耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA课件.ppt
耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌M R S AMethicillin Resistant Staphylococcus Aureus,范 红 党华伟 四川大学华西医院临床微生物试验室,Case 1,反复咳嗽，咳痰10余年，再发伴胸闷、大汗淋漓40天;因“慢支、肺气肿并双下肺感染急性左心衰” 入院治疗;血RT : WBC : 9.0X10 9/L N : 0.80 L : 0.15;痰细/真菌培养：金黄色葡萄球菌（+），大肠杆菌（+），肺炎克雷 伯菌（+）,鲍曼/溶血不动杆菌（+）;白色念珠菌（+）;入院前已使用了阿莫西林克拉维甲酸，引发黑便，新喹诺酮类和四 代头孢菌素，总疗程约40天。用氟康唑片6天。,入院,左氧氟沙星0.2 ivdrip qd 7天，后改加替沙星 0.2mg ivdrip qd 9天，未见肺部炎症好转， 加用阿齐霉素 0.5 ivdrip qd 7天后肺部罗音有所好转，比原来明显减少，但是仍然在双下肺后部可以听到罗音，同时患者出现腹泻;查大便RTOB，未见伪膜，OB（），未见WBC,未见RBC，真菌/;痰细/真菌培养: 金黄色葡萄球菌（+）;大便细/真菌培养: 金黄色葡萄球菌（+）；先后使用阿贝卡星、头孢唑啉 、泰能等不同种类抗生素；痰细/真菌培养: 金黄色葡萄球菌（+）;大便细/真菌培养: 金黄色葡萄球菌（+）；病人出现菌血症、高烧、终因呼吸衰竭死亡。,http:/,四川大学华西医院2006年第一季度临床常见病原菌耐药分析实验医学科微生物实验室 我院实验医学科临床微生物实验室2006年第一季度常见病原菌按检出菌株数排列，前8位分别是大肠埃希菌（281株）、金黄色葡萄球菌（231株）、绿脓假单孢菌（170株）、鲍曼/溶血不动杆菌（175菌）、肺炎克雷伯菌 （108株）、表皮葡萄球菌（77株）、阴沟肠杆菌（64株）、嗜麦芽窄食黄单孢菌（73株）。 超广谱内酰胺酶（ESBLs）：大肠埃希菌122/281（43.42） 肺炎克雷伯菌 41/108(37.96%) 产酸克雷伯菌 3/19 (15.80%) 耐甲氧西林的金黄色葡萄球 （MRSA）199/231（86.15%） 耐甲氧西林的表皮葡萄球菌 （MRSE）63/77 （81.82%）,表II 常见革兰阳性球菌的耐药情况,【注：分母为检出菌株数，分子为耐药株数，%为耐药率。】,常见革兰阳性球菌的耐药情况 （四川大学华西医院2006年第一季度）,主要内容,一，MRSA,生物学特性耐药机理分型及检测流行状况治疗和预防,二，CA-MRSA/HA-MRSA,三，讨论,流行病学致病性耐药机制抗生素选择,青霉素（1940s） 金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制 产青霉素酶，能水解-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药 耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin) 时隔两年，英国的Jevons就首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistanStaphylococcusaureus,MRSA),MRSA,一、MRSA： 生物学特性：(1),营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。(2),血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。(3),甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。,表面光滑、凸起、湿润 , 直径 1 2mm 。灰黑色至黑色 , 有光泽 , 常有浅色 ( 非白色 ) 的边缘 , 周围绕以不透明圈 ( 沉淀 ), 其外常有一清晰带 ( 卵磷脂环 ) 。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。,BP琼脂上典型特征,Baird-Parker,典型的金葡为球型，直0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜,金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落,扫 描 电 镜,引起深部感染的主要致病菌之一，包括肺部感染，脑、肺、肝、肾、乳腺等脏器脓肿，骨髓炎，脓毒性关节炎，心内膜炎，败血症，脓毒病(sepsis)等,肺脓肿病理学切片,由金黄色葡萄球菌引起的败血症病人血培养的革兰染色,MRSA的分型,MRSA分型对追踪传染源，研究型别与感染种类，耐药性的关系有重要作用;噬菌体分型、质粒图谱分型、免疫印迹法、血清学、凝固酶、耐药谱方法分型。现在Southern印迹法也逐渐运用于MRSA的分型。,MRSA的生物学特性,不均一耐药性 敏感亚群：30%-60% 耐药亚群：40%-70% 广谱耐药性 对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹 喏酮类、磺胺类、利福平等均产生不同程度的耐药， 唯对万古霉素敏感。,MRSA的耐药机理,固有耐药,获得性耐药 获得性耐药 是质粒介导的耐药。某些菌株通过耐药因子产生大量-内酰胺酶， 使耐酶青霉素缓慢失活，表现出耐药性，多为临界耐药。,耐-内酰胺类,固有耐药,编码抑制因子,编码诱导因子,吸引其他耐药基因,多重耐药基因存放点,染色体盒重组基因复合体,插入子,葡萄球菌染色体mec基因盒SCCmec,对其他各类抗生素的耐药机制,MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量PABA等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药,MRSA的检测,MRSA的检出率受孵育温度、时间、培养基的pH和NaCl的浓度、菌液的数量等多种 因素的影响。且由于MRSA的不均一耐药性，给其检测带来一定的困难。,MRSA的检测,1纸片扩散法(K-B法)MH琼脂厚度为4 mm，菌液调至0.5麦氏浊度，甲氧西林含量5 g/片，35C孵育24 h，抑菌圈11 mm为耐药，17 mm为敏感;苯唑西林(1 g/片)在贮存过程中药效不易降低，且对不均一耐药性检测效果更好， 抑菌圈10 mm为耐药，13 mm为敏感，1112 mm为中介。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213(耐药菌株)，金黄色葡萄球菌ATCC 25923(敏感菌株);优点是快速、简便、价格便宜;,纸片扩散法(K-B法),MRSA的检测,2肉汤稀释(MIC)法MH肉汤培养基加NaCl至20 g/L浓度，同时加入Ca,Mg离子，将苯唑西林进行倍比稀释，从0.12516 g/ml，菌浓度为104/ml，35C孵育24 h;MIC2 g/ml为敏感，4 g/ml为耐药，该法检出率可达95%;操作较繁琐;,MRSA的检测,3琼脂稀释(MIC)法用含20 g/L NaCl的MH琼脂将苯唑西林倍比稀释为12个不同浓度并浇注平皿;苯唑西林量终浓度为0.125256 g/ml;菌液(0.5麦氏浊度)点种于含药平皿，35C孵育24 h;适用于大量菌株的MRSA检测，结果容易判断，重复性好，但耗时，费力;,MRSA的检测,4琼脂筛选法MH培养基加NaCl(40 g/L)加苯唑西林(6 g/ml)，将菌液(0.5麦氏浊度)点种或画线35C孵育24 h，只要平皿有菌生长，即使一个菌落也是MRSA，敏感度为100%，常用作校正其它方法的标准，尤其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的金黄色葡萄球菌。,MRSA的检测,5浓度梯度(Etest)法在含20 g/L NaCl的MH琼脂平板上，贴上苯唑西林的试条，菌液调至0.51麦氏浊度35C孵育24 h，直接读取MIC值;MIC2 g/ml为敏感，4 g/ml为耐药。长塑料条含有连续的呈指数梯度变化的苯唑西林(0.016256g/ml)，故在检测低水平或中等程度耐药的MRSA时结果更为准确;精确、可靠、稳定性好的特点，但缺点是价格昂贵;,MRSA的检测,6自动化药敏检测目前有Vitek系统、ATB系统、MicroScan系统、Sensiter ARIS等;将菌液稀释后注入药敏板或孔内，然后通过检测菌液浊度，荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果;其优点是快速，但有时对生长缓慢或延迟表达耐药性的MRSA，在34 h内难以达到检测水平，容易漏检或误报MRSA;,MRSA的检测,7DNA探针杂交上述的方法都是检测MRSA耐药表型的方法;对于低水平耐药或临界水平耐药的MRSA，应选择特异性高的分子生物学方法来检测;DNA探针杂交是用特异性的mec A DNA片段经地高辛标记，与可疑菌株进行杂交;其特异性高于琼脂稀释法，敏感性高于肉汤稀释法，而且可直接用于临床标本，无需先进行细菌分离培养，但探针较贵，保存期较短;,MRSA的检测,8PCR技术根据金黄色葡萄球菌TK 784的mec A基因DNA序列设计一引物，再裂解提取被测菌的DNA，在一定条件下进行扩增，经琼脂糖电泳后在紫外灯下观察有无与阳性对照菌株(金黄色葡萄球菌ATCC29213)相同的区带。PCR具有较高的灵敏度，因此常作为检测MRSA的参考方法。,MRSA的治疗和预防,MRSA的治疗万古霉素是三环糖肽类抗生素，其具有抑制细胞壁合成，破坏细胞膜及阻碍细菌RNA合成的多种作用，是目前临床上治疗MRSA唯一疗效肯定的抗生素；1996年日本报道第一例对万古霉素中度敏感(MIC=8g/ml)的金黄色葡萄球菌；NCCLS规定：万古霉素敏感4 g/ml，中介816 g/ml，耐药32 g/ml；除万古霉素外，还有壁霉素、香豆霉素等新药对MRSA有较 强的抗菌活性。另外，万古霉素也可与磷霉素、利福平、氨基糖苷类、喹诺酮类药物合用，加强治疗效果。,MRSA的治疗和预防,MRSA预防 首先是合理使用抗生素； 早期检出带菌者； 加强消毒制度；,MRSA感染的流行概况,美国 NNIS报道1975年182所医院MRSA占金黄色葡萄球菌感染总数的2.4% 1991年上升至24.8%，其中尤以500张床以上的教学医院和中心医院为多；欧洲 1993年1417家医院ICU分离的MRSA达60%；日本 Kansai医科大学附属医院MRSA的分离率1993年达到41%；上海 1978年在200株金黄色葡萄球菌中MRSA只占5%，1988年上升至24% 1996年激增至72%；天津 1988年调查MRSA分离率为47%；北京 医科大学附属医院1996年分离MRSA达58.3%；山东淮坊 1996年在三家医院的婴儿室分离出金黄色葡萄球菌198株，其中 MRSA为112株(56.5%) ；武汉 同济医科大学附院1992年分离MRSA就达79.6%；,二，CA-MRSA/HA-MRSA,CA-MRSA：Community Acquired MRSA 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌HA-MRSA: Hospital Acquired MRSA 医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,流行病学致病性耐药机制抗生素选择,CA-MRSA/HA-MRSA,流行病学,1, 国外学者 国内学者,CA-MRSA所占比例逐年增高；,2，年龄构成：中外学者报道类似，即CA-MRSA患 者平均年龄小于HA-MRSA患者，以中青年为主， 且多无基础性疾病。,致病性,1，产生的外毒素不同2，基因水平的研究,杀白细胞毒素致病力更强,超抗原肠毒素B和肠毒素C,PVL基因,葡萄球菌肠毒素基因： seb、sec、she基因等,耐药机制,1，,CA-MRSA：I、II、III HA-MRSA ：IV、 V,2， CA-MRSA增多的原因,HA-MRSA出院患者直接将感染的MRSA传给,社区人群社区MSSA 患者获得了IV、 V 型mec基因,抗生素选择,1， HA-MRSA：目前以糖肽类为主，国内尚未发现耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（Vancomycin Resistant Staphylococcus Aureus VRSA ）;2，CA-MRSA：环丙沙星、克林霉素等；3，对万古霉素敏感但疗效不明显，疑与异质性有关；,讨 论,多重耐药的鲍曼不动杆菌在近些年也出现了严重的院内流行；MSSA MRSA VRSA; A baumannii Stirring Similar Concerns?出路？,研发新型抗生素,合理使用抗生素，减轻现有抗生素压力,41,谢 谢 ！,
