CN1 植物蛋白质组讲议（第一章）课件.ppt
植物蛋白质组学,崔娜 沈阳农业大学生物科学技术学院,第一章 导论第二章 蛋白质提取与样品制备第三章 双向凝胶电泳第四章 电泳图谱的图像分析第五章 生物质谱技术与蛋白质鉴定第六章 蛋白质组研究中的定量方法第七章 蛋白质相互作用和蛋白质芯片第八章 蛋白质组技术在植物科学中的应用,目 录,第一章 导论,第一节 蛋白质组学研究的历史和背景,基因研究是20世纪生命科学的主线。,20 世纪的上半叶，以遗传学为代表，生命科学通过对基因分离、独立配对、连锁及化学属性等的研究，最后以作为遗传信息载体的 DNA 双螺旋结构的提出而告捷。,Chromosome 染色体Karyotype 染色体组型,20 世纪下半叶，以分子生物学为代表，生命科学通过对基因复制、转录、翻译及遗传密码的分析与破译，最终以统一生命世界各层次、生命科学各分支的“中心法则”的问世而集成。,基因（gene）是1909年丹麦生物学家W.Johannsen根据希腊文“给予生命”之意创造的。一个基因就是能够编码一个蛋白质分子的一个DNA或一个RNA片段.,基因表达中的信息流,中心法则（The Central Dogma）,可与产生原子弹的曼哈顿工程和人类登月阿波罗飞行任务相媲美，是当前国际生物学、医学领域内一项引人注目的工程，是人类自然科学史上最重大的研究项目之一，将推动整个生命科学的发展。,人类基因组计划,人类基因组计划20世纪的三大科技工程之一后基因组时代（post genome era）的到来蛋白质组学是功能基因组学的核心内容,人类基因组计划的启动,1985年，美国能源部提出，要将共包含约3109碱基对的人类基因组全部碱基序列分析清楚；1986年，美国宣布启动“人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）”。1990年开始对人类46条染色体5-10万个基因作图和30亿碱基的DNA全序列的测序。1994年人基因组全套遗传连锁图发表。1995年全基因组覆盖率达95%。,人类基因组计划的发展,1999年12月1日，首条人类染色体完成测序，人类第22号染色体DNA全序列测定宣布完成。2000年4月6日，美国Celera遗传信息公司宣布，该公司已破译出一名实验者的完整遗传密码。2000年5月，科学家聚集美国冷泉港，宣布人类基因组草图(工作框架图)的完成。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。,二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成,六国科学家组成的国家人类基因组中心主要研究比例,美国：WASHMIT等7家研究中心，贡献率为54。英国：SANGER一家研究中心，贡献率为33。日本：RIKEN等两家研究中心，贡献率为7。法国：GENOSCOPE研究中心，贡献率为2.8。德国：IMB等3家研究中心，贡献率为2.2。中国：北京华大研究中心、国家南北方基因研究 中心等三家，贡献率为1。,首个中国人基因组图谱绘制完成, 2007年10月11日宣布成功绘制完成第一个完整中国人基因组图谱(又称“炎黄一号”)，这也是第一个亚洲人全基因序列图谱。 该项目由来自深圳华大基因研究院、生物信息系统国家工程研究中心及中国科学院北京基因研究所的科学家共同发起并承担。 这项在基因组科学领域里程碑式的科学成果，对于中国乃至亚洲人的DNA、隐形疾病基因、流行病预测等领域的研究具有重要作用。,人类基因组包括分布于人46条染色体的30,00035,000个基因。人类基因组计划最终目的是测定基因组的全部序列，弄清整个基因组的结构、功能及其表达产物，彻底了解人类生命活动本质。,人类基因组计划的具体任务可以概括为建立四张图谱,遗传图谱物理图谱 序列图谱转录图谱,遗传图谱（genetic map）又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。,遗传图谱,物理图谱,物理图谱（physical map）是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。,序列图谱,随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱.,大规模基因组测序,Megabace 测序仪,3700 测序仪, 晚疫病病菌会损害马铃薯的叶子和根茎，它在世纪导致爱尔兰大面积马铃薯绝收，约有万人因此死亡，还有数百万人因这一病虫害移居海外。据估算，这一病菌目前仍给全球农业造成每年约亿美元的损失。 一个国际科研小组(美英等多国研究人员)2009年9月日发布报告说，他们完成了对马铃薯晚疫病病菌的基因测序。 马铃薯晚疫病病菌基因测序结果显示，与同类生物相比，该病菌有大得出奇的基因图谱，其中都是由重复出现的“转位子”(Transposon)组成。这是一个“疯狂”的比例，通常微生物基因图谱中有的“转位子”就已经很多了。“转位子”是具有特定功能的基因片段，它可以自我复制并在基因序列中四处移动，晚疫病病菌正是靠这些“转位子”的作用侵害马铃薯。晚疫病病菌基因如此演化是为了保持一个庞大的“武器库”，便于迅速适应环境变化。 一名马铃薯育种专家在评论上述成果时说，有时“好不容易费年时间培育出一种有抵抗力的新品种，晚疫病病菌却只用几年就把它打败”，现在掌握了该病菌的基因图谱和“武器库”特点，将有助于研发能有效对付它的基因手段。,高等真核生物的开放阅读框架的确定；现有基因的识别技术只适用于原核生物或低等真核生物生物基因组只能表达部分基因，而且表达的基因类型和程度随生物生存环境及内在状态有极大的差异基因组计划无法告诉哪些基因在何时何地以何种程度表达mRNA本身存在着贮存、运转、降解、翻译调控及产物的翻译后的修饰加工。调控蛋白的化学修饰不仅改变了蛋白的立体结构还改变了蛋白功能调节的功能基础，基因编码测序无法预测基因是遗传信息的源头，而功能蛋白是基因功能的执行体,基因组计划的局限性,蛋白质是细胞赖以生存的各种代谢和调控功能的主要执行体蛋白质是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子蛋白质是大多数药物的靶标及至直接的药靶药靶是形成制药业的发展源头20世90年代中期 寻找治疗人类疾病新药的药靶共约483种，它们主要是蛋白质全世界使用的2000多种药物，其中85%是针对此483种药靶根据目前人类100-150种疾病，应有3000-15000种蛋白质具有靶标的可能。,蛋白质组学是功能基因组学的核心内容,蛋白质：药物设计的钥匙,近年来新型功能蛋白的不断发现，为人类征服癌症、艾滋病、帕金森氏症、老年痴呆症、糖尿病等开辟了光明前景。 日本国立癌症中心：乳铁蛋白具有预防大肠癌发生与 扩散的作用，计划从牛奶中提取它并制成抗癌药物。 上海药物所等单位：完成SARS病毒的3个关键蛋白的表 达，并进行了初步的验证。其中一种蛋白已用于 抗SARS病毒药物的体外筛选。 ,OFarrel PH与1975年发现了二维电泳技术蛋白质图象分析系统与软件以及大规模样品处理系统开发技术80年代出现的Hillenkamp发明的激光解吸质谱 ，Fenn设计的电喷雾质谱建立了肽质量指纹图谱与肽序列标签等,蛋白质研究方法的突破,第二节 蛋白质组学的概念、技术路线及国内外现状一、概念 PROTEOME：PROTEin与genOME的杂合 蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它是功能基因组学的“中流砥柱” ，是联系基因组序列与细胞功能的重要学科。 Proteome包括了一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。 一门交叉学科 物理学 数学 化学 计算机科学 生物信息学,二、蛋白质组研究的相关技术与技术路线 双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术和质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。 图象分析系统，如PDQUEST 、Image Master等 蛋白质鉴定方法：氨基酸组成分析、序列测定、肽质量指纹图（PMF）、相对分子量 高通量系统（HTS）与大规模样品处理机器人 数据库设置与检索系统 新型质谱技术，如MALDI-TOF MS，ESI/MS/MS,蛋白组研究的三个主要步骤： Separation of individual proteins by 2-D polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE)Identification by mass spectrometry or N-terminal sequencing of individual proteins recovered from the gelStorage, manipulation, and comparison of the data using bioinformatics,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,Gel Staining,First Dimension IEF,Second Dimension SDS-PAGE,Imaging and Analysis,Spot Excision,Sample Preparation,Proteomics Experimental Workflow,五、国内外现状(一) 国外研究现状1. 研究机构的快速形成澳大利亚(1997)1.Center for Protome Research and Gene Product Mapping proteome,National Inovation Centre2.Australia Proteome Analysis Facility3.1997年澳大利亚建立蛋白质组研究中心(APAF)美国（1997）Proemem,Inc.Beverly,MA Large Scale Biology Corp,Rockvile,MD美国国立肿瘤研究所投入1000多万美元研究直肠乳腺卵巢等肿瘤的蛋白质数据库美国肿瘤研究所药物管理局联合投入数百万美元开展不同发病阶段和治疗阶段的肿瘤蛋白质组数据库美国能源部最近启动了环境和能源相关的微生物和低等生物的蛋白质组研究美国Celera投资上亿美元于此研究,.欧洲欧共体资助了酵母菌蛋白质组研究英国资助了三个研究中心,对基因组测序已完成或即将完成的生物进行蛋白质组研究.法国资助了5个区域性遗传基地,每年获500万美元,主要用于基因组与蛋白质组研究.德国联邦研究部提供700多万美元在东德建立了蛋白质组研究中心日内瓦蛋白质组公司和布鲁克质谱仪制造公司成立了国际上最大的蛋白质组研究中心.丹麦（1997）Centre for Proteome Analysis in Life Sciences,以50%速度递增1995年第一篇蛋白质组论文发表在electrophoresis,论文数激增,2. 研究材料与范围扩大研究材料从支原体Mycoplasma genitalium 真核生物酵母 人体原核生物真核生物单细胞生物多细胞生物组织无需基因计划完成的生物也可研究范围蛋白质组作图、蛋白质成分鉴定、蛋白质数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体（isoform）比较,3. 研究进展加快(1)在研究细胞增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方面进行了探索。鉴定了肿瘤相关蛋白,为肿瘤早期诊断提供了主要依据.(2)酵母双杂交技术已被用于研究蛋白质群连锁群和蛋白质功能网络.,(二)国内蛋白质组学研究现状 1997年国家自然科学基金委设立了重大项目，蛋白质组学技术体系建立 中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院与湖南师范大学启动蛋白质组学研究 中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了蛋白质组学研究中心 技术平台建设达到国际先进水平 重大疾病蛋白质组学发现了一批与肿瘤转移相关的蛋白质群,清华大学结构生物学实验室(蛋白质结构分析数据计算),中国军事医学科学院-蛋白质组研究中心,蛋白质组工作站,中国军事医学科学院-蛋白质组研究中心,蛋白质纯化,质谱仪,北京华大蛋白质研究中心有限公司,存在的问题(1)在植物蛋白质组学研究方面明显滞后 国内各大学和研究机构刚起步开展蛋白质组学研究,但限于设备条件和经费,研究进展与国际前沿有相当距离.(2)专门人才相当匮乏 国内从事基因组研究人才较多,但掌握蛋白质组学的专才相对较少.(3)需要建设大型技术平台,组织团队联合攻关. 通过建设平台可减少设备的重复投入.,第三节 蛋白质组学的特点与难点,一、同一性与多样性 基因组作为遗传信息的载体，其主要特征就是同一性。 蛋白质是生命活动的主要执行者，对于不同类型的细胞或同一细胞在不同的活动状态下，蛋白质的构成是不一样的。 一个基因组内的基因数目通常是指ORF（可读框）的数目，蛋白质组是一个基因组所表达的全部蛋白质，确定了一个蛋白质就肯定了一个基因，但确定了一个OFR却并不能肯定它会有对应的蛋白质产物。但由于存在mRNA编辑和蛋白质剪切，许多蛋白质很难找到直接对应的ORF。,二、有限与无限 对于基因组研究而言，核心任务是测定所有DNA碱基序列。要测定的基因组不论大小，其核苷酸的数量是明确的。 细胞内的大部分蛋白质通常都被进行过翻译后修饰，修饰过的蛋白质具有特定的理化性质和生物学功能。从而蛋白质组的蛋白质数量将远远大于相应的基因组的基因数量。,三、静态与动态 一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。 作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活动中总是变动不停。 功能蛋白质组学以研究蛋白质变化为主，主要是比较在不同生长状态下或病理情况下的同一种细胞或组织的蛋白质组内的差异蛋白。四、时间与空间 DNA通常位于细胞核内，且保持稳定，因此测定基因组DNA序列是不受时空的影响。 不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里运动发挥作用。,五、孤立行为与相互作用 基因组的基因表达的各种mRNA是彼此孤立的、互不干扰。 蛋白质组研究的一个主要内容是研究大规模的蛋白质的相互作用。相互作用组研究可分为两类：一类是研究蛋白质相互作用的网络，手段主要有大规模双杂交方法、噬菌体显示技术和蛋白质芯片技术；另一类研究是蛋白质复合体组成的分析。六、单一手段与多种技术 在基因组研究中，DNA测序技术是一个最基本和最主要的工具。 蛋白质组技术可分为两类。第一类是蛋白质组的分离技术，如双向电泳技术、细胞分级分离技术、亲和层析技术等。第二类是蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。蛋白质芯片技术、大规模双杂交方法和噬菌体显示技术也属于鉴定技术。,蛋白质和核酸大分子之间的相互作用,七、互补与互助 蛋白质组研究与基因组研究形影相随、互相补充、互相帮助。蛋白质组学可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能. 上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究了细胞的分子架构，又都在各自的水平上提供了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强的且带有系统性相互关系。,第四节 蛋白质组学发展方向和趋势,一、蛋白质组研究的发展方向1.在方法学上要提高二维电泳的通量灵敏度和规模化，尤其对低丰度蛋白需要建设色谱/电泳-质谱为主体的技术。酵母双杂交已用于蛋白质连锁群建立，但缺少快速高效获取复杂蛋白质互作的多维信息。针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织/细胞,建立其蛋白质组或亚蛋白质组(或蛋白质组表达谱)及蛋白质连锁群(compositional proteomics)研究。2.在高等哺乳动物、植物细胞的蛋白质组全谱还未起步。3.对动植物生物体、或组织/细胞开展全方位蛋白质组互作网络研究需要加强。4.加强对动植物生命过程重大病害为对象,进行重要生理/病理体系或过程的比较蛋白质组学(comparative proteomics)研究。,二、发展趋势（一）在研究策略上 1.竭泽法 采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。 2.功能法 研究不同时期细胞蛋白质组成的变化。（二）在研究范围上 1.蛋白质的表达模式 2.蛋白质翻译后修饰研究 3.蛋白质-蛋白质相互作用 4.蛋白质高级结构的解析（三）在研究对象上 覆盖 原核微生物、真核微生物、植物和动物；涉及各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。（四）在应用研究方面 以重要生命过程原生或人类重大疾病为对象;进行重要生理/病理体系或过程的比较蛋白质组学研究。（五）在技术发展方面 多种技术并存、各有优势和局限。,
