微生物ppt课件 第7章.ppt

第7章 微生物遗传变异和育种,遗传（inheritance）：,上一代生物将自身的一整套遗传信息传给下一代。,遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。,变异（variation） ：,遗传和变异:生命的最本质特性之一,遗传型（genotype）：基因型,表型（表现型）（phenotype）：,生物个体的全部遗传因子所携带的遗传信息,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,不涉及遗传物质结构改变只发生在转录翻译水平上的变化，外表的修饰性改变,特点：只与环境有关、暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）,表型饰变（modification)：,微生物是遗传学研究的模式生物：,细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。易于人工培养，快速、大量生长繁殖。对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,第一节 遗传变异的物质基础,一、三个经典的实验：经典转化实验噬菌体感染实验植物病毒重建实验,F.Griffith,1928 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae ）：有荚膜S型(有致病性），无荚膜R型（无致病性） 证明： 细胞内存在遗传物质,1、经典转化实验,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,A.D.Hershey,M.Chase, 1952放射性32PO43- 磷源，放射性35SO42-硫源标记的T2噬菌体，感染大肠杆菌证明：DNA是遗传物质,2. 噬菌体感染实验,H.Fraekel-Conrat,1956烟草花叶病毒（ TMV)霍氏车前花叶病毒（HRV）证明：核酸（RNA）是遗传物质,3.植物病毒重建实验（RNA作为遗传物质）,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区,2、细胞核水平真核生物：细胞核 核染色体原核生物 ：核 区 DNA链,核基因组,核外遗传物质,3、染色体水平染色体：由组蛋白与DNA构成多环结构,一般讲细菌只有一条染色体，双链，环状结构，在细菌细胞中盘绕、扭曲、形成许多环（LOOP）。处于超卷绕（Supercoilng）状态,有些细菌有2条染色体：布鲁氏菌（Brucella sp）：大染色体2.1Mb，小染色体1.15Mkb。霍乱弧菌（Vibrio cholerae）：大染色体2.961Mb，小染色体1.073Mb。土壤杆菌属（Agrobacterium sp）,布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的染色体是线状的,细菌染色体大小：0.5813Mb之间；生殖道衣原体0.58Mb，蓝细菌13Mb（脉冲场凝胶电泳（PFGE）测定）。,单倍体（heploid）：一个细胞中只有一套染色体,二倍体（diploid）：一个细胞中含有两套功能相同的染色体,真核微生物，多条染色体，例如啤酒酵母有16条染色体。,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,基因组（genome）： 一个物种的单倍体的所有染色体及其所含的遗传信息的总称。碱基对（base pair,bp），千碱基对（kb）百万或兆碱基对（Mb）,5、基因水平,基因（gene）：生物体内具有自主复制能力的最小功能单位，是一段具有特定功能和结构的连续的序列。基因大小1000-1500bp基因名称：hisG、lacZ编码蛋白质： HisG抗性基因：strR,鳗弧菌（Vibrio anguillarum）金属蛋白酶基因序列,6、密码子水平,Condon: 密码子,7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位：A、G、 T、 C,被选择进行全基因组测序的微生物：,1）人类基因组计划中的模式生物,2）与人类生活关系密切的微生物,3）对阐明生物学基本问题有价值的微生物,Methanococcus jannaschii (詹氏甲烷球菌)：古菌,（二）微生物基因组结构特点,174噬菌体基因组：1977年，Sanger F，Maxam A等发明了快速DNA测序，第一个全长5387bp的174噬菌体基因组测序；,流感嗜血杆菌(Heamophilus influenza)： 由诺贝尔奖金获得者Smith H O领导的John Hopkins大学小组和Venter J C领导的基因组研究所(The Institute for Genomic Research, TIGR)完成的，结果发表于1995年7月28日的Science，整个基因组有1.8Mb包含1743个基因,啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae） 有上百个实验室的600余位科学家参与仅欧共体国家就有80余个实验室参加。至1996年6月，已全部完成15Mb，l 6条染色体，5885个基因的核基因组序列分析，历时十年。,大肠杆菌：基因组全序列测定于 1997 年由 Wisconsin 大学的 Blattner 等人完成，基因组中87.8的DNA编码蛋白质，0.8%编码RNA，0.7%是非编码的重复序列，约11%左右参与调节和其它功能。在大肠杆菌基因组中共有4288个基因，其中1853个是以前以报道过的基因，还有一大部分是功能未知的基因。大肠杆菌总共有 2584 个操纵子。,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)：2000年，有2条染色体，大染色体由2961146bp组成，小染色体由1072314bp组成,大肠杆菌基因分类,1、原核生物（细菌）基因组结构特点,基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子。,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；,2）遗传信息具有连续性、基因组的重复序列少而短,个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列,3）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝,大肠杆菌总共有2584个操纵子，基因组测序推测出2192个。其中73%只含一个基因、16.6%含有2个基因、4.6%含有3个基因、6%含有4个或4个以上基因。,4）功能相关的结构基因组成操纵子结构；,在原核细胞中，几个功能相近或相关的结构基因经常有序地排列在一起，并被转录在同一个RNA分子上；这种由一个转录控制区和1至多个结构基因组成的一个完整的转录单元称为操纵子,啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae） 有上百个实验室的600余位科学家参与仅欧共体国家就有80余个实验室参加。至1996年6月，已全部完成15Mb，l 6条染色体，5885个基因的核基因组序列分析，历时十年。,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组结构特点,3）重复序列多,1）典型的真核染色体结构；,啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在16条染色体中,2）无明显的操纵子结构,4）有间隔区（即非编码区）和内含子序列,原核生物和真核生物的基因组比较,国家人类基因组南方研究中心国家人类基因组北方研究中心中国科学院基因组信息学中心暨华大基因中心上海国家基因研究中心卫生部致病微生物基因组研究中心深圳华大基因研究院： 2007年10月11日完成第一个完整中国人基因组图谱（“炎黄一号”）,我国的国家级基因组研究基地：,我国已完成多个微生物基因组的测序:痘苗病毒天坛株(预防医学科学院病毒研究所)对虾白斑杆状病毒基因组(国家海洋局第三海洋研究所)志贺氏痢疾杆菌全序列测定(卫生部基因组中心)钩端螺旋体和表皮葡萄球菌、黄单胞菌(国家人类基因组南方研究中心)腾冲嗜热菌 (中国科学院遗传研究所)工业菌株：葡萄糖酸杆菌、青霉菌、维生素 C生产菌株,（三）原核生物的质粒（plasmid）：,1、定义：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子,质粒所含基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞特殊机能，使宿主得到生长优势。,2、结构特点共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子(covalently closed circle，简称CCC) ；个别：线性双链DNA质粒和RNA质粒；大小：1kb-1000kb；（ 细菌质粒多在10kb以内）,3、质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜或琼脂糖凝胶电泳,超速离心后琼脂糖凝胶电泳,质粒所带的某些特点，如抗药性,1）质粒的普遍性,2） 质粒的不亲和性,3）质粒的可消除性,4）质粒的变异性,5）质粒的可传递性,6）质粒的复制及复制调控: 质粒复制受其自身和宿主的双重控制,4、质粒的性质,5、质粒的类型,窄宿主范围质粒,广宿主范围质粒,只能在一种特定的宿主细胞中复制,可以在许多种细菌中复制,宿主范围,复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,严谨型质粒：,松弛型质粒：,复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数,拷贝数,编码的功能和赋予宿主的表型效应：,致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）产细菌素质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（cryptic plasmid）,（1）致育因子(Fertility factor),又称F质粒，F因子，大小约100kb，最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,F+菌株：携带F质粒F-菌株：无F质粒,F因子上面有编码产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,（2）抗性因子（Resistance factor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。89kb抗性转移因子（RTF）：含转移和复制基因；抗性决定因子含抗性基因，成簇地存在于抗性质粒上,抗性基因：汞（mer）、四环素（tet ）、链霉素(Str)、磺胺(Su)、氯霉素(Cm)、夫西地酸（fus）,（3）产细菌素的质粒,编码细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌Col质粒：产生的细菌素为大肠杆菌素（colicins ）,（4）毒性质粒（virulence plasmid）,致病菌：毒性质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,产毒素大肠杆菌：许多菌株含有为一种或多种编码肠毒素的质粒。,苏云金杆菌：编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒,根癌土壤杆菌：Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子,Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体,（5）代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒携带有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,假单胞菌的降解质粒：有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药、辛烷和樟脑等的能力。,根瘤菌属的巨大质粒（megaplasmid): 与共生固氮有关，分子量大2.0-3.0 108,（6）隐秘质粒（cryptic plasmid）,不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，如用凝胶电泳。存在的生物学意义，目前几乎不了解。,改造后可作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）,可移动基因，跳跃基因(jumping gene)位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，可从染色体的一个位点转移到另一个位点，或从两个复制子之间转移，广泛分布于原核和真核细胞中。,（四）转座因子（transposable element）：,原核转坐因子：插入序列（insertion sequence,）、转坐子（transposon,）、某些特殊病毒（如噬菌体）,转坐因子的转坐可引发多种遗传效应：插入突变、染色体畸变、基因的修饰和重排。,特点：1）带有转坐酶基因2）两端各有一段一定长度的末端重复序列3）转坐时，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上,转座子的插入和靶序列正向重复的产生过程。,转座作用,第二节 基因突变和诱变育种,突变,基因突变（点突变）：,野生型（原始性状）,突变型（新性状）,基因突变,突变率： 每一世代中发生某一性状突变的几率,一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何可遗传改变。包括碱基置换和移码突变。,缺失、重复、插入、易位、倒位,染色体畸变：,突变,自发突变,诱 变,环境因素，自身有害代谢产物、DNA复制过程的偶然错误，一般频率较低。,物理、化学因素对DNA直接作用，突变频率高。,1、突变的原因,一、突变的机制和原因,常见的诱变剂：碱基置换： 亚硝酸、羟胺、烷化剂 碱基类似物（如5-溴尿嘧啶等）移码突变：吖啶类染料（吖啶橙、吖啶黄等）染色体畸变：电离辐射（X射线等）、烷化 剂、亚硝酸,2、突变机制,碱基置换引起的突变,移码突变：由于DNA序列中发生1-2个核苷酸的缺失或插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致从改变位置以后的氨基酸序列的完全变化。,同义突变：碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化。,错义突变：碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。,无义突变：某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子（UAA，UAG，UGA）。蛋白质的合成提前终止，产生截短的蛋白质。,举例：5-溴尿嘧啶（BU）引起的碱基置换：通常情况，以酮式结构存在，为胸腺嘧啶类似物，能与A配对，但有时以较低的频率以烯醇式结构存在，就不再与A配对而是与G配对,1）营养缺陷型（auxotroph）： 野生菌株发生基因突变，丧失合成一种或几种生长因子或碱基、氨基酸的能力，不能在基本培养基生长繁殖。,二、常见的突变类型,用hisC-和hisC+，分别表示组氨酸缺陷型和野生型。,2）抗性突变型：野生型菌株发生基因突变，产生对某种化学药物或致死物理因子的抗性变异， strR,3）条件致死突变型：菌株发生基因突变后，在某种条件下正常生长、繁殖而在另一条件下无法生长繁殖。,4）其它突变类型：形态突变型、抗原突变、毒力突变、产量突变,7、可逆性：突变的菌株可发生回复突变,三、基因突变的特点,1、自发性:自发的产生,2、不对应性：突变性状与突变的原因间无对应关系,3、稀有性：10-6-10-9,5、可诱变性：诱变剂可增加突变,6、稳定性：突变的新性状可稳定遗传,4、独立性：某一基因突变与其他基因无关,四、基因突变自发性和不对应性的实验证明,变量实验涂布实验影印实验,野生型（原始性状）,突变型（适应环境的新性状）,突变的原因,？,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,涂布实验：Newcombe（1949）,突变原因与性状相关,影印实验：Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,五、紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,紫外线对DNA的损伤,DNA损伤的修复作用1）光复活作用,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,2）切除修复,（一）自发突变与育种： 生产中选育 ：正变株 定向培育：卡介苗,六、突变与育种,（二）诱变育种,1、诱变育种的基本环节,2、诱变育种的原则（P214）,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线激光离子束X射线r射线快中子,烷化剂碱基类似物吖啶化合物,3、Ames试验： 利用细菌营养缺陷型的回复突变检测化学致癌物。,回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变,化学药剂的三致作用：致突变、致畸变、致癌变,原理：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)在基本培养基的平板上不能生长，如化学致癌物诱变后发生回复突变，成为原养型(his+)后则能生长。,应 用：食品、饮料、药物、饮水、环境试样中的致癌物,4、突变株的筛选（P220-223）：（1）营养缺陷型突变株的筛选,三类培养基：基本培养基-、完全培养基+、补充培养基A或B,三类遗传型： 诱变 回变或重组野生型 营养缺陷型原养型 A+B+ A-B+或A+B- A+B+,突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,影印平板法夹层培养法限量补充培养法逐个检出法,生长谱法,2. 抗药性突变株的筛选（P218-220）-自学 3. 产量突变株（P218-219）-自学,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的四种基因重组形式:,转化(transformation)：,转导(transduction)：,原生质体融合（protoplast fusion）,基因重组（gene recombination）：两个独立基因组内的遗传基因通过一定的途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的稳定基因组的过程.,接合(conjugation):,（一）、转化(transformation),定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。通过转化形成的杂种后代称转化子.,2、自然转化的条件：,1) 建立了感受态的受体细胞,2) 外源游离DNA分子（转化因子）,感受态（competent）：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。,涉及细菌染色体上几十个基因的功能及彼此间的相互协调。感受态因子、细胞壁自溶素、 DNA结合蛋白、核酸酶.,1）感受态的出现2） DNA的结合与进入3） DNA 的整合,肺炎链球菌（S. pneumoniae）转化过程,3、人工感受态和转化,CaCl2处理PEG 处理电穿孔：高压脉冲电流激破细胞膜基因枪：人为地使其处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,难进入自然感受态的细菌：大肠杆菌等,用提纯的病毒核酸感染宿主细胞或其原生质体，并产生正常病毒后代的现象。,5、转染(transfection)：,转染的是病毒核酸，不作为供体基因；产生完整的病毒颗粒。被感染的宿主不能形成转化子；,特点：,真核生物中：外源DNA 导入到真核细胞的过程也叫转染,（二）、转导(transduction)：,以缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,转导噬菌体: 温和噬菌体或烈性噬菌体,1、普遍性转导,通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。一般以温和噬菌体为媒介,普遍性转导的三种后果：,a）进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子(普遍转导子）,b)流产转导,转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,c)外源DNA被降解，转导失败。,2、局限性转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合重组、形成转导子的现象,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化,噬菌体脱离宿主染色体的过程中，位于前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,温和噬菌体脱离宿主的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性的能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,低频转导高频转导,E.coliK12gal-/ dgal+/ （双重容源菌供体）(50%) + dgal+（50%）E.coliK12gal-(受体菌) E.coliK12gal-/ dgal+（转导子）,（双重容源转导子）,高频转导和低频转导图解,低频转导,高频转导,U.V.,U.V.,局限性转导与普遍性转导的主要区别：,a）被转导的基因与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起复制、包装以及被导入受体细胞中；而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段（一般位于噬菌体整合位点两侧），并将固定的个别基因导入受体；而普遍性转导可携带宿主的任何基因，具有随机性。,C）特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带，需要紫外线等因素诱导溶源菌。,3、溶源转变与转导的不同,a）不携带任何供体菌的基因；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,噬菌体基因组整合到宿主细胞的基因组上，并随后者的复制而进行同步复制，引起宿主菌除免疫性外的其他的表形改变，包括细胞表面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变,感染复数(MOI :multiplicity of infection):噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量,（三）、接合(conjugation),1.概念 供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的核基因组片段传递给后者，使其获得若干新遗传性状的现象。,实验证据,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组。,Bio-Phe - Cye - Thr-+ Leu + Thi +,Bio + Phe + Cye + Thr- - Leu - Thi -,Bio + Phe + Cye + Thr- + Leu + Thi +,转移区(tra region) :长度33kb,由23个基因组成，构成一个tra操纵子，编码与性菌毛形成及转移有关基因转移起始区为oriT,是杂交时转移开始的位点,复制区（rep region): 负责F质粒的自我复制， oriS为复制起始点，inc 不相容基因，rep复制相关基因 。,插入区（insert region): 含有四个插入序列，与F质粒的整合、切除、移位有关,3、大肠杆菌的四种接合型菌株,1）F-菌株： 不含F因子，没有性菌毛，可通过 接合作用接收 F因子成为F+,2） F+菌株： “雄”性菌株， 细胞含一至几个F因子，细胞表面有性菌毛。,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞,F+菌株的F因子以滚环模型向F-细胞转移，F +细胞的染色体DNA一般不被转移。,大肠杆菌的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。细胞表面有性菌毛。,3）Hfr菌株（high frequency recombination strain ,高频重组菌株）:,F质粒上决定性别的基因位于线状DNA的末端，能进入F-细胞的机会极少，故HfrF-杂交后，F-转变为F+的频率极低，即受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-，而其它遗传性状的重组频率却很高。,供体菌整段染色体通过性菌毛转移致F-细胞，约需100min。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,中断杂交（interrupted mating）技术,利用HfrF-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。,供体菌HFr：受体菌F一（营养缺陷型或抗生素抗性如thr-、leu、lac、gal、strr）,4）F菌株： Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子，含F因子的菌株，称F菌株。 细胞表面同样有性菌毛。,F与F-的接合过程中给体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞,a）与受体细胞染色体发生重组,b）继续存在于F因子上， 形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导、F因子转导，或F因子媒介的转导。,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。重组率高,（四）原生质体融合（protoplast fusion）(p232),主要步骤：1）原生质体制备2）原生质体融合3）原生质体再生4）融合子选择,理论和实践意义：1）一种更广泛、更随机的基因重组方式（无供体和受体之分，不需更多的附加条件）2）实现远缘菌株间的基因重组：种、属间或更远3）遗传物质的传递更完整4）集合多种优良性状5）大大提高遗传重组频率（10-3-10-1）6）加速育种工作进度7）有可能采用产量性状较高的菌株做为融合亲本,有性杂交 转化 原生质体融合 准性杂交,二、真核微生物的基因重组(p233),准性生殖：同种不同菌株的体细胞间发生的融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。半知菌类,准性生殖过程：1）菌丝联结2）形成异核体3）核配4）体细胞交换和单倍体化,形成单倍体杂合子,基因工程：指用人为的方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。,第四节、基因工程（自学）,微生物学与基因工程的关系：1）基因工程所用克隆载体主要是用质粒、病毒、噬菌体改造而成2）基因工程所用工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；3）将外源DNA导入宿主细胞的人工转化方法，是在微生物自然转化现象的基础上发展起来的4）微生物细胞是基因克隆的重要宿主，5）微生物是基因产物的重要表达载体6）基因工程得以建立与发展的理论基础主要来自对微生物 的研究7）微生物的多样性，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源,第五节 菌种保藏,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异,b）污染,c）死亡,一、菌种的衰退与复壮（P240）,菌种衰退（degeneration)： 大量群体中的自发突变,使生物学性状发生改变,1）原有形态改变；2）生长速度变慢，产生孢子变少3）代谢产物产生能力降低4）致病力降低5）对外界不良环境抵抗力降低,防止衰退的措施：（P241）,1）减少传代次数；,2）创造良好的培养条件；,3）利用不易衰退的细胞传代；,4）采用有效的菌种保藏方法；,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种。,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,菌种的复壮：,a）纯种分离；,b）通过寄主体进行复壮；,三、菌种保藏,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,基本要求：,基本方法：,生活态休眠态,原理:人为地创造合适的环境条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。低温、干燥、缺氧。,5冷冻干燥保藏法：10年以上；其它方法：液氮保藏法：,常用的保藏方法：,1斜面保藏法 ：不宜长时间保藏菌种（约1-6月）,2液体石蜡覆盖保藏法（半固体）：主要适用于霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等的保存 ，1至几年，甚至10年。,3载体保藏法（沙土保藏法）：含孢子的微生物保藏，时间较长（1-10年）,4甘油悬液保藏法（15-50%的甘油，-70冰箱 ），用于细菌、酵母菌的保存，可保存10年。,一些菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）中国典型培养物保藏中心（CCTCC）美国典型菌种保藏中心（ATCC）美国北部地区研究实验室（NRRL）荷兰霉菌中心保藏所（CBS）英国国家菌种保藏所（NCTC）全苏微生物保藏所（UCM）日本大阪发酵研究所（IFO）,思考题：,1.遗传变异的物质基础是什么？证明的著名实验有几个？2. 细菌质粒有哪些常见的类型？ 3.何谓基因突变？有哪几个共同特点？从表型分可分为哪几类？ 4.原核微生物与真核微生物各有哪些基因重组形式？5.试述菌种保藏的原理及常用保藏方法。6.何谓营养缺陷型？试用表解法概括一下营养缺陷型筛选的主要步骤和方法,