在不结球、结球不紧实和易裂球基因型与正常植株上表达水平上的差异，分析不结球、结球不紧实和易裂球的原因。白菜叶球形态发生和发育过程中miRNA介导的基因调控：在基因调控的不同层次上，研究miRNA基因表达的激活或失活、miRNA合成途径改变、miRNA靶基因的突变等对白菜叶球形态的影响，阐明基因沉默对白菜叶卷曲的调控作用。白菜和甘蓝未熟抽薹的基因调控机制：比较易抽薹与耐抽薹自交系叶球形成相关基因在表达水平上的差异，分析未熟抽薹和不结球的原因。构建白菜控制抽薹关键基因的近等基因系，通过关键基因的不同组合，研究关键基因之间互做在抽薹调控中的作用。2. 预期研究目标阐明大白菜和甘蓝叶球大小和形状等商品品质形成的遗传机理，揭示小RNA在叶球形态建成中的作用机制，探明造成不结球、裂球和未熟抽薹的分子机制，为遗传上改良叶球形成及其商品品质提供科学依据。课题承担单位：中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 南京农业大学课题负责人：何玉科研究员学术骨干：侯喜林，倪迪安，孙传宝，李英经费比例：17.3%课题4黄瓜、番茄果实形成的的分子遗传与调控机制果实形成是由复杂的分子遗传调控网络决定的，且受各类植物激素精细调控及环境的影响，深刻解析果实形成的分子遗传基础和调控机制是实现分子设计育种的关键。针对生产中出现的果实畸形发育（包括黄瓜瓜把过长）和裂果等问题，本课题以黄瓜和番茄为研究对象，系统研究单性结实、果实大小与形状和外观品质等果实形成的重要性状的分子遗传与调控机制，重点开展如下研究：1 主要研究内容黄瓜和番茄果实形成的转录组分析：选择已经详细鉴定过表型的黄瓜和番茄自然和人工突变体以及转基因材料，对果实的不同发育阶段以及不同环境条件下的转录组（包括小RNA）进行分析，从全基因组水平确定与关键基因共表达或者反向表达的基因集，构建关键基因的表达网络。黄瓜果实形成中单性结实果实发育的分子遗传基础：生产中黄瓜雌性系的应用越来越广泛，要求品种有很好的单性结实能力才能避免畸形果的发生。以重组自交系、杂交F2:3为材料构建黄瓜单性结实的遗传图谱并进行QTL精细定位。通过转录组和代谢组学间的关联分析发掘控制单性结实黄瓜果实发育的关键基因；分析这些基因的时空表达情况和体外生化特征，确定控制黄瓜单性结实果实发育的关键基因。完成相关基因的克隆和功能研究，阐明黄瓜单性结实的分子遗传与调控机制。黄瓜果实重要商品性状的分子遗传与调控机制：利用重组自交系、杂交F2、回交BC1、近等基因系等群体材料鉴定控制黄瓜果瘤大小和果实形状的主效QTL位点或关键基因，克隆相关候选基因，分析这些基因的时空表达特性。并结合双突变体的构建、酵母双杂交等手段，解析果形调控关键基因之间在遗传、体外生化功能方面的互作关系。分析这些基因的时空表达特征；阐明这些重要功能基因的作用模式及调控机制。利用新泰密刺黄瓜（长瓜把）与印度野生黄瓜（无瓜把）的重组自交系群体，以及华北类型黄瓜II25A0337（长瓜把）和美国类型黄瓜CGN20898（短瓜把）的杂交群体，精细定位和克隆调控瓜把长度的主效和微效基因。在不同环境条件下（如低温，弱光），对所获得的瓜把长度主效基因的时空表达特性进行分析。并通过突变库（TILLING）的筛选，研究分析环境因素对瓜把长度主效基因突变体的表现型、RNA和蛋白水平的影响，探索瓜把长度主效基因与环境因素之间的的分子影响机制。番茄畸形果和裂果形成的基因调控机制：通过数量遗传学、分子遗传学的方法手段来鉴定和分离控制番茄果实大小和形状的新功能基因或QTL位点RG和PST，重点分析引起畸形果、裂果等不正常果形成的突变位点，解析其分子遗传基础及基因的时空表达特征；借助转基因方法对所获得的调控基因进行植物体内功能确证，阐明RG和PST控制果实大小和形状的细胞学基础；通过细胞生物学、生物化学和组学等技术手段来解析重要果实生长发育调控基因RG和PST的调控网络。2 研究目标阐明黄瓜单性结实性状、果瘤大小、果实形状和番茄果实大小、形状的分子遗传和调控机制，获得调控黄瓜单性结实形成、果瘤大小、果实形状和番茄果实大小、形状的重要功能基因，并明确它们的生物学功能；获得调控番茄果实生长发育的重要转录因子，构建番茄果实生长发育的基因调控网络，探明相关转录因子调控番茄果实形成的机理；揭示小RNA在果实形态建成中的作用机制。课题承担单位：南京农业大学 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 中国农业大学 上海交通大学课题负责人：陈劲枫教授学术骨干：肖晗，张小兰，娄群峰，潘俊松经费比例：16.0%课题5黄瓜风味性状形成的分子遗传与代谢调控机制蔬菜风味品质是复杂次生代谢物的综合体现，代谢网络中涉及众多的控制以及转录因子的调节，而且种类繁多的次生代谢物与植物抗病性也关系密切。针对生产中黄瓜清香味淡且偶有苦味发生的问题，本项目以黄瓜风味物质的化学物质定性与定量分析为起始点，针对黄瓜清香味和苦味物质等风味品质性状形成的分子遗传及代谢调控，重点开展如下研究。1 主要研究内容风味性状评价体系和化学数据库建立：利用以质谱为基础的代谢组学分析平台对不同黄瓜种质资源、不同的分离群体和近等基因系，在不同的生长条件下和不同的发育阶段的风味物质或其前体进行定性和定量的分析；建立风味评价的标准体系及其与次生代谢物之间的关联信息；研究将积累代谢物的高分辨质谱、同位素模式，多级质谱及含量分布等方面的信息，构建和完善黄瓜特异的化合物数据库。黄瓜清香味物质形成关键基因的功能分析：通过不同亲本间的转录组学和代谢组学间的关联分析发掘控制黄瓜风味物质合成的关键基因；分析这些基因的时空表达和体外生化特征，确定参与清香味风味物质形成及转运的关键基因；利用所获得结构基因的启动子序列和酵母单杂交等生化手段，结合基因-代谢物相关性信息确定参与相关代谢途径的调控基因；通过转基因的方法对所获得的调控基因的体内功能进行确证，解析它们与清香风味物质合成的关系。 黄瓜苦味物质葫芦素合成和转运关键基因的功能分析：克隆相关候选基因，分析基因表达的时空特异性，在酵母等体外表达系统中验证其生化功能，并在酵母体系中重组葫芦素的代谢合成途径；确定葫芦素合成代谢途径的调控和转运基因，通过分析相关突变体验证其体内功能。 野生种抗病砧木嫁接对黄瓜果实风味品质性状的影响及分子调控机制：研究葫芦科野生种抗病砧木对黄瓜果实次生代谢物质合成、转运及积累过程的影响效应，克隆、验证相关候选基因，探讨果实风味品质性状与抗病性表达或信号调控的相互关系，以及病理感应、传递或抗病分子的调控机理。2研究目标阐明黄瓜苦味、清香味生成的关键步骤和调控机理，获得与葫芦素形成和转运相关的关键结构和调控基因，明确其生物学功能。获得调控代谢途径的转录因子，并在转录组学和代谢组学水平系统阐明这些转录因子在整个代谢网络中的位置和作用，探明抗病砧木嫁接对接穗风味品质的影响机制。课题承担单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国农业科学院蔬菜花卉研究所、首都师范大学课题负责人：王国栋研究员学术骨干：谢丙炎、李乐攻、金治平经费比例：13.5%课题6 主要蔬菜品质改良的全基因组分子设计充分利用上述各研究课题的成果，开发可用于对蔬菜商品品质和风味品质进行综合改良的分子标记辅助选择工具和育种程序，是实现本项目基础研究成果转化为实用技术的关键。本课题以白菜、甘蓝、黄瓜和番茄为对象，进行分子育种工具与技术的开发。重点开展如下研究：1主要研究内容高密度分子标记检测与背景选择标记系统研发：根据白菜、甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜作物重测序数据库和功能基因组分析信息，筛选一批稳定可靠的分子标记，使用Illumina芯片系统或其它先进标记检测系统开发一套稳定、高效的高密度分子标记检测体系。以此为基础，通过对核心育种材料的分析，筛选出多态性丰富、检测稳定、在基因组中分布均匀的SNP、InDel或SSR等标记，用于追踪优良亲本背景。前景选择标记系统开发：针对白菜/甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜作物，应用高密度分子标记检测方法，进行重要品种资源和特定遗传群体分析，筛选出适于如下三个方面性状筛选的前景选择标记：1）白菜/甘蓝耐抽薹性、富含有益硫甙、早熟性和根肿病抗性；2）黄瓜果实刺瘤的有无、果皮的薄厚、果把长短、种子腔直径、苦涩、清香味、抗霜霉病、抗白粉病选择的前景标记；3）番茄果实大小、皮薄厚、固形物多少。品质改良全基因组分子育种策略研究：根据白菜、甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜品质性状在自交、回交、杂交和复交等不同分离群体中分离规律。建立通过分子标记进行前景和背景选择高效聚合分散在不同亲本材料中的大量目标基因的育种策略与技术方案。优质新材料创制和优质新品种培育：在实际育种过程根据全基因组分子设计，针对白菜、甘蓝、黄瓜和番茄商品品质和风味品质进行综合改良，获得一批耐抽薹和抗裂球的、高产抗病的白菜和甘蓝新材料和新品种，获得一批果形好、清香味浓、无苦味的、高产抗病的黄瓜新材料和新品种，获得一批抗裂果、畸形果率低、高产抗病的番茄新材料和新品种。2预期研究目标构建高效的前景与背景筛选系统，建立品质改良的全基因组分子设计理论和方法体系；对现有主要亲本的品质性状缺陷进行改良，创制40份优质新材料，培育出58个优质新品种或组合。课题承担单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京市农林科学院蔬菜研究中心课题负责人：王晓武研究员学术骨干：方智远院士，杜永臣，孙日飞，顾兴芳，张凤兰经费比例：18.6%（五）课题间相互关系本项目的各项研究是在研究对象白菜、甘蓝、黄瓜和番茄基因组框架图已经构建完成的基础上进行，将充分利用基因组资源对两个科学问题（遗传构成和调控机制）进行深入研究，并构建品质性状分子改良的技术基础（图2）。由于蔬菜作物不同品质性状的遗传构成研究具有共性，设置全基因组关联分析（课题1）和关键基因分离鉴定（课题2）两个课题，关联分析所确定的关键遗传位点是关键基因克隆的基础；在基因调控机制的研究上，叶球形成属于营养器官的发育过程（课题3），果实形成属于生殖器官的发育过程（课题4），而风味形成属于次生代谢过程（课题5），各俱特色，因此各设定一个课题深入研究；两个科学问题的研究之间也有很多信息的交互。承接前5个课题的科学发现，开发前景选择和背景选择技术平台，建立品质改良的全基因组分子设计的理论和方法体系，预期将产出新育种技术、新育种材料和新优质品种（组合）。图2. 课题设置及其关系四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 种质资源品质性状调查和测定，构建品质性状表型数据库。2. 筛选种质资源材料和亲本材料，准备重测序。3. 白菜和甘蓝叶球形成不同时期的基因表达谱分析；甘蓝叶球形成相关基因的筛选；白菜和甘蓝抽薹开花关键基因的克隆与MIKC结构域等生物信息学分析。4. 分离与大白菜叶球形态发生和未熟抽薹有关的基因和表观遗传因子。5. 生长素和细胞分裂素等内源激素对叶卷曲和叶球形态发生进程的影响。6. 大白菜中过表达或沉默几个重要的miRNA或靶基因。7. 大白菜叶卷曲和叶球形成的纯合突变体基因芯片分析和转录组分析。 8. 利用黄瓜遗传群体，对黄瓜瓜把长短和果肉厚度进行精细定位。9. 在黄瓜上对 HAN，CLV1， CLV3，YODA，ANT进行同源克隆；利用RT-PCR和RNA原位杂交等技术，分析果形相关基因的时空表达特性。10. 通过比较初步确定黄瓜果瘤Tu候选基因，开发共分离标记，并进行Tu候选基因的功能分析。11. 黄瓜单性结实遗传群体构建及遗传规律分析。12. 黄瓜苦味形成基因的精细定位。克隆黄瓜LOX，ADH，HPL等清香味物质合成相关基因。13. 构建分离群体，对番茄黄果形成基因r进行精细定位，对紫果形成基因（未知基因）和高番茄红素含量基因（未知基因）进行初步定位。14. 在番茄上精细定位番茄RG和PST基因，确定PST候选基因及其突变位点；完善RG和PST基因的NILs构建。15. 对具有不同代表性的黄瓜品种进行全面的化学物质分析；克隆和分析黄瓜苦味物质葫芦素形成关键结构基因和转录因子序列。16. 高密度分子标记检测与背景选择标记系统研发：根据白菜、甘蓝、黄瓜和番茄等蔬菜作物重测序数据库和功能基因组分析信息，筛选出多态性丰富、在基因组中分布均匀的SNP、InDel或SSR等标记。17. 前景选择标记系统开发：1）白菜耐抽薹性；2）甘蓝叶球颜色；3）黄瓜果实苦味和果实光泽；4）番茄果实大小。1. 构建完成白菜、甘蓝、黄瓜和番茄的种质资源品质性状表型数据库。2. 进一步的重测序准备工作完成。3. 获取叶球形成和展开不同时期甘蓝基因表达谱；分析差异表达基因，筛选出叶球形成相关基因。获得白菜和甘蓝抽薹关键基因序列及其结构域等生物信息。4. 筛选10个以上控制叶卷曲和叶球形成相关基因的候选基因，确定不结球、裂球、未熟抽薹的纯合基因型，建立2-3个基因芯片和转录组分析的数据库。5. 初步完成黄瓜的瓜把长短和果肉厚度等性状的精细定位。6. 得到黄瓜瓜形调控关键基因的关联分析、分离与鉴定的初步结果。7. 筛选获取黄瓜Tu候选基因，共分离标记验证。8. 明确黄瓜单性结实性状的遗传特征.9. 完成黄瓜苦味形成基因的精细定位。获得黄瓜清香味物质代谢途径中的关键基因序列。10. 完成对番茄r基因精细定位及控制紫果、提高番茄红素含量基因的初步定位工作。11. 确定番茄rg位点的精确染色体区域；获得pst候选基因及其突变位点。12. 摸索建立适合黄瓜化学物质分析的方法体系，初步完成黄瓜特异化合物数据库的建立（包括定性定量的信息），获得3-5个黄瓜苦味物质葫芦素形成关键结构基因并进行体外生化分析。13. 高密度分子标记检测与背景选择标记系统研发：针对白菜、甘蓝、黄瓜和番茄，每种作物筛选不少于1536个SNP、InDel或SRR标记，标记分布均匀。14. 前景选择标记系统开发：1）白菜：开发3个耐抽薹主效关键基因选择标记；2）甘蓝：开发叶球颜色的选择标记，遗传距离小于5cM；3）黄瓜：开发果实无苦味和有光泽选择标记，遗传距离小于5cM；4）番茄：开发番茄果实大小，与目标基因连锁距离小于2cM。第二年1. 完成筛选材料的重测序，挖掘SNP和SV等遗传变异位点，连锁不平衡分析确定连锁遗传区域，并构建全基因组遗传变异图谱。2. 利用表型数据和遗传变异图谱进行全基因组关联分析，确定控制品质性状的关键遗传位点和候选基因。3. 甘蓝和白菜叶球形成相关基因的克隆及其与叶球形成相关性分析；控制抽薹开花关键基因的相互作用原核验证。4. 分离大白菜中与叶球形成相关的miRNA，并进行过表达或沉默研究。5. 黄瓜瓜把长短和果肉厚度的精细定位，结合课题1的基因组关联分析，筛选和预测目标基因的候选基因。6. 分析黄瓜瓜形调控关键基因的时空表达特性，对这2-4个关键基因进行TILLING突变体库的筛选，构建这2-4个关键基因的过量表达和RNAi诱导缺失突变的载体。7. 黄瓜果瘤Tu候选基因的转基因功能验证。8. 黄瓜单性结实性状的主效QTL定位，并进行黄瓜单性结实果实发育的转录组学研究。9. 黄瓜苦味形成基因的候选基因分析，进一步缩小黄瓜清香味物质合成基因的候选区域。10. 对番茄紫果形成基因和高番茄红素含量基因进行精细定位，确定候选基因区域。11. 精细定位番茄RG位点，确定其候选基因及其突变位点。12. 构建番茄NILs，转基因功能验证PST候选基因。13. 继续克隆和分析黄瓜苦味物质和清香味物质形成关键结构基因和转录因子序列，对上一年度克隆的关键基因在不同黄瓜品种进行时空表达分析和化学表型相关分析，进一步完善黄瓜特异化合物数据库地建设。14. 建立SNP（或InDel）标记芯片检测、高通量电泳检测等高效标记分析系统，筛选一批稳定可靠的分子标记。15. 前景选择标记系统继续开发：1）白菜耐抽薹性、高胡萝卜素含量；2）甘蓝叶球颜色、中心柱长；3）黄瓜果实光泽；4）番茄果实硬度、固形物含量。1. 构建全基因组遗传变异图谱，SNP和SV标记数目分别大于100万和5万个。2. 为每个性状确定3-5个关键遗传位点，并为每个位点确定30个以下候选基因。3. 检测结球、不结球和结球不紧实甘蓝突变体内基因表达情况，分析基因表达的差异，结合上述分析确定叶球形成关键基因的目标基因。获得抽薹开花关键因子的原核表达蛋白相互作用体系。4. 鉴定35个控制叶球商品品质的关键基因，搞清楚2-3个调控叶球发育相关基因的生物学功能，揭示不结球、未熟抽薹的遗传基础。5. 精细定位黄瓜瓜把长短和果肉厚度QTL。6. 完成黄瓜Tu候选基因的表达模式分析，初步完成其遗传转化。7. 解析黄瓜瓜形调控关键基因的时空表达特性, 挑选出2-4个对黄瓜瓜形起关键调控作用的候选基因。对候选的关键基因进行TILLING突变体库的筛选;构建关于候选关键基因的过量表达和RNAi诱导缺失突变的载体。8. 明确黄瓜单性结实性状的QTL位点数，实现初步定位。获得果实发育过程中相关的转录组信息。9. 确定黄瓜苦味形成基