酶与蛋白质工程第4章 基因表达与蛋白质分离纯化ppt课件.ppt

第四讲 基因表达与蛋白质分离纯化,蛋白质异源表达的关键问题就是发展克隆基因的表达方法，即找到理想的宿主表达系统 目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系统各有优缺点,基因表达体系,基因表达体系,原核体系,大肠杆菌 (Escherichia coli) 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包涵体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰 枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳 定，尚无商品化的表达载体 其它 乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis),基因表达体系,真核体系,酵母细胞 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表 达;商品化表达体系：酿酒酵母、毕氏酵母、裂殖酵母 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高 昆虫细胞 可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜 蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限 哺乳动物细胞/组织 可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高 植物细胞/组织 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不便,基因表达体系,体系选择,研究基因功能 大肠杆菌、裂殖酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞 多肽药物生产 大肠杆菌、毕氏酵母、哺乳动物细胞组织 疫苗 大肠杆菌、酵母、动植物细胞组织 单抗生产 杂交瘤细胞 工业酶生产 各种微生物,Escherichia coli,E.coli常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命名为K-12和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。大肠杆菌K-12的基因组的测序工作已于1997年完成。大肠杆菌B菌株自1918年被分离出来后，在1959年被分离为两类实验用菌株：REL606和BL21(DE3)，后者在医学和工业上用于生产蛋白质由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常用的大肠杆菌(E.coli)菌株基因组的测序工作，发表在Journal of Molecular Biology (2009)基因组大小4.6M bp,基因表达体系,细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，是目前广泛应用的外源基因表达体系。但缺乏真核细胞特有的加工处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏,硫氧还蛋白标签,凝血酶,肠激酶,基因表达体系,目标蛋白质在大肠杆菌中的表达,载体分类,克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表达的载体,基因表达体系,（）复制起始点（）选择性基因（一般为抗生素抗性基因）（）强的、可诱导的启动子（）强的转录终止序列（）核糖体结合位点（）合适的多克隆位点,表达载体包括的成分,基因表达体系,基因表达体系,大肠杆菌表达载体分类,按蛋白质类型分：单纯表达: 如pJLA系列融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽按启动子分：lac及衍生的tac, trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导lamda phage PL和PR 启动子 热诱导T7 启动子 IPTG诱导T5 启动子 IPTG诱导ara启动子 阿拉伯糖诱导,基因表达体系,常用表达载体,ET系列 (T7 promoter, Novagen公司)pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司)pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司)pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司)pBAD系列 (Arabinose诱导型)pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs),基因的融合,采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白构建融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达,基因表达体系,为蛋白质的表达和纯化提供方便 蛋白质结构和功能的研究获得蛋白质的途径（通过体外切割）与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST蛋白表达的空间定位：信号肽,利用融合技术表达外源基因原因：,基因表达体系,基因融合的策略,基因融合的方式信号肽+基因信号肽+基因+插入序列,基因表达体系,融合蛋白接头设计和选择,将2个或多个不同的模块连接成为一个大分子，其中起连接作用的氨基酸链即为linker，Linker的长度一般是在10-15个氨基酸之间,若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠有重大影响另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等）,基因表达体系,融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，这段“亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来,融合蛋白标签,基因表达体系,蛋白纯化蛋白质的检测和定向固定提高重组蛋白质的产量增强重组蛋白质的可溶性及稳定性,融合标签的功能,基因表达体系,Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene)MBP (maltose-binding protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *二硫键形成Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫键的形成SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀,各种融合蛋白表达载体,帮助可溶化,帮助分泌到周质,可用亲和层析纯化,基因表达体系,基因表达体系,各种用于抗体识别的标记,His-tag (6-8 Histidine)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK),融合蛋白报告分子,将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选,基因表达体系,作为报告分子必须具备以下特点：报告分子应不存在于宿主中且易于和内源性基因相区别；应该有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子；报告分子的分析结果应具有很宽的线形范围，以便于分析启动子活性的幅度变化；报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动,基因表达体系,融合蛋白的专一性切割,DTT: Cys 溴化氰: MetThrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGREnterokinase: DDDDKPreScissionTM protease: LEVLFQGP Genenase I TM: PGAAHYTEV protease: ENLYFQG,1. 启动子结构对表达效率的影响 转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此要选择强的可诱导的启动子及相关的调控序列,外源基因有效表达影响因素,基因表达体系,强启动子： 1. 表达效率在10-30%； 2. 由启动子控制的本底转录很低； 3. 启动子能够由一些简单及经济合算的方式诱导启动如，T7启动子, mRNA的稳定性：细胞内mRNA的浓度由mRNA转录的速率和mRNA降解之差来决定； 翻译的起始：无效的翻译起始多半是蛋白质低表达的最常见问题； 翻译的延伸：遗传密码的简并； 氨基酸的错误搀入； 翻译的终止,2. 有效翻译与基因的高效表达,基因表达体系,每种生物对简并密码子的使用频率的差异；同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量相关；某些密码子对所有不同基因都是最常用的，如CCG是脯氨酸最常用密码子；富含宿主不常用密码子的外源基因有可能得不到有效表达,3. 密码子偏好性,基因表达体系,大肠杆菌细胞学结构特点使表达的外源蛋白可能定位在胞内、胞质膜、胞周质、外膜、胞外培养基（1）胞内表达：小分子蛋白易表达、易水解。大分子蛋白，胞内表达易形成包涵体,4. 外源蛋白的表达定位,基因表达体系,（2）外周质表达：外源基因与信号肽融合，外周质的氧化环境有利于蛋白质正确折叠， 外周质中蛋白质降解少，外周质中总蛋白少（4%），目的蛋白容易纯化,（3）细胞外分泌：利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径；利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。分泌至培养基的蛋白容易纯化，减少内源蛋白酶降解,基因表达体系,（4）胞质膜定位：常用于含有跨膜区膜蛋白的研究，如G蛋白偶联受体，具有重要的生理和药理学作用（5）菌体表面定位：大肠杆菌表面蛋白与外源肽或蛋白融合，表达外源肽或蛋白的菌株可用于构建活菌苗、筛选文库，研究蛋白与配体相互作用、细胞间粘附等,菌株内蛋白酶太多会导致外源蛋白表达产物不稳定，选用蛋白酶缺失的宿主菌,5. 宿主菌选择对表达的影响,基因表达体系,增加细胞培养密度，如分批培养和连续培养； 改变培养基的组成及培养条件,6. 宿主菌培养条件控制对表达效率的影响,真核基因在原核细胞中表达及调控,真核基因特点：启动子不能被原核识别；mRNA上没有SD序列；基因内部含内含子；产物往往需要翻译后加工；易被原核酶系降解因此，在原核细胞中表达时应注意三个问题：基因编码区必须连续；必须置于原核启动子、终止子和SD序列的控制之下；产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠,基因表达体系,Yeast,芽殖是酵母最常见的无性繁殖方式，即从细胞壁上产生芽体，形成子细胞。酿酒酵母于1996年完成基因组测序芽殖酵母和裂殖酵母听起来是近亲，但实际上它们在约亿到亿年前就分家了，走上不同进化道路。2001年诺贝尔生理学或医学奖获得者、英国帝国癌症研究基金会的保罗纳斯领导的小组完成裂殖酵母基因组测序工作，发表在Nature杂志上 裂殖酵母的基因组含有3条较大的染色体，约1380万个碱基对。分析表明，裂殖酵母只有4824个编码蛋白质的基因， 是真核生物中最少的，比芽殖酵母少1000个左右， 甚至比一些细菌还少,基因表达体系,酵母表达系统既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰,目标蛋白质在酵母细胞中的表达,基因表达体系,5AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇诱导下可启动外源蛋白的表达； -因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3 AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因同源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制,毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构,PIC9载体的信号肽序列和多克隆位点,表达菌株,酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae毕赤酵母Pichia PastorisKoichi Ogata等人于1969年首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长，此后，用甲醇利用型酵母生产单细胞蛋白作为动物饲料的潜力就引起了广泛关注； 1987年，Cregg等人首次报道了用酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg )，随后Philip Petroleum公司与Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)就开始了毕赤酵母表达系统的合作开发； 1993年，Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给Research Corporation Technologies公司，并委托Invitrogen公司进行有关产品销售,基因表达体系,1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达,毕赤酵母与其它表达系统优点,基因表达体系,4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性外源蛋白容易从培养基的基质中分离5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为814个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3连接甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用6、使用方便、简单，而且成本较低,基因表达体系,毕赤酵母Pichia Pastoris常见菌株GS115KM71PMAD11PMAD16,基因表达体系,甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性； 筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵； 培养基和培养条件不成熟； 因此，开始研制不以甲醇为唯一诱导物的启动子：GAP、FLD1、DAS、AOX2等,毕赤酵母表达系统的缺点,基因表达体系,昆虫表达系统 优点是能较高水平表达不同动物来源基因，能够有效进行蛋白质翻译后加工 主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫4-5天后，细胞就裂解，幼虫即死亡,基因表达体系,杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒。可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体,基因表达体系,昆虫杆状病毒表达系统,可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白能进行翻译后加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力,昆虫杆状病毒表达系统具有以下特点,基因表达体系,表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50,能容纳大分子插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限,基因表达体系,能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体杆状病毒对脊椎动物无感染性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时可能优于其它系统,哺乳动物细胞 生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白 其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高,基因表达体系,已有许多重要蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产 如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素,根据进入哺乳动物细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内，在几天内使外源基因整合到病毒载体中,表达载体的类型,基因表达体系,质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排,基因表达体系,常用的表达重组蛋白的细胞株有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞,2、宿主细胞,基因表达体系,根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统瞬时表达系统是指表达载体进入宿主细胞后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂，具有简捷、实验周期短的优点,3、表达系统,基因表达体系,体外翻译系统,体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改变体外翻译系统中翻译特定基因较胞内表达系统具有许多优点，如内源性mRNA干扰很小，可以同时加入多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻译系统可以对基因产物进行特异性标记，便于在反应混台物中检测目前，体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、E.coli S30系统3种,基因表达体系,兔网织红细胞系统,兔网织红细胞用新西兰大白兔制备，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降低翻译背景。裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分(tRNA，核糖体，氨基酸，起始、延伸、终止因子) 为了使系统更适于mRNA的翻译，兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外还添加了tRNAs混合物用于扩大mRNA翻译的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等,基因表达体系,麦胚提取物的制备 通过碾磨麦胚，离心去除细胞残渣，上清液通过层析将抑制翻译的内源氨基酸和植物色素等分离除去。提取物用微球菌核酸酶处理破坏内源mRNA，最大限度降低翻译背景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统和增加链延伸效率的亚精胺，以及一定量的乙酸镁 麦胚提取物系统可稳定表达一些在兔网织红细胞系统中翻译受到抑制的DNA，对于表达真核转录因子是一个很好的选择系统,麦胚提取物系统,基因表达体系,E.Coli S30提取物是由OmpT内切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的E.Coli B菌株制备，所以在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性，尤其适用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质 S30体外翻译系统也适合表达由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质，使其能高水平表达 S30系统还可用于转录和翻译调控的研究。此外，S30体外翻译系统还可用于合成少量标记蛋白质，作为示踪物质以及在蛋白质中掺入非天然氨基酸用于研究蛋白质的结构功能,原核体外翻译系统,基因表达体系,转基因微生物生物反应器：由于微生物结构简单、繁殖迅速、容易培养而成为转基因对象，主要采用遗传背景清楚的大肠杆菌和酵母表达系统，通过高密度发酵培养、分离纯化获得所需要的目的产物，生产的药物属于第一代基因工程药物转基因植物细胞生物反应器：将外源基因转入植物细胞，表达制备相关产品。由于植物细胞大规模培养技术限制，目前利用转基因植物细胞大规模生产基因工程产品有一定难度转基因动物细胞生物反应器：将外源基因转入动物细胞，表达制备相关产品。利用转基因动物细胞生产蛋白类药物、疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点转基因动植物生物反应器：将外源基因转入动植物个体，表达制备相关产品。转基因动植物技术不仅限于转基因技术，而且还涉及植物组织培养、动物胚胎工程等技术，因此过程复杂,生物反应器,生物反应器,生物反应器的特点比较,蛋白质的分离纯化,（1）材料来源 来源方便、含量丰富、容易提取、 防止变性 设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高蛋白质的产量（2）分离的一般原则 利用分子大小，如分子筛凝胶过滤； 利用电离性质，如电泳； 利用溶解性，如等电点； 利用生物学特性，如亲和层析等,蛋白质的分离纯化,（3）纯化鉴定 氨基酸组成分析、末段分析、 色谱分析、电泳分析、等电聚 焦分析、免疫化学分析 （4）序列测定 确定肽链的氨基酸组成、末端和S-S键数目 专一地酶解大的多肽成为较小的片段 蛋白质序列仪 应用肽段序列重叠法确定氨基酸的排序 确定S-S键的位置,一般程序： 1、从组织细胞中溶解放出蛋白质，并保持天然状态，常用低温冰 冻、化学试剂及溶菌酶破壁、破膜，再用溶剂提取 2、分离所需要蛋白质与其他蛋白质 a 透析与超滤 b 等电点沉淀 c 盐析和有机溶剂分级分离 d 离子交换层析 e 凝胶过滤层析 f 亲和层析 3、结晶提纯 a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白 b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液 各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂 防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染,蛋白质的分离纯化,(一) 根据分子大小不同的分离方法 1.透析和超过滤 透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质，而水和无机 盐等小分子自由通过，此方法只能将蛋白质和小分子 物质分开，不能将不同蛋白质分开 超过滤：是利用外加压或离心使水和其他成分通过半透膜， 蛋白质留在膜上，达到浓缩蛋白质溶液的目的,蛋白质的分离纯化,透析与超过滤简易装置,2. 密度梯度离心 a. 蛋白质颗粒沉降不仅决定 于它的大小也取决于它的 密度 b. 颗粒沉降到与自身密度 相等的介质梯度时，即 停止不前 c. 在离心力的作用下，各种 蛋白质在不同密度介质 中形成独立区带,蔗糖密度梯度离心,蛋白质的分离纯化,3. 凝胶过滤 a. 又称分子筛层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效 的方法之一 b. 常用葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex)和琼脂糖凝胶(商品名 为Sepharose) c. 大分子先洗脱下来，小分子后洗下来,蛋白质的分离纯化,凝胶过滤法,(二) 利用溶解度差别的分离方法 1. 等电点沉淀 利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最小这一性质，可以 通过调节蛋白质溶液的pH值 ，将不同的蛋白质分开,蛋白质的分离纯化,2. 盐溶和盐析 盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层使蛋白 质溶解度增加； 盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋 白质溶解度降低，发生沉淀析出,等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解，也就是：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度盐溶 提问：原因？,b.盐溶盐析,分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散溶于水中,盐溶,向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出提问：原因？,盐析,蛋白质分子表面的疏水区域，都聚集许多水分子，高浓度盐使得水分子被抽出，暴露出的疏水性区域相互结合，形成沉淀,盐析,3. 有机溶剂沉淀法 a. 有机溶剂(与水相溶)争取蛋白质颗粒上的水膜，使之沉淀 b. 有机溶剂：乙醇、丙酮 c. 低温操作，边加入边搅拌，防止局部过热，引起变性， 尽量缩短处理时间,蛋白质的分离纯化,(三) 根据电荷不同的分离方法,. 离子交换层析法: a. 根据蛋白质带电荷情况 b. 不同载体： 纤维素 交联葡聚糖：兼有分子筛效应 交联琼脂糖,蛋白质的分离纯化,离子交换层析法,离子交换原理及流程示意图,2. 电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等,蛋白质的分离纯化,几种重要的蛋白质电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离、鉴定蛋白质的常用方法 等电聚焦电泳 通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质 双向凝胶电泳 蛋白质组学研究的重要技术,PAGE,电泳结果,原理,蛋白质的分离纯化,等电聚焦电泳： 当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动,通电,蛋白质的分离纯化,(四) 根据配体特异性的分离亲和层析 1. 根据蛋白质分子能与另一种称为配体的分子特异结合 2. 如：酶的作用底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物， 激素和受体蛋白，抗原和抗体互为配体 3. 用含有自由配体的溶液洗脱蛋白质,蛋白质的分离纯化,亲合层析原理及流程示意图,蛋白质含量分析和纯度鉴定,(一) 含量测定 1. 凯氏定氮法 2. 双缩脲法 3. 紫外线吸收法 4. 福林-酚试剂法 5. 考马斯亮蓝法,蛋白质的分离纯化,(二) 蛋白质纯度的鉴定 常用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 高纯度：电泳得到均一的一条区带 低纯度：电泳得到几条区带,next,第五讲 基因突变与蛋白质改造,To be continued.,