蛋白质芯片ppt课件.pptx
蛋白质芯片,在基因组学提出后，1994年Wilkin和Williams首次提出了蛋白质组学的概念。它的研究对象不再只是针对一种或几种蛋白质，而是着眼于全面性和整体性来研究体系内所有蛋白质的性质与功能。这就需要建立一种高通量、快速、直接、高质量的微阵列方法来研究蛋白质。蛋白质芯片(protein chips)或称蛋白质微阵列(protein microarrays)技术就是顺应这一需要而发。,蛋白质芯片的原理,蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。,蛋白质芯片的研究意义,蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物质层面； 探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。,蛋白质芯片的优点,相比较传统分析方法有以下优点蛋白质芯片上可以实现成千上万个蛋白质样品的高通量平行分析。高的信噪比。所需样品量极少，检测水平已达ng级。在基因组和蛋白质组水平将DNA序列信息与蛋白质产物直接联系起来。,蛋白质芯片的分类,根据用途的不同 蛋白质芯片可大概分为：蛋白质功能芯片：主要用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量分析，用来进行蛋白蛋白、蛋白多肽、蛋白小分子、蛋白 DNA RNA结合、蛋白酶等反应的研究。蛋白质检测芯片：将具有高度亲特异性的探针分子(如单克隆抗体、小片段抗体、受体等)固定在载体上，用以识别复杂生物样品中的目标多肽、蛋白、抗原等。,根据芯片表面化学成分的不同 蛋白质芯片分为：化学表面芯片：又可分为疏水、亲水、弱阳离子交换、强阴离子交换、特异结合等，用于检测未知蛋白，并获取指纹图谱。生物表面芯片：分为抗体抗原、受体配体和DNA 蛋白质芯片等。,根据载体的不同蛋白质芯片分为：普通玻璃载体芯片多孔凝胶覆盖微孔芯片 。 近年还发展起来许多借助DNA芯片技术的蛋白质芯片技术，如通过特异性DNA结合结构域在DNA芯片表面制成的蛋白质芯片 、通过mRNA-蛋白质共价交连融合技术制成的蛋白质芯片 、自组装蛋白质芯片。,蛋白质芯片比较,表面 蛋白固定方式 优点 缺点,PVDF 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，分布随机Nitrocellulose 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，高背景，低密度 无需蛋白修饰过程，高密度， 非特异吸附，分布随机 高分辨检测Epoxy-activated 高密度，高分辨检测 分布随机，表面有吸附PDMS nanowell 高密度，适合复杂的生化分析 Gold coated silicon 高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化Avidin coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化 Ni-NTA coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记 表面蛋白分布均一容量Agarose thin film 制作难，未商品化3D gel pad,吸附，共价偶联,Poly-lysine coatedAldehyde-coated,共价偶联,扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量,蛋白质芯片的构建,蛋白质芯片主要包括5个基本要点:,1，固体芯片的构建,目前已用于制作蛋白质芯片的固相介质主要有：化学膜聚丙烯酞胺凝胶微孔板玻片,化学膜： 制作蛋白质芯片的化学膜有尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯膜和聚偏二氟乙烯膜等。化学膜的优点在于不需要做点样前复杂的表面处理，直接可以进行点样，但容易造成较高的背景，降低检测的灵敏性。聚丙烯酞胺凝胶： 由聚丙烯酸胺凝胶制备的聚丙烯酞胺凝胶垫板作为蛋白质芯片载体提供了多孔的贮水环境，有利于保持芯片上蛋白质的生化活性，但杂交后除去反应液较困难。,微孔板： 9600微孔板和 1001000nl体积的微凹井平板是微孔板型蛋白质芯片的良好载体，这种微凹井蛋白质芯片上探针蛋白质间分隔良好，交叉污染程度极低，而且探针蛋白质处在水相，有利于蛋白质芯片的保活，因此特别适合进行生化分析。微孔板型蛋白质芯片已经成功地用于在全基因组水平上进行蛋白质相互作用的高通量筛选。玻片： 玻片是目前制作蛋白质芯片的最佳载体，它不但可以提高点阵密度体现芯片化模式分析的高通量优势，还有利于充分利用基因芯片已经发展成熟的点样和检测设备，提高操作的自动化水平和检测及分析的效率。,2.探针的准备,蛋白质芯片是将各种蛋白质点样到固体基质表面形成阵列，高通量检测样品中目标蛋白质分子的一种技术，因此蛋白质芯片上探针蛋白的种类多少、特异性强弱、灵敏度高低是影响蛋白质芯片发展的关键因素。蛋白质芯片上的探针蛋白可根据研究目的的不同，选用抗体、抗原、受体、酶、糖、核酸、药物、重组蛋白、或多肽等物质。,3.点制微阵列,在选定适当的载体并进行表面处理后，需要将探针蛋白质溶液转移到载体上，以便探针蛋白与玻片表面的化学基团发生化学反应而使蛋白质最终连接到玻片上成为蛋白质芯片。目前转移蛋白质的方法基本分三种：手工点样制备低密度蛋白质阵列是接触式点样制备蛋白质芯片是非接触式点样制备蛋白芯片,4.生物分子反应,这是芯片检测的关键步骤，该步骤中发生靶标样品与探针之间的选择性反应。使用时将含有待检测物质的标本(如尿液、血清、精液、组织提取物等)按试验需要做相应处理后根据测定目的选用合适的蛋白质芯片，在每个芯池里加入需要检测的己处理样品，一般210l即可。芯片与待检测物质在实验确定的严谨条件下相互作用一段时间后，除去未结合的或多余的物质，然后根据实验要求直接或进一步处理后进行检测。,5.信号的检测和分析,对于结合到蛋白质芯片上的蛋白的检测目前有很多方法，总的来说可以分为间接检测法和直接检测法两类。间接检测法:也称为标记法，即事先对待测蛋白质样品进行标记，在与芯片反应完成后，通过标记来检测结合的蛋白。主要的标记方法有:酶免疫标记检测法同位素标记法荧光物标记法化学发光检测法胶体金标记检测法,X-ray胶片,化学发光系统,UVP,Bio-Rad,红外荧光扫描,LICOR Odyssey双色红外激光成像系统,比色法检测TMB底物,直接检测法:不需对待侧蛋白样品进行标记，在与芯片反应完成后即可直接进行检测。主要的标记方法有:表面等离子共振检测技术,表面增强激光解析/离子化飞行时间质谱检测技术原子力显微镜,蛋白质芯片的应用,1. 生物标志物 （Biomarker）研究 发现新生物标志物 早期诊断 多指标、多疾病同时诊断2. 新药研发 发现药物的靶标 筛选有前景的新药 研究药物作用、确定潜在副作用 选择临床试验、治疗的合适病人3. 蛋白质表达谱 蛋白质、多肽、抗体、小分子4. 蛋白功能谱 蛋白质间相互作用 DNA-蛋白质相互作用 RNA-蛋白质相互作用 小分子-蛋白质相互作用 蛋白质修饰5. 生物医学研究 发现研究模型的重要因素 阐明分子机制 建立数据库,蛋白质芯片的问题,蛋白质芯片技术最近几年的发展极为迅速，已被证明是整个基因组研究和大规模发现研究的有力工具，越来越多的应用实例证明了蛋白质芯片的广阔应用前景及其市场价值。但目前的蛋白质芯片技术也存在一些问题成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器芯片的标准化问题提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响 ,蛋白质芯片的展望,建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。,
