农药残留的检测ppt课件.ppt

农药残留的测定,2022年11月24日,农药污染的危害、现状,我国是农业大国,为确保农业丰收,每年约有21 万t 近400 种农药加工成1 000 多种剂型施于农作物。国家农业部对农药的安全使用做出了明确规定,并以农药安全使用标准、农药合理使用准则的法规颁布,但由于没有强有力的法律和执法机构监督,这些准则难以有效施行。,农药污染的危害、现状,近年来食品特别是蔬菜、水果中农药污染造成急性中毒事件屡见报导,但农药对人体的慢性危害产生的生理变化常常因没有明显症状容易被忽视。一些农药品种具有累积毒性(如六六六、DDT) ,甚至产生致癌、致畸、致突变三致毒性(如除草醚和杀虫胖) 。由于历史、经济和技术的原因,目前我国高毒农药产量占相当大的比例,残留农药的危害,农药一方面可以有效控制或消灭农业、林业的病、虫及杂草的危害，提高农产品的产量和质量，同时也造成了食品农药残留，对人类健康产生危害。农药残留是目前影响我国食品和农产品安全的主要因素，已经给我国农产品销售、出口和消费者的身体健康带来了严重影响。,一.主要农药,有机氯杀虫剂有机磷杀虫剂拟除虫菊杀虫剂氨基甲酸酯杀虫剂,有机氯杀虫剂,剧毒高度的化学、物理和生物学的稳定性半衰期长、脂溶性强极难分解。,特点,表现侵害肝、肾及神经系统有致畸、致癌作用。,1、六六六(benzene hexachloride),名 称：BHC分子量：288,中文名：滴滴涕别 名：二二三分子量：352,2,2-bis(4-Chlorophenyl)-1,1,1-trichloroethane,2、DDT,本节首页,退出本章,3、狄氏剂,名 称：Dieldrin别 名：HEOD分子量：378,C12-H8-Cl6-O,4、乙酯杀螨醇,名 称：Chlorobenzilate别 名：Akarl分子量：324,名 称：Chlorpyrifos（有机磷、氯农药）别 名：Dursban 分子量：349,5、毒死碑,有机磷农药,理化特性1、性质不稳定：敌百虫敌敌畏2、极性：低（辛硫磷）石油醚 高（甲胺磷）丙酮3、胆碱酯酶的抑制力：,名 称：Methamidophos别 名：多灭灵、杀螨隆、克螨隆分子量：141,1、甲胺磷,名 称：Acephate别 名：高灭磷分子量：183,2、乙酰甲胺磷,名 称：Diazinon别 名：地亚农、二嗪磷分子量：304,3、二嗪农,名 称：Dimethoate别 名：乐戈、Rogor分子量：229,4、乐 果,学名：0,0二甲基（2,2,2三氯1羟基乙基）磷酸脂（Trichlorfo）分子量：256,5、敌百虫,名 称：Paration别 名：对硫磷分子量：291,6、一六0五,名 称：Chlorpyrifos分子量：349分子式：,7、毒死蜱,拟除虫菊农药,一、概 述,除虫菊,名 称：Cypermethrine别 名：Agrothrin分子量：415,1、氟氯氰酯,名 称：Dichlofluanid别 名：Recamethrin分子量：503,2、溴氰菊酯,名 称：Flucythrinate别 名：Pay-off分子量：451,3、氟氰戊菊酯,名 称：Fenvalerate 别 名：氰戊菊酯分子量：419,4、杀灭菊酯,氨基甲酸酯农药,氨基甲酸酯类农药基本结构式：N-/（N-N二）甲基氨基甲酸酯类,名 称：Aldicarb别 名：Temik分子量：190,1、涕灭威,名 称：Carbaryl别 名：胺甲萘分子量：201,2、西维因,名 称：Carbofuran别 名：呋喃丹分子量：221,3、虫螨威,名称：Isoprocarb别 名：叶蝉散k分子量：193,4、异丙威,二. 食品中农药残留分析的样品预处理方法,预处理：提取与净化,提取：是将样品中的农药溶解分离出来的操作步骤,根据农药的性质、样品种类、实验条件,可选用的常规提取方法有浸渍振荡法、索氏抽提法和超声波提取法。净化：由于某些样品组成复杂,提取后往往还需经过净化步骤以达到待测物与干扰杂质分离,净化的基本原理主要为液液作用、液固作用、液气作用及化学反应。柱层析法是最常用的净化方法之一,层析柱填料一般为弗里罗硅土、氧化铝以及活性碳。,液-液分配法,二甲基甲酰胺脂肪用低温冷冻法,柱层析法,弗罗里硅土无水硫酸钠正己烷（二氯甲烷）,新型的样品前处理方法,超声波(Ultrasonic Extraction , USE) 固相萃取(Solid Phase Extraction , SPE) 超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction , SFE) 基质固相分散萃取(Matrix Solid Phase Dispersion Ext raction , MSPDE) 加速溶剂萃取(Accelerated Solvent Extraction , ASE) 凝胶渗透色谱( Gel Permeation Chromatography ,GPC) 等。,超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction，SFE),是一种以超临界流体作为流动相的分离技术。超临界流体是指物质高于其临界点，即高于其临界温度和临界压力时的一种物态。它既不是液体，也不是气体，但它具有液体的高密度，气体的低粘度，以及介入气液态之间的扩散系数的特征。一方面超临界流体的密度通常比气体密度高两个数量级，因此具有较高的溶解能力；另一方面，它表面张力几近为零，因此具有较高的扩散性能，可以和样品充分的混合、接触，最大限度的发挥其溶解能力。在萃取分离过程中，溶解样品在气相和液相之间经过连续的多次的分配交换，从而达到分离的目的。,CO2超临界流体萃取,现今，CO2是应用最多的流动相，一方面这是由于它的超临界条件比较温和，柱温40-50。C已超过超临界温度，在适当压力下即可达到高密度；另一方面它又有成本低、无毒、不燃烧、容易纯化、腐蚀性小、化学惰性等诸多优点。 它具有清洁环保、萃取成本低、实验条 件容 易实现等诸多特点，目前已在天然植物、环保、食 品、高 分子材料等领域有着广泛的应用。,超临界(CO2)流体萃取仪,由于食品组成成分复杂,农药残留水平较低,一般在mg/ kgg/ kg ,因此要求灵敏度高、特异性强的提取及分析方法。超临界流体具有特殊的溶解性，特别适合于微量成分的提取分离。,超临界流体萃取的应用,邱明月1 等用超临界流体萃取和气相色谱联用( SFE2GC) 测定粮谷和茶叶中17 种有机氯农药的残留量,并与传统方法进行了比较,认为超临界流体萃取技术是一种快速高效的方法。李新社2 用超临界二氧化碳流体萃取蔬菜中的残留农药,萃取效率较高,而且不影响样本分析的准确性。王建华等 3 建立了用超临界流体萃取、气相色谱测定韭菜中百菌清、艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂残留量的方法,取得了令人满意的效果。应用超临界流体测定其它蔬菜、水果中有机农药残留量也有较多的报道。参考文献：1 邱明月,温可可,刘生明,等. 超临界流体萃取气相色谱法测定粮谷中拟除虫菊酯残留量J . 分析化学,1994 ,22 (11) :1072-1101 2 李新社. 超临界流体萃取蔬菜中的残留农药 J . 食品科学,2003 ,24 (6) :242-251 3 王建华,徐强,焦奎. 蔬菜中有机氯农药残留的超临界流体提取和气相色谱法测定J . 色谱,1998 ,16 (6) :506-507,压力溶剂提取 Pressrizedsolventextraction, PSE),压力溶剂提取又称快速溶剂提取，是近年来发展起来的一种用于分析前样品预制备技术。和传统的萃取方式如索氏提取、超声波提取相比，该方法速度快、萃取用溶剂少，重现性好且萃取效果等于或优于传统的提取方式。 该技术通过提高压力增加溶剂的沸点，从而提高物质在溶剂中的溶解度；用来代替索氏提取、微波提取等传统的样品预制备技术，主要用于从固体和半固体样品中提取所需成份.此外，此项技术还被广泛的应用于天然植物、食品、药物等各个领域。 例如：当前，脂肪提取技术发展较为迅速，压力溶剂提取技术就是其中最有代表性的新技术之一。,加速溶剂萃取Accelerated solvent extraction (ASE),原理：在提高的温度下萃取 提高温度使溶剂溶解待测物的容量增加。 在提高的温度下能极大地减弱由范德华力、氢键、溶质分子和样品基体活性位置的偶极吸引力所引起的溶质与基体之间的强的相互作用力。加速了溶质分子的解析动力学过程,减小解析过程所需的活化能,降低溶剂的粘度,因而减小溶剂进入样品基体的阻滞,增加了溶剂进入样品基体的扩散。在加压下萃取 液体的沸点一般随压力的升高而提高。 液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力。因此欲在提 高的温度下仍保持溶剂在液态,则需增加压力。,加速溶剂萃取仪,一次何以放置12-24个萃取池。1，5，11，22，33，66，99ml各类规格萃取池可选。美国EPA3545标准方法。适合于环境样品，食品，炸药等固体/半固体的农药残留等的分析。 ASE加速溶剂萃取仪,在15分钟内使 用15ml溶剂完成萃取.,加速溶剂萃取的突出优点,与索氏提取、超声、微波、超临界和经典的分液漏斗振摇等公认的成熟方法相比,加速溶剂萃取的突出优点如下: 有机溶剂用量少,10g 样品一般仅需15mL溶剂; 快速,完成一次萃取全过程的时间一般仅需15min ; 基体影响小,对不同基体可用相同的萃取条件; 萃取效率高,选择性好,已进入美国EPA 标准方法,标准方法编号3545 ; 现已成熟的用溶剂萃取的方法都可用加速溶剂萃取法做,且使用方便、安全性好,自动化程度高。,液相微萃取技术Liquid Phase Microextraction, LPME,是一种快速、精确、灵敏度高、环境友好的样品前处理技术。 从广义上讲，该技术主要包括以下两个方面： 基于悬挂液滴的SDME（Suspended/Single Drop Microextraction）形式的微滴液相微萃取； 基于中空纤维的两相模式或三相模式的液-液微萃取或液-液-液微萃取。 由于该方法具有操作简便、快捷、成本低廉、易与色谱系统联用等优点。近来年，作为一种新型的样品前处理技术，已经引起了环境分析领域的许多研究人员的注意。,液相微萃取示意图,离子液体-液相微萃取技术,室温离子液体（Room temperature ionic liquids） 常被简称为离子液体，是指在室温或室温附近温度下呈液态的仅由离子组成的物质，组成离子液体的阳离子一般为有机阳离子（如烷基咪唑阳离子、烷基吡啶阳离子、烷基季铵离子、烷基季鏻离子等），阴离子可为无机阴离子或有机阴离子（如PF6-、BF4-、AlCl4-、CF3SO3-等）。 自1914年发现第一个离子液体硝基乙胺以来，特别是在20世纪80年代中期至今的这段时间，离子液体在许多领域的研究都呈现出非常活跃的态势，这与离子液体自身的特点是分不开的。,离子液体的优点,较传统的液态物质相比，离子液体具有以下几个无与伦比的优势：几乎没有蒸气压，不易挥发，从而在使用过程中不会给环境造成很大压力；具有较大的稳定温度范围（-100-200C），较好的化学稳定性及较宽的电化学稳定电位窗口；通过阴阳离子的设计可调节其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性，并且其酸度可调至超酸性，因此可通过一定的阴阳离子的组合设计构筑“需求特定”或“量体裁衣”的离子液体。,固相萃取Solid Phase Ext raction , SPE,固相萃取：是 近年发展起来一种样品预处理技术, 由液固萃取和柱液相色谱技术结合发展而来 , 主要用于样品的分离、纯化和浓缩。广泛的应用在医药、食品、环保、商检、农药残留等领域。,固相萃取原理,表述1：固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于样品母液，当样品通过固相萃取柱时，分析物被吸附在固体表面，其他组分则随样品母液通过柱子，最后用适当的溶剂将分析物脱下来。表述2：固相萃取是一种基于液相色谱分离机制的样品前处理方法。是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品中的基体和干扰化合物分离，然后用洗脱液洗脱，从而达到分离与净化目标化合物的目的。,固相萃取仪,固相萃取仪,SPE装置由SPE小柱和辅件构成。SPE小柱：由三部分组成，柱管、烧结垫和填料。SPE辅件：一般有真空系统、真空泵、吹干装置、惰性气源、大容量采样器和缓冲瓶。,SPE 操作步骤,I. 柱的预处理为了获得高的回收率和良好的重现性，固相萃取柱在使用之前必须用适当的溶剂进行预处理，预处理除去填料中可能存在的杂质，另一个目的是使填料溶剂化，提高固相萃取的重现性 。II. 样品的添加预处理后，试样溶液被加至并以一定的流速通过柱子。在该步骤分析物被保留在吸附剂上。,SPE 操作步骤,III. 柱的洗涤在样品通过萃取柱时，不仅分析物被吸附在柱子上，一些杂质也同时被吸附，选择适当的溶剂，将干扰组分洗脱下来，同时保持分析物仍留在柱上。IV. 分析物的洗脱用洗脱剂将分析物洗脱在收集管中，为了提高分析物的浓度或为以后分析调整溶剂杂质，可以把收集到的分析物溶液用氮气吹干，再溶于小体积适当的溶剂中。,SPE 的分离模式,SPE建立在传统的液-液萃取（LLE）基础之上，结合物质相互作用的相似相溶机理和目前广泛应用的HPLC、GC中的固定相基本知识逐渐发展起来的。SPE根据其相似相溶机理可分为四种： 反相SPE (吸附剂极性小于洗脱液极性) 正相SPE (吸附剂极性大于洗脱液极性) 离子交换SPE 吸附SPE,固相萃取填料,常用的正相吸附剂有硅酸镁、硅胶。反相SPE 采用化学键合C18 、C8 等，其它还有聚二甲基硅氧烷( PDMS) 聚丙烯酸盐( PA) 等聚合物。,固相萃取的优点,与传统的液-液萃取相比，固相萃取具有引人注目的优点：可以显著减少溶剂的用量, 并可以避免使用毒性较强或易燃的溶剂。避免液-液萃取中乳化现象的发生, 萃取回收率高, 重现性好。固相萃取简便、快速, 一般来说, 固相萃取可以同时进行批量样品的提取与富集, 大大地节约了时间。由于可选择的固相萃取填料种类很多, 因此其应用范围很广。易于实现自动化。,固相萃取的应用,SPE大多数用来处理液体样品，萃取、浓缩和净化其中的半挥发性和不挥发性化合物，也可用于固体样品，但必须先处理成液体。SPE 既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取，又可用于目标化合物净化与富集，是目前残留分析中样品前处理的主流技术之一。 目前国内主要应用在水中多环芳烃（PAHs）和多氯联苯（PCBs）等有机物质分析，水果、蔬菜及食品中农药和除草剂残留分析，抗生素分析，临床药物分析等方面。,样品预处理技术的革命 固相微萃取（SPME）技术,克服了以前传统的样品预处理技术的缺陷，它无需溶剂和复杂装置， 它能直接从液体或气体样品中采集挥发和非挥发性的化合物，可以直接在GC，GC/MS和HPLC上分析。能与任何型号的气相和液相色谱连用，有手动和自动进样两种。,商品化的固相萃取吸附材料的缺点,传统固相萃取的目标物与吸附剂之间的作用力是非特异性的, 通常需对萃取和洗脱条件进行仔细选择, 而且对不同基质的分离与分析物需要选择不同的柱填料, 从而限制了固相萃取的进一步发展。为了提高柱效与重现性、扩大其应用领域,开发研制高选择性的固相吸附材料是非常重要的。,分子印迹聚合物独特的选择性和亲和力正适应了这一发展要求。由于分子印迹聚合物可以根据分析目标物的需要而制备，所以能广泛应用于物质的分离与分析过程, 它对于目标物质的高度选择性也是普通固相萃取无法比拟的。利用分子印迹技术制备对食品污染物具有高选择性的分子印迹聚合物并用于食品污染物的去除和分析是一个很有意义的研究领域。,分子印迹技术,分子印迹技术（Molecular Imprinting Technique , MIT）的发展起源于免疫学（Immunology）。1949 年, Dickey首先提出了“分子印迹”这一概念, 但在很长一段时间内没有引起人们的重视。直到1972 年由Wulff 研究小组首次报道了人工合成的有机分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers , MIPs）之后, 这项技术才逐渐为人们所认识。特别是1993 年Mosbach 等在Nature上发表了有关茶碱分子MIPs的报道后, 这一技术开始飞速发展, 每年发表的有关分子印迹技术的理论、MIPs 的合成及应用的论文数直线上升。迄今, 在印迹机理、制备方法以及在各个领域的应用研究都取得了很大的进展。,分子印迹技术的基本原理,分子印迹技术是当前发展高选择性材料的主要方法之一，就是仿照抗体的形成机理，在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在聚合物的网络结构中留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中含有识别模板分子的结合位点，对模板客体分子表现高度的选择识别性能。,分子印迹技术的基本原理,分子印迹聚合物的制备：首先，模板分子与功能单体通过共价键或非共价键结合产生功能团和空间结构互补的相互作用，形成配合物；第二，在过量交联剂的存在下，引发聚合，使模板分子-功能单体配合物周围发生聚合反应，形成高度交联的具有一定机械性能的高分子聚合物；第三，通过适当的方法除去模板分子，得到功能团和空间结构与模板分子互补的分子印迹聚合物。,基质固相分散萃取(Matrix Solid-Phase Dispersion Extraction , MSPDE),基质固相分散萃取技术是1989 年由美国Louisiana 州立大学的Staren Barke教授首次提出，用于动物组织样品中抗生素药物的提取和净化。基本原理: 是将涂渍有C18 键合相或其它聚合物的担体作固相萃取材料与样品(固态或液态) 一起研磨,得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱,然后用不同的溶剂淋洗柱子,将待测物洗脱下来。一般情况下，萃取液可直接进行分析检测。目前国内外MSPDE 在农药残留分析中的应用研究取得了较大进展。,基质固相分散萃取的优点,MSPDE是在SPE 基础上改进后的样品前处理方法，与SPE相比较，其优点在于: MSPDE 依靠机械剪切力和C18 键合相的去垢效应及巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，简化了传统样品前处理中所需的样品匀浆、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了样品匀浆、转溶、乳化、浓缩等造成的待测物损失，提高了净化效率。,凝胶渗透色谱 ( Gel Permeation Chromatography , GPC),凝胶渗透色谱：是基于物质分子大小和形状不同，通过具有分子筛性质的固定相（凝胶）将物质进行分离。GPC 是多农药残留分析中一种常用有效的提纯方法，由于具有自动化程度高、净化效率较好及回收率较高，被广泛用于纯化含类酯的复杂基体组分。,三. 食品中农药残留分析检测技术,1. 薄层色谱法（TLC）2. 气相色谱法（GC）3. 气相色谱-质谱法（GC-MS）4. 液相色谱法（HPLC）5. 液相色谱-质谱法（LC-MS）6. 超临界流体色谱（SFC）7. 毛细管电泳（CE）8. 免疫分析（IA）,1. 薄层色谱法（TLC）,薄层色谱法：是以固体吸附剂（如硅胶、氧化铝等）为担体，水为固定相溶剂，流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析分离分析方法。优点：薄层色谱法不需要特殊设备和试剂，简便易行，快速、直观、灵活，可同时用于分析多个样品。缺点：灵敏度不高。近年来较少使用，多用于复杂混合物的分离和筛选。TLC 除用特殊的显色剂观察斑点颜色和用Rf值定性外，与其它技术联用不仅可以定性，而且可对样品中被分离的1 种或多种成分进行定量分析。20 世纪80 年代发展起来的高效薄层色谱( HPTLC) 与扫描技术结合，是一种易于建立和掌握的半定量技术。,薄层电动涂敷器,全自动点样仪,点样方式：点状，条带状喷雾式点样。点样加热平台： 温度0-200数码自动控温。点样机头移动：步进电机控制点样带长度：0（点状点样）-180mm（用于半制备色谱） 点样针驱动：步进电机控制，上下行程自动保点样针规格：配100ul进样针点样重现性：优于1.0%,薄层色谱扫描仪,扫描方式: 线性扫描,线性-飞点扫描； 扫描速度：20mm/s（分辨率；50um)；10mm/s(分辨率：25um)， 检测波长：190-900nm 检测方式：吸收法、反射法、荧光 法、透射法 灯源：氘灯、卤钨灯、汞灯。 软件操作,简明方便，很好的重现性,全自动展开仪,展开溶剂消耗： 每次展开约10mL,2. 气相色谱法(GC),气相色谱法是一种经典的分析方法。利用试样中各组分在气相和固定液-液相间的分配系数不同,当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时,组分就在其中的两相间进行反复多次分配,经过一定的柱长后,便彼此分离,按顺序离开色谱柱进入检测器,产生的离子流讯号经放大后,在记录器上描绘出各组分的色谱峰。,气相色谱仪,气相色谱流程,1、高压钢瓶 2、减压阀 3、载气净化干燥管 4、针形阀 5、流量剂 6、压力表7、进样器 8、色谱柱 9、检测器 10、记录仪,气相色谱流出曲线,气相色谱检测器,检测器：将色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应 的电讯号。检测器分为：浓度型检测器 （concentration sensitive detector） 质量型检测器 （mass flow rate sensitive detector）,气相色谱检测器,浓度型检测器：测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化，即检测器的响应值和组分浓度成正比。 质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的质量成正比 。,氢火焰离子化检测器（flame ionization detector）FID,对含碳有机化合物有很高的灵敏度。适用于痕量有机物的分析。特点：结构简单、灵敏度高、响应块、稳定性好、死体积小、线性范围宽。,电子捕获检测器（electron capture detector）ECD,它是一种具有选择性，高灵敏度的浓度型检测器。它对具有电负性的物质（卤素、硫、磷、氮、氧）有响应，电负性越强，灵敏度越高。能检测10-14gmL-1物质。,1、分离效能高。 2、灵敏度高。 3、分析速度快。 4、应用范围广泛。 5、装置简单，操作方便。缺点：在缺乏标准样品的情况下，定性分析较困难， 对于高沸点，不能气化和热不稳定的物质不能 用气相色谱法分离和测定。,气相色谱法的特点,气相色谱法应用,目前农药残留物检测70 %采用气相色谱法。 使用气相色谱法,多种农药可以一次进样,得到完全的分离、定性和定量,再配置高性能的检测器,使分析速度更快,结果更可靠。 使用气相色谱应从两个方面考虑,即色谱柱和检测器。气相色谱法使用的色谱柱主要是填充柱和毛细管柱。 在农药残留分析上,已从以填充柱为主,发展到以毛细管柱为主。由于弹性石英毛细管柱的出现,使操作更方便易行。 进样系统的不断改进,不但提高了毛细管气相色谱分析的精密度和准确度,而且大大增加了进样量,进一步提高了灵敏度。,3.气相色谱-质谱法( GC-MS),质谱分析法基本原理: 采用高速电子来撞击气态分子或原子，将电离后的正离子加速导入质量分析器中，然后按质荷比(m/z )的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。根据质谱峰的位置进行物质的定性和结构分析，根据峰的强度进行定量分析。气相色谱-质谱法( GC-MS) 是将气相色谱仪和质谱仪串联起来,成为一个整机使用的检测技术,它既具有气相色谱高的分离效能,又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点,可达到同时定性、定量的检测目的。用于农药残留量检测工作,特别是对农药代谢物、降解物的检测和多残留检测等具有突出的特点。,气相色谱-质谱法应用,Multi-residue determination of pesticides in water using multi-walledcarbon nanotubes solid-phase extraction and gas chromatographymass spectrometryShuo Wang , Peng Zhao, Guang Min, Guozhen FangJournal of Chromatography A, 1165 (2007) 166171,水中十二种农药的测定,4. 液相色谱法( HPLC),高效液相色谱法也是一种传统的检测方法。它可以分离检测极性强、分子量大的离子型农药,尤其适用于对不易气化或受热易分解农药的检测。近年来,采用高效色谱柱、高压泵和高灵敏度的检测器、柱前或柱后衍生化技术以及计算机联用等,大大提高了液相色谱的检测效率灵敏度、速度和操作自动化程度,现已成为农药残留检测不可缺少的重要方法。,液-固吸附色谱原理（liquid-solid adsorption chromatography）,固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝 等，较 常用的是510m的硅胶吸附剂。流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸,液相色谱仪器（high performance liquid chromatograph）,液相色谱仪（1）,液相色谱仪（2）,液相色谱仪（3）,液相色谱仪（4）,高效液相色谱法的特点,特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试 样的高效分离分析方法。,流程及主要部件 （process and main assembly of HPLC）,液相色谱检测器,a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,示差折光检测器（differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。,示差折光检测器,荧光检测器（fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,HPLC的应用 （application of HPLC）,环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,5.液相色谱-质谱联用技术(LC-MS),液相色谱-质谱联用技术(LC-MS) 是一种内喷射式和粒子流式接口技术将液相色谱与质谱联接起来的新方法,用于分析对热不稳定,分子量较大,难以用气相色谱分析的农药残留。它具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点。LC-MS 对简单样品可进行分析前净化,并具备几乎通用的多残留分析的能力,用于对初级监测呈阳性反应的样品进行在线确证, 其优势明显。尽管LC-MS对分析技术和仪器的要求高,但它仍是一种很有利用价值的高效率、高可靠性的农药残留分析技术。,6. 超临界流体色谱(SFC),超临界流体色谱: 是以超临界流体作为色谱流动相,可以使用各种类型的较长色谱柱;可以在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定和极性较强的化合物;可与红外、质谱联用。由于超临界流体具有气体和液体的双重性质,其粘度小、传质阻力小、扩散速度快,其分离能力和速度可与气相色谱相比。而其密度、溶解力和速度又可与高效液相色谱相当。通过调节压力、温度、流动相组成多重梯度,选择最佳色谱条件,综合利用了气相色谱和高效液相色谱的优点,弥补了气相色谱和高效液相色谱各自的不足,成为一种强有力的分离和检测手段。,超临界流体色谱(SFC),尤其突出的特点是SFC 可以与大部分气相色谱和高效液相色谱的检测器相连。这样就极大地拓宽了其应用范围,许多在气相色谱和高效液相色谱上需经过衍生化才能分析的农药,都可以用SFC 直接测定,SFC 可把氨基甲酸酯类农药与脂类物质分离,这对于在含有脂肪的食品中的农药残留分析具有重要意义。超临界流体提取和超临界流体色谱在农药残留分析中联合应用,为真正意义上的自动化分离分析体系的建立提供了切实可行的技术基础。,7. 毛细管电泳(CE),CE 的工作原理: 是使用毛细管柱内的不同带电粒子(离子、分子或衍生物) ,在高压场作用下以不同的速度在背景缓冲液中定向迁移,从而进行分离。根据样品组分的背景缓冲液中所受作用的不同,CE又被分为毛细管区带电泳(CZE) 、毛细管凝胶电泳(CGE) 、等电聚焦( IEF) 等几大类。CE 具有分离效率高、快速、样品用量少等特点。,毛细管电泳仪,仪器流程与主要部件 process and main assembly,高压电源、毛细管、缓冲液池（样品池）、检测器,毛细管电泳应用,在农药残留分析中,毛细管区带电泳(CZE) 的运用最为广泛。毛细管区带电泳(CZE) 非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。这一技术具有极高的效率和分离能力,其分离效率可达数百万理论塔板数,操作简便。毛细管电泳所需样品量极少,一般只需几个纳升。目前,毛细管电泳尚缺乏灵敏度很高的检测器,可利用的紫外检测器能检测几个皮克,但因样品量只用几个纳升的体积,故所用样品浓度被限制在10 - 6 。因此,只有研究开发灵敏度更高的检测系统,毛细管区带电泳的优势才能充分发挥出来。,8. 免疫分析( IA),免疫分析( IA) ：是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法。通过对半抗原或抗体进行标记,利用标记物的生物或物理或化学放大作用,对样品中特定的农药残留物进行定性定量检测。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点。一般不需要贵重仪器,可大大简化甚至省去前处理过程,容易普及和推广。若开发成试剂盒,可广泛用于现场样品和大量样品的快速监测。,酶免疫分析方法,目前,酶免疫分析方法的研究十分活跃。该方法是利用有机磷和氨基甲酸酯两类农药具有抑制靶标酶(如乙酰胆碱酯酶) 活性的生化反应作用,用于对相应农药残留进行快速定性定量检测。此法既可以检验单一农药残留量,又可以检出多种农药的综合残留量。利用此方法对蔬菜、水果、果品和农产品进行农药残留量测定,灵敏度高、操作简单、检测速度快。,四. 食品中农药残留的测定,（一）气相色谱法测定葡萄、胡萝卜、菠菜、茶叶以及烟叶中的硫丹残留,硫丹(Endosulfan)是一种常见的有机氯农药，主要以两种异构体的混合物（-硫丹和-硫丹）形式存在，其比例为7:3。它是一种广谱的杀虫剂，具有触杀、胃毒和熏蒸多种作用，主要针对咀嚼式和刺吸式口器害虫。该农药适用作物包括各种水果和蔬菜、茶叶、烟草以及棉花等。硫丹被人吸入、摄入或经皮肤吸收可以引起中毒，主要损害运动中枢、小脑、脑干以及肝、肾和生殖系统，而且对人有致突变作用，为致癌物质。 硫丹作为一种高效广谱杀虫剂曾经被广泛使用，而且结构稳定、残留期长，因此在农产品和食品中残留现象较为普遍。,硫丹的化学结构,-Endosulfan,-Endosulfan,1.样品前处理,(1) 样品的制备：对于水果蔬菜类，先用水洗去泥沙然后除去表面附着的水分，取食用部分，沿纵轴剖开，切成四等分，取相对的两块，切碎，混匀。而对茶叶与烟草等干燥产品，则将样品全部磨碎，四分法缩分。,(2) 提取,匀浆法：称取5 g样品于高速组织捣碎机中，加入25 mL100%纯甲醇，充分匀浆捣碎2 min，取上清液，待净化机械振荡法：称取5 g样品，加入25 mL100%纯甲醇，于电动振荡机上振荡1 h，静置（或离心），取上清液，待净化。人工手摇法：称取5 g样品，加入25 mL100%纯甲醇，手动摇晃5 min，静置（或离心），取上清液，待净化。,(3) 净化,固相萃取法：将C18反相萃取柱安装在固相萃取真空抽滤装置上。用3 mL甲醇预淋洗，取1 mL样液用水稀释至10 mL上样，淋洗液为4 mL的40%甲醇，最后用4 mL正己烷洗脱，收集洗脱液，蒸干后用正己烷定容至1 mL。,(3) 净化,层析柱法：在直径15 cm2 cm玻璃层析柱内，底部垫少许脱脂棉，从下向上依次填入1 cm无水硫酸钠，1 g 5%加水脱活的弗罗里硅土（或中性氧化铝），装好柱后轻轻敲实。上样量1 mL，先用4 mL正己烷洗脱，接着用正己烷/丙酮(v/v3:1)洗脱。收集最初流出的8 mL洗脱液，转移到蒸馏瓶中，将其蒸发至干，用正己烷清洗，定容至1 mL。 注：弗罗里硅土和中性氧化铝在使用前需在600 下高温活化4 h。,气相色谱测定,岛津GC2010气相色谱仪，日本岛津公司 DB-5弹性石英毛细管柱，美国安捷伦公司 （30m0.25mm0.25um）电子捕获检测器,测定条件,进样口温度：280 ，检测器温度：300 ，载气：99.999%氮气，柱流速：1.6 mL/min。分流进样，分流比1:10，进样量1.0 L。色谱柱程序升温： 130 （1 min） 8 /min 220 （1 min）5 /min 260 （6 min）,标准曲线的绘制,准确称取-硫丹，-硫丹标准品配制成1000 g/mL正己烷贮备液，分别吸取一定量的贮备液按1:1混合，用正己烷稀释定容至0.5，1，5，10，20，50，80 g/L标准系列，以上述色谱条件进样测定，制得标准曲线。,计算残留量,样品采用外标法定量,以所得样品的峰高换算出对应于标准曲线的物质的质量。然后代入下式计算残留量:样品残留量(mg/kg) = 样品峰高对应的物质的质量(ng)样品定容体积(mg) 进样体积样品质量(g),样品加标回收实验,在气相色谱分析确定待测样品中的硫丹农残含量均低于1.0 g/kg 后，样品要做加标回收实验。在以上空白样品中添加几个不同浓度的硫丹标样，室温静置过夜。按照上述方法处理，测定，计算回收率。,发表论文,Development of Two Enzyme-Linked Immunosorbent Assaysfor Detection of Endosulfan Residues in Agricultural ProductsSHUO WANG,* JUN ZHANG, ZHIYAN YANG, JUNPING WANG, AND YAN ZHANGJ. Agric. Food Chem. 2005, 53, 7377-7384,（二）气相色谱法蔬菜中5 种农药百菌清、甲胺磷、乐果、敌杀死、敌百虫残留的测定,样品来源：(1) 从无公害基地随机采取蔬菜,共8 个品种即西红柿、四季豆、大白菜、窝笋、黄瓜、豇豆、辣椒、空心菜,40 个批次。(2) 从农贸市场随机构买蔬菜,共5 个品种即西红柿、黄瓜、小白菜、空心菜、豇豆,10 个批次。,样品的处理,测定百菌清、敌杀死的试样制备: 称取25 g 被测蔬菜,用组织捣碎机捣碎后,置于锥形瓶中,加60 ml 丙酮和50 %的磷酸2 ml ,经充分振荡10 min 后过滤,用20 ml 丙酮洗涤锥形瓶2 次;将滤液移入250 ml 分液漏斗中,加入20 %的硫酸钠100 ml 摇均后,用30 ml 环已烷提取2 次,静止分层,提取液用带有硫酸钠的漏斗干燥后,在水浴中浓缩至10 ml 后进行层析;层析柱依次垫少许脱脂棉,4cm 高的无水硫酸钠,10 g 弗罗里硅土,2 cm 高的无水硫酸钠,用20 ml 环已烷预淋洗层析柱后,然后将浓缩液倒入柱中,用环已烷淋洗,收集淋洗液,定容。,样品的处理,测定乐果、敌百虫、甲胺磷的试样制备: 称取10 g 被测蔬菜捣碎后