第八章生物样品内中药制剂化学成分测定课件.ppt
12/4/2022,体内药物分析,1,第八章 生物样品内中药制剂 化学成分简介,药物分析教研室,12/4/2022,体内药物分析,2,第一节 概述第二节 生物样品的种类、采集、制备与贮存 第三节 生物样品的预处理与制备,内容提要,第三章 生物样品与样品制备,12/4/2022,体内药物分析,3,第一节 概述,一、生物样品内药物分析的性质、意义和任务（一）生物样品内药物分析的性质 生物样品内药物分析，又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门新兴学科。旨在通过各种分析手段，了解药物在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息，从未为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对栓研究的药物作出估计与评价，对药物的改进与发展作出贡献。,12/4/2022,体内药物分析,4,（二）生物样品内药物分析的意义,1、生物样品内药物分析在新药评价和新药开发中的意义 大量事实证明，如无临床药理学和临床药学研究给新药以确切的评价，要做到临床安全、合理、有效地用药将会遇到许多困难。因此，加强药物在生物样品内作用机理的研究，以了解和阐明药物药物结构、理化性质、剂型及生产工艺与药物疗效等关系，已成为评价药品质量的重要内容和依据。,12/4/2022,体内药物分析,5,2、生物样品内药物分析在临床合理用药中的意义 影响血药浓度的因素很多，同一种给药方案难以对每一个病人都达到理想的治疗效果，为达到用药安全、合理、有效，必须设计个体化给药方案，久需要好对治疗药物监测，以血药浓度为指标，达到个体化用药。,12/4/2022,体内药物分析,6,（三）生物样品内药物分析的任务,1.在药物浓度监测中的应用 只有具有明确治疗范围，血药浓度和药效关系密切，且具有下列情况者，要求进行农药检测：有效血药浓度范围窄，剂量小，毒性大的药物；药代动力学个体差异大、药理作用强、不易估计给药后的血药浓度药物；药物的毒性反应与该药治疗的疾病症状相似，难以判断是剂量不足还是药物毒性所致；联合用药时，由于药物相互作用产生不良反应，需要调整药物剂量者；在短期内难于判断疗效的药物，预测药物能否达到预防效果；判断患者用药的依从性等要求进行药物浓度检测。,12/4/2022,体内药物分析,7,2.在药代动力学研究中的应用 通常涉及药物在生物样品内的吸收、分布、代谢和排泄等过程，常研究药浓-时间曲线变化。生物制品内内源性物质的含量，对于疾病的诊断或及早预防具有重要的意义。3.分析方法学的研究 分析方法学研究，提供合理的最佳分析条件，估计、评定各种方法达到的灵敏、专属、准确程度、探讨各种方法应用与生物样品内药物分析中的规律性，为临床药学的研究提供准确、灵敏、快速的分析方法。,12/4/2022,体内药物分析,8,二、生物样品内药物分析的对象与特点,（一）生物样品内药物分析的对象凡是生物样品内药物到达之处，如体液、器官、组织、排泄物等都是分析的对象，所以生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、各种器官以及呼出的气体等。生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物，因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，可了解药物在生物体内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药物质量也是非常重要的。由于新药进入临床试验之前，或者对老药在某一方面的重新评价，一般要求现在动物体上进行实验，所以生物样品内药物分析对象不仅是人体，也包括动物体。,12/4/2022,体内药物分析,9,（二）生物样品内药物分析的特点,与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏度和选择性等方面有较高的要求。微量药物存在于大量生物介质中，样品中含内源性干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情况不同而有所不同。很多药物在生物样品内经过代谢可产生一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结合，这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分析方法具有更高的选择性。另外，在生物样品中，药物浓度都很低，一般血药浓度在10-6-10-9 g/ml之间，且生物样品若为血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有较高的灵敏度。1.干扰杂质多2.样品量少3.要求较快提供结果。,12/4/2022,体内药物分析,10,一、生物样品的种类、采集和制备,血液(血浆、血清)体现药物浓度和治疗作用之间的关系(联接) 最常用的生物样本,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,11,尿液用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,唾液用于某些S/P较为恒定的药物 的测定,一、生物样品的种类、采集和制备,12/4/2022,体内药物分析,12,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织 动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡,毛发 可用于药物滥用监测及微量元素测定,一、生物样品的种类、采集和制备,12/4/2022,体内药物分析,13,（一）血液（blood）,因血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系，是最为常用的生物样品分为全血、血浆和血清,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,14,1. 血样的采集,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,一般用注射器直接采集静脉血，每次15ml；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一,12/4/2022,体内药物分析,15,测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,2. 血样的制备,12/4/2022,体内药物分析,16,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,血浆的制备,采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以25003000r/min离心510min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆（ plasma ）,抗凝剂最常用的是肝素（heparin）其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等,12/4/2022,体内药物分析,17,血清的制备,采集的静脉血液置试管中，于37或室温放置30min1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在25003000 r/min离心510min，上层淡黄色液体即为血清（serum）,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,18,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 C血浆= C血清 血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%60%（血清为全血的20%40%），多数用血浆进行分析。 若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品,血浆与血清的区别,12/4/2022,体内药物分析,19,全血的制备,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,20,全血的制备,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血（全血净化较血浆和血清麻烦） 血浆和红细胞中分配比不是常数，则应使用全血样品 例：三环类降压药在个别病人体内血浆和红血球中的分配比不是一个常数，故宜采用全血样品进行药物动力学的研究,12/4/2022,体内药物分析,21,全血制备,将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为“全血” （whole blood）,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,22,血样主要应用于： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,血样的应用,12/4/2022,体内药物分析,23,（二）尿液(urine),尿液用于药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、相及相代谢物等多种形式排出,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,24,（二）尿液(urine),第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,性状淡黄色或黄褐色，相对密度 1.1051.020，pH4.88.0成分水、含氮化合物、盐类等微生物防腐剂,12/4/2022,体内药物分析,25,尿液的采集,样本来源自然排尿，成人一日排尿 量为15L（随时尿、晨尿、白 天尿、夜间尿及时间尿）,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,样本采集一般采集时间尿（规定 时间内采集尿液体积和排 入尿中的药物总量,12/4/2022,体内药物分析,26,（三）唾液 （saliva）,唾液无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关，因此：TDM中利用对S的测定代替对P的监测药代动力学的研究,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,27,唾液采集,在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰),第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,28,唾液采集,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,物理法：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或 纱布球等化学法：将柠檬酸或维生素C等置于舌 尖，弃去初始部分后采集化学法的优点：缩短采样时间减小唾液pH波动（pH7.0），S/P个体差异小,12/4/2022,体内药物分析,29,唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,唾液样品的制备,12/4/2022,体内药物分析,30,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集, 非伤害性方法，病人易接受 采集不受时间、地点限制，易收集 灵敏度较高的血药浓度测定方法可 以直接或稍加改进使用 一些药物的唾液药物浓度(S)与血浆游离药物浓度(P)密切相关，可使用唾液样品,唾液样品的特点,12/4/2022,体内药物分析,31,TDM如苯妥英钠的Cs/Cp比值恒定、个体差异小，可用于癫痫病人的TDM 药代动力学参数测定用GC-MS分析测定可卡因，血浆和唾液中的t1/2 分别为3.8h和7.9h,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,唾液样品的应用,12/4/2022,体内药物分析,32,（四）器官组织（tissue）,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,1匀浆化法 加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上清液供萃取用 方法简单、但回收率低,组织处理的一般方法有：,用于动物试验药物动力学研究临床服用药物引起中毒死亡,12/4/2022,体内药物分析,33,2沉淀蛋白法 在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀蛋白质后取上清液供萃取用，操作简单、但回收率低，较为常用.,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,（四）器官组织（tissue）,12/4/2022,体内药物分析,34,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,3酸水解或碱水解 组织匀浆中加入适量的酸或碱，置水浴中加热，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用 适用对热稳定的药物，应用较少。,（四）器官组织（tissue）,12/4/2022,体内药物分析,35,组织匀浆中加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用 最常用的酶枯草菌溶素（一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在pH7.011.0较宽的范围内使蛋白的肽键降解，在5060具有最大活力）,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,返回 去除蛋白质方法,4酶水解法,（四）器官组织（tissue）,12/4/2022,体内药物分析,36,优点酶解法操作简便 避免药物在酸及高温下降解 对与蛋白结合紧密的药物，可显 著改善回收率 可用有机溶剂直接萃取酶解液 而无乳化现象生成缺点不适用于在碱性下易水解的药物,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,返回 去除蛋白质方法,4酶水解法,（四）器官组织（tissue）,12/4/2022,体内药物分析,37,（五）头发（hair）,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,应用 体内微量元素含量测定 用药史的估计 临床用药和药物非法滥用 的区别、毒性药物检测,12/4/2022,体内药物分析,38,（五）头发（hair）,优点取样方便、可重复采样通过测定某些特定的代谢物将 药物滥用和临床用药相区别能获数月数年的长期用药信息缺点预处理繁杂、干扰多分析对象的含量低、需精密仪器,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,39,1广谱性（代谢产物及微量元素排泄器官）2积累性（长期富集各代谢产物）3稳定性（水分含量少）4依时性（反应某时期药物的积累）5相关性 （与人体内部器官相关）6指纹性（环境、饮食等）,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,（五）头发检测的性质,12/4/2022,体内药物分析,40,采集代表性和同一性 采集枕部发样 微量元素在前额部位的头发中 含量最低，枕部含量最高洗涤除去外源性污染物,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,（五）头发的采集与洗涤,12/4/2022,体内药物分析,41,毛发样品的制备,1毛发中药物的提取常用方法： 直接用甲醇提取 酸水解(0.1mol/L盐酸) 碱水解(1mol/L氢氧化钠) 酶水解(-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶) 2有机破坏法,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,返回 第一节,12/4/2022,体内药物分析,42,二、生物样品的贮存与处理,冷藏冰箱(4)中短期保存(12d) 冷冻冷柜(-20)或低温冷柜(-80) 中长期保存冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定,返回 第一节,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,43,生物样品的贮存,血样 采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后再贮存若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离置硬质玻璃试管中完全密塞后保存,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,12/4/2022,体内药物分析,44,尿样 采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为2436h(4)或长期(-20),第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,生物样品的贮存,12/4/2022,体内药物分析,45,唾液 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4以下保存保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定唾液pH时应在取样的当时为好冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,第一节返回 第三章,生物样品的贮存,12/4/2022,体内药物分析,46,注意事项： 1冷冻的样品测定时，需临时解冻。解冻后的样品应一次性测定完毕，不应反复冻融2如果采集的样品不能一次性测定，则应以小体积分装贮存，每次按计划取一定数量进行测定,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,第一节返回 第三章,生物样品的贮存,12/4/2022,体内药物分析,47,第三节 生物样品的预处理与制备,样品预处理技术 分离、纯化、富集或化学衍生化等，为药物的最终测定创造良好的条件,第三章 生物样品与样品制备,第一节返回 第三章,12/4/2022,体内药物分析,48,样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节；也是分析中最困难、最繁杂的工作 对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，必须结合测定实际和要求，采取恰当的方法和技术,第三章 生物样品与样品制备,第一节返回 第三章,第三节 生物样品的预处理与制备,12/4/2022,体内药物分析,49,本节内容：,一、生物样品预处理的目的 二、样品制备时应考虑的问题 三、生物样品的预处理与制备技术,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,第一节返回 第三章,12/4/2022,体内药物分析,50,一、生物样品预处理的目的,使药物从缀合物及结合物中释放 测定药物的总浓度 使样品纯化消除生物基质中内源性物 质的干扰提高检测灵敏度适应和符合测定方法 要求的灵敏度防止分析仪器的污染和劣化提高分 析仪器的耐受程度、改善分析结果,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,51,（一）使药物从缀合物及结合物中释放,药物吸收蛋白结合物相代谢代谢物相代谢缀合物 在体内存在形式： 游离型药物 +代谢物 +药物或代谢物与蛋白结合物 +药物或代谢物相代谢的缀合物 预处理药物或代谢物从“结合物”或缀合物中释放，测定药物或代谢物的总浓度,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,52,（二）使样品纯化,生物样品的基质组成复杂、干扰多血清中含有高分子的蛋白质和低分子 的糖、脂肪、尿素等有机物，也含 有Na+、K+、Cl- 等无机物尿液中含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、 Na+、K+、Cl- 等药物组分药物含量低，一般为g或 ng水平，经预处理使纯化、富集,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,53,（三）提高检测灵敏度,预处理降低背景噪音提高灵敏度 特异性强、灵敏度高的分析方法 预处理简单 不具备分离功能的方法(光谱法) 预处理十分重要,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,54,（四）防止分析仪器的污染和劣化,生物样品基质中脂肪、蛋白质、不溶性颗粒污染分析仪器 根据分析仪器的耐受程度，选择不同的预处理方法,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节,12/4/2022,体内药物分析,55,高效液相色谱法去除血浆（或血清） 中的蛋白质,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节,（四）防止分析仪器的污染和劣化,12/4/2022,体内药物分析,56,预处理改善分析结果的准确度与精密度，延长色谱柱的寿命（除固体杂质） 改善选择性（排除生物基质的干扰） 改善组分可测性（被测组分的富集） 改善组分色谱行为（化学衍生化）,12/4/2022,体内药物分析,57,二、样品制备时应考虑的问题,1被测组分的理化性质、存在形式、浓度范围2测定目的3生物样品种类和基质的干扰类型,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节,12/4/2022,体内药物分析,58,二、样品制备时应考虑的问题,4样品的化学组成5药物的蛋白结合率6被测组分在预处理过程中的稳定性7样品在收集、储存和预处理中容器的 污染8保证必要的专属性、灵敏度、精密度和准确度的前提下预处理过程尽量简单,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节,12/4/2022,体内药物分析,59,1.药物的理化性质和存在形式,酸碱性(pKa)、溶解性提取性质挥发性挥发损失及气相色谱法的应用光谱特性分析仪器的选择官能团性质化学衍生化和检测器应用化学稳定性处理条件的选择存在形式及血浆蛋白结合率预处理方法,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,60,2.待测药物的浓度范围,不同药物在体内中浓度相差极为悬殊地高辛治疗血浓为12ng/ml水杨酸盐治疗血浓为20100g/ml浓度大预处理要求稍低浓度低样品制备要求高,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节 二、样品制备考虑,12/4/2022,体内药物分析,61,3.药物测定目的,药物测定目的不同样品预处理的要求不同：急性中毒病例要求快速鉴定所怀疑的药物，应在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，对样品预处理的要求可以粗放些,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节 二、样品制备考虑,12/4/2022,体内药物分析,62,3.药物测定目的,测定药物及代谢物要求使代谢物从缀合物中释放出来并在不同pH介质中分离获得酸性、中性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细致,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节 二、样品制备考虑,12/4/2022,体内药物分析,63,4.选用的生物样品类型,待测生物样品的类型决定样品预处理方法：血浆、血清常需去除蛋白质唾液主要采用离心沉淀除去粘蛋白尿液常采用酸或酶法使缀合物水解头发需要将头发进行有机破坏后测 定微量元素,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节 二、样品制备考虑,12/4/2022,体内药物分析,64,5. 样品预处理与分析技术的关系,1.分析方法特点(是否专属、是否具 有分离能力)2.检测系统对杂质污染的耐受程度 决定样品预处理和需要净化的程度,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节 二、样品制备考虑,12/4/2022,体内药物分析,65,三、生物样品的预处理与制备技术,生物样品的预处理大致分为以下五类1有机破坏法2去除蛋白法3溶剂萃取法4缀合物的水解5化学衍生化法,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节,12/4/2022,体内药物分析,66,（一）有机破坏法,应用微量元素测定方法1湿法破坏2干法破坏3氧瓶燃烧法,返回 毛发样品的制备 三、预处理与制备,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,67,1. 湿法破坏,常用试剂硝酸或硝酸-高氯酸特点破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态应用适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏缺点含氮杂环药物的破坏不够完全注意切勿蒸干、以免爆炸样品用量金属元素量10100g，血样 1015ml、尿样50ml,返回 毛发样品的制备,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,68,返回 毛发样品的制备,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,高温炉高温破坏应用适合人发样品的破坏,2. 干法破坏,12/4/2022,体内药物分析,69,3. 氧瓶燃烧（oxygen flask combustion）,特点操作简单、快速、设备简单仪器装置附图二,返回 毛发样品的制备,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,70,应用血浆、人发中卤素、硫、硒等 血 浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上 60烘干按规定折叠后固定 人发：洗净、干燥（60 80） 剪碎称取0.1 0.3g置无灰滤纸 中心按规定折叠固定,12/4/2022,体内药物分析,71,（二）去除蛋白质,非破坏性生物样品预处理的第一步可使结合型药物释放1.去除蛋白后取上清液直接分析测定2.去除蛋白后取上清液经进一步分离纯化、浓集后分析测定,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节 三、预处理与制备,12/4/2022,体内药物分析,72,去除蛋白质的方法,1. 加入与水混溶的有机溶剂蛋白质 脱水沉淀2. 加入中性盐“盐析”沉淀蛋白质3. 加入强酸与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性盐沉淀,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,73,去除蛋白质的方法,4. 加入重金属盐与蛋白质阴离子 (羧基)形成不溶性盐沉淀5. 超滤法半透膜滤除可溶性生物大 分子物质(蛋白质)6. 酶水解法蛋白分解酶分解蛋白质7. 加热法蛋白质变性凝固,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,74,1. 加入与水相混溶的有机溶剂,常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃血样与溶剂体积比1(13)可除去90%以上蛋白质(附图三),第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,乙腈块状絮凝物、易于分离；成分损失 可能性大，上清液pH为8.59.5甲醇细小颗粒沉淀、不易分离；成分损 失可能性小，上清液pH为8.59.5超速离心分离（12000r/min)离心12min,12/4/2022,体内药物分析,75,2. 加入中性盐,常用中性盐饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等试剂用量血清与饱和硫酸铵比例为12时除去90%以上的蛋白质(附图四)分离高速(12000r/min)离心上清液液性pH7.07.7,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,76,3. 加入强酸,常用的强酸10%三氯醋酸、6%高氯酸、 5%偏磷酸等试剂用量血清与强酸比例为10.6时，除 去90%以上的蛋白质(附图四)分离高速(12000r/min)离心12min上清液液性pH 04过量三氯醋酸煮沸分解为氯仿和二氧化碳高氯酸碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和 后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,77,4. 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂,当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀 常用沉淀剂CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH血清与沉淀剂比例1(13)，分离高速(10000r/min)离心 上清液液性pH分别为5.77.3和6.57.5,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,78,5. 超滤法,性质以多孔性半透膜(超滤膜)作为分离介 质的一种膜分离技术；特点无需加热；无需添加化学试剂；无相 变化；无破坏性应用游离药物首选方法，尤其适合TDM操作分子量截留值在5万左右的超滤膜过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了的药物的血浆蛋白分离,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,79,6酶水解法,加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用最常用的酶蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.011.0)内使蛋白的肽键降解，在5060具有最大活力,第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集,返回 去除蛋白质方法,12/4/2022,体内药物分析,80,7. 加热法,测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90；蛋白沉淀后可用离心或过滤除去优点方法最简单缺点只能除去热变性蛋白,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,81,（三）分离、纯化与浓集,在生物样品的制备过程中，进行选择性分离、纯化与浓集分离消除内源性物质、代谢物或其它共存药物的干扰纯化与浓集提高被测药物的灵敏度 样品经分离、纯化与浓集与测定方法相结合，达到专属性强、灵敏度高、准确性好,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 第二节 三、预处理与制备,12/4/2022,体内药物分析,82,生物样品的分离、纯化方法,液液萃取法(传统的方法)固相萃取法(液固萃取法)自动化固相萃取技术固相微萃取膜萃取技术微透析技术超临界流体萃取法,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,83,1. 液液萃取法（liquid-liquid extraction, LLE）,大多数药物为脂溶性，在有机溶剂中溶解度大于水中 大多数内源性杂质是强级性的水溶性物质 采用有机溶剂萃取法,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,84,12/4/2022,体内药物分析,85,1. 液液萃取法 （liquid-liquid extraction, LLE）,溶剂选择合适的溶剂是成功的主要条件了解药物与溶剂的化学结构及其性质 相似相溶的原则对药物未电离分子可溶，电离形式 分子不溶沸点低、易挥散，毒性小与水不相 混溶不影响紫外检测具有较高的化学稳定性和惰性,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,86,液-液萃取法有机溶剂萃取次数 通常为1次，必要时23次 有机溶剂每次用量 与水相体积比通常为1:1或25:1通过萃取回收率确定最佳萃取次数与每次的溶剂用量,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,87,由药物的pKa确定碱性药物最佳pH值：高于pKa值12个 pH单位酸性药物最佳pH值：低于pKa值12个 pH单位一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,液-液萃取法水相pH值:,12/4/2022,体内药物分析,88,生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取 空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱性药物在pH13下提取液杂质峰少,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,液-液萃取法水相pH值:,12/4/2022,体内药物分析,89,空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图,第三章 附图五,返回 液-液萃取(续),pH13,pH7,pH2,12/4/2022,体内药物分析,90,其他方法, 离子对提取法（ion-pair extraction） 提取烷基化法（extractive alkylation）适用于离子化倾向较大，难以用溶剂直接提取的极性药物,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,91,离子对提取法,一种有机溶剂提取离子性药物的方法 原理：在体液(水溶液)中呈离解状态的酸性或碱性有机药物(Q)，与呈相反电荷离子(X)作用形成具有一定脂溶性的离子对(QX)，再用有机溶剂提取,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,92,DQ分配系数，表示药物在有机相和水相中的摩尔浓度比，数值越大，提取到有机相中的药物量越多DQ值的大小由提取常数EQX和水相中反离子浓度X-aq决定,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,以碱性药物为例，反应式如下：,12/4/2022,体内药物分析,93,测定碱性药物用烷基磺酸盐 （RSO3-）作为反离子 如戊辛烷磺酸钠、月桂磺酸钠等测定酸性药物用烷基季铵类化合物 （R4N+X-）作为反离子 如氢氧化四乙基铵、四丁基铵、 四辛基铵等,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,反离子的选择,12/4/2022,体内药物分析,94, 选用对离子对溶解度大的溶剂 氯仿、二氯甲烷等 有机相与水相比例1：1或2：1,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,常用的提取溶剂,12/4/2022,体内药物分析,95, 体液中呈阴离子状态的药物主要有磺酸类、羧酸类及代谢物葡萄醛酸苷等 体液中能离解成阳离子的药物主要是有机胺类，尤其是季铵类药物,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,离子对提取应用的药物,12/4/2022,体内药物分析,96,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,反相离子对提取法应用,皮质酮葡醛酸缀合物的离子对提取因含有羧基药物呈阴离子状态存在 反离子四戊基铵 有机相氯仿,12/4/2022,体内药物分析,97,2. 固相萃取法 （Solid-phase extraction, SPE）,原理 将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 (三)样品的分离与纯化,12/4/2022,体内药物分析,98,12/4/2022,体内药物分析,99,常用洗脱方式 药物与固定相的亲和力比杂质强 而被保留，用一种对药物亲和力更 强的溶剂洗脱 杂质与固定相的亲和力比药物强 药物被直接洗脱,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 (三)样品的分离与纯化,固相萃取法,12/4/2022,体内药物分析,100,固相萃取法,固相的选择原则 固相与被测组分应具有相似的极性 亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键 合相硅胶） 亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维） 离子交换型,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,101,固相萃取法,实验步骤第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 除去残留的甲醇第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱， 去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物， 收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接 进行在线分析,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,102,固相萃取法,注意： 1.血浆样品可直接上柱 2.样品量0.12ml 3. 流速12ml/min,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,103,固相萃取法,方法特点优点 引入杂质少 完全避免乳化的形成 在优化条件下有较高萃取率、重现性较好 使用的溶剂大多可与水混溶，易于自动化,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,缺点 价格昂贵 技术要求高 批-批之间有差异,12/4/2022,体内药物分析,104,固相萃取法各种方法的比较,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,105,SPE与LLE及沉淀蛋白法的比较,SPE 高提取率及高选择性，快速、 简单，可自动化，应用较多LLE两相间分配平衡时间较长萃取回收 率及选择性随药物及萃取条件而变化沉淀蛋白法快速简便、回收率高； 待测物含量低时不适用,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,12/4/2022,体内药物分析,106,3自动化SPE技术,优点 节约时间，400个/hr，确保了较高的工作效率 减少了操作误差，提高准确度和精密度 安全性好，可避免人对有毒样品的接触缺点 残留物对测定的影响 在采用连续测定时，要考虑样品理化 性质的稳定性对测定的影响,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,返回 (三)样品的分离与纯化,12/4/2022,体内药物分析,107,4固相微萃取法 （Solid-phase microextraction SPME ）,SPME装置简单，类似于气相色谱微量注射器，其基本装置如图,第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理,1压杆 2简体 3压杆卡持螺钉 4Z形槽 5简体视窗 6调节针头长度的定位器7拉伸弹簧 8密封隔膜 9注射针管 10熔融石英纤维 11熔融石英纤维,返回 (三)样品的分离与纯化,12/4/2022,体内药物分析,108,SPME操作方法,固相微萃取方法分为萃取过程和解吸过程两步萃取过程具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取解吸过程将已完成萃取过程的萃取器针头
