第八章蛋白质和氨基酸的测定ppt课件.ppt

第八章 蛋白质及氨基酸的测定,第一节 概述,1.蛋白质的元素组成（The elements of protein） C：50-55% N：15-18% O：20-23% H：6-8% S：0-4% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu2、基本结构单位：氨基酸3、蛋白质的变性作用。,4、蛋白质分析的重要性,生物活性测定功能性质调查营养标签 总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值,5、蛋白质的测定方法,利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法,凯氏定氮法杜马斯法,福林酚法染色法,第二节 蛋白质的定性测定,一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了 5 种染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）,蛋白质的测定方法,1凯氏定氮法（1833年Kieldahl,常量法、微量法、自动定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）2双缩脲法 3福林酚（Lowry）法4 Bicinchoninic Acid 法5 280nm紫外吸收法6染色法 6.1阴离子染色法 6.2布兰德福特（Bradford）法7茚三酮法8比浊法9杜马斯法（燃烧法）10 红外光谱法,一、凯氏定氮法（常量）,凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白含量。 此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。,原理,样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O，有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。,样品制备消化中和、蒸馏滴定计算 利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16%的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。 即： %N 6.25 = %蛋白质,部分食品的蛋白质换算系数*,在消化反应中,为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间,常加入下列物质,1）硫酸钾: 提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解,水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反应式如下： K2SO4 + H2SO4 2KHSO4 2KHSO4 K2SO4 + H2O+ SO2,硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起引起生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。,（2） （催化剂、指示剂）硫酸铜,起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。 指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。 除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等也可用的催化剂。,装置,操作步骤,消化 准确称取固体样品0.22g（半固体样品25g，液体样品1020ml）移入凯氏烧瓶加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml摇匀安装消化装置于凯氏瓶口放一漏斗以45角斜支于有小孔的石棉网上用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡沫停止后加大火力保持瓶内液体微沸至液体变蓝绿色透明继续加热微沸30分钟冷却 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。,蒸馏,吸取5mL稀释后的消化液加入凯氏定氮仪内加10mL40%的氢氧化钠夹好漏斗夹冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂) 加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分钟) 将冷凝管下端提离液面用蒸馏水冲洗管口继续蒸馏1分钟加热。,滴定,将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色（用甲基红溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同时作一试剂空白。,计算,Page 158 公式,当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23ml后再继续消化。一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。,硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。,二、自动凯氏定氮法,将凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，原理与试剂同前。自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置。消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热装置组合而成的消化炉。,方法特点及应用范围,灵敏准确快速样品用量少,三、微量凯氏定氮法,原理及适用范围同常量凯氏定氮法主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏定氮仪试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常量法Page 160,蛋白质的快速测定双缩脲法,原理,方法特点及应用范围,灵敏度较低，但操作简单快速，在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定。也可定量测定分离纯化后的蛋白质。,步骤,标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（或）准确稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。,样品的测定：准确称取用品适量（使得蛋白质含量在40110mg之间）于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进而由此求得蛋白质含量。,优点：,该方法比凯氏定氮法费用低，速度快（可在不到30min的时间内完成），是分析蛋白质最简单的方法。比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离。几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。,缺点：,不如福林酚法灵敏，分析时至少需要24mg蛋白质。如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。 高浓度的胺盐会干扰反应。不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，例如明胶的双缩脲反应产生红紫色。如果有高浓度的脂（用醚抽出）或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度的蛋白质（如BSA）或经凯氏定氮法校正。,三、福林酚（Lowry）法,原理蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。其中蛋白质中的肽键与碱性铜离子反应形成双缩脲反应，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与吸光度有较好的线性关系。,优点,因为福林酚法简单、灵敏，已被广泛应用于蛋白质的生物化学中。然而，一般不用于测定未从食品混合物中纯化的蛋白质。 1非常灵敏： A:较双缩脲法灵敏50100倍。 B：较280nm紫外吸收法灵敏1020倍。 C：较茚三酮法灵敏好几倍。 D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。2测定结果较少受到样品混浊度的影响。3特异性要高于其他大多数方法。4操作相对简单，可以在11.5小时内完成。,缺点,由于下列因素，福林酚法在某些应用中需采用标准曲线进行校正。1反应产生的颜色比双缩脲法更易因蛋白质的种类不同而发生变化。2反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。3蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单糖和己胺会不同程度的干扰反应。4.高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。,四、紫外吸收法,原理蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环残基存在。由于存在于每一种食品的蛋白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，所以可用比色法，即在280nm处比色测定蛋白质的浓度。,适用范围,应用简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广泛应用于食品体系。已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。尽管蛋白质中的肽键在190nm220nm处的紫外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的测定更困难。,优点,快速，相对较灵敏（在280nm处需要100ug或更多的蛋白质，比双缩脲法灵敏数倍）。反应不受硫酸铵和其它缓冲液的干扰。不破坏样品原有的性质，在测定完蛋白质含量后仍然可用于其它分析。广泛用于层析柱分离后的蛋白质测定。,缺点,核酸在280nm处也有紫外吸收，纯蛋白质和纯核酸的280nm/260nm紫外吸收比分别为1.75和0.5。如果知道280nm/260nm的值，就能校正核酸在280nm处的吸收值。不同种类食品的蛋白质中，芳香族氨基酸的含量明显不同。样品溶液必须纯净无色。此法适用于相对纯净的体系。,Bicinchoninic Acid(BCA)法,原理 Smith等人提出,在碱性条件下蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，亚铜离子-蛋白质复合物和苹果绿的BCA试剂反应形成浅紫色。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。,Bicinchoninic Acid(BCA)法,方法1蛋白质溶液和含有BCA钠盐、Na2CO3、NaOH、CuSO4、pH11.25的BCA试剂一步混合。2在37保温30min或室温下放置2hr,或60保温30min。温度的选择取决于灵敏度的要求。较高的温度导致较深的颜色反应。3在562nm处比色读数，并做空白比较。4.用BSA作标准曲线。,Bicinchoninic Acid(BCA)法,优点 BCA法已经应用于蛋白质的分离和纯化中。此法对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。1灵敏度与福林酚法相似。微量BCA法的灵敏度（0.510ug）稍高于福林酚法。2一步混合的操作比福林酚法更简单。3所用试剂比福林酚法简单。4非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。5中等浓度的变性剂（4M盐酸胍或3M尿素）不对反应产生干扰。,Bicinchoninic Acid(BCA)法,缺点：1反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。2还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。3不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。4比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。,阴离子染色法,原理含蛋白质的样品溶于缓冲液中和已知的过量阴离子染色剂混和，蛋白质与染色剂形成不溶性复合物。反应平衡后，离心或过滤除去不溶性的复合物，再测定溶液中未结合的可溶性染色剂。,蛋白质 + 过量染色剂 蛋白质-染色剂复合不溶物 + 未结合可溶性染色剂 阴离子磺酸基染色剂，包括酸性十二号橙，橙G和酰黑10B，都可以和基本氨基酸残基中的阳性基团（组氨酸中的咪唑基、精氨酸中的胍基和赖氨酸中的-氨基等），以及蛋白质中游离的氨基酸终端基团结合.未结合的染色剂与样品中蛋白质的含量成反比,可用分光光度计法测定。,方法,1样品粉碎（60目或更小），加入过量的染色剂 。2剧烈摇晃内容物加速染色反应至平衡，过滤或离心去除不溶物。3测定滤液中未结合染色剂溶液的吸光度，从标准曲线中计算染色剂浓度。4通过对未结合染色剂浓度与样品的蛋白质总氮含量作图，得到一条线性的标准曲线。5与样品同类的未知样品的蛋白质含量可以根据标准曲线计算，或通过最小二乘法得到的回归方程计算。,应用,阴离子染色法已经用来测定牛奶及乳制品、小麦面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白质。AOAC中共有二种染色方法（使用酸性12号橙的方法967.12和使用酰胺黑10B的方法975.17）分析牛奶中的蛋白质。,优点,快速（10min或更短），费用便宜，结果相对比较准确。因为染色剂不与不可利用的赖氨酸结合，因此可用于测定谷物产品在加工过程可利用赖氨酸的含量，（而赖氨酸是谷物产品中的限制氨基酸，所以可利用赖氨酸含量代表谷物产品的蛋白质营养价值。）不用腐蚀性试剂 。不需测定非蛋白氮。,缺点,灵敏度低，需要毫克级的蛋白质。蛋白质因基本氨基酸不同而具有不同的染色容量，因此，对于待测食品需要制作标准曲线。因一些非蛋白组份结合染色剂（如淀粉）或蛋白质（如钙或磷）而造成最后结果的偏差。钙和重金属离子引起的问题可用含有草酸的缓冲试剂来解决。,考马斯亮兰染料比色法,原理 当考马斯亮兰G-250与蛋白质相结合时，染色剂会从红色变成蓝色，其最大吸收波长从465nm变化至620nm，在620nm处的吸光度与样品中蛋白质的浓度成正比。,方法,将考马斯亮兰G-250溶解于95%酒精中，并用85%磷酸酸化。含有蛋白质（1100ug/ml）的样品和标准BSA溶液分别与Bradford试剂混合。在595nm处读取吸光度并扣空白。样品中的蛋白质浓度可通过BSA的标准曲线来计算。,应用,已经成功用于测定麦芽汁、啤酒产品和马铃薯块茎中的蛋白质含量。此方法可改善测定微量蛋白质的结果。该法快速、灵敏，且比福林酚法较少受其他因素干扰，已广泛应用于蛋白质纯化过程中的含量测定。,优点,快速，反应可在2min内完成。重现性好。灵敏度高。不受阳离子如K+、Na+和Mg+等的干扰。不受硫酸铵干扰。不受多酚和碳水化合物干扰，如蔗糖等。可测定分子量大约等于或高于4000道尔顿的蛋白质。,缺点,受非离子和离子型去垢剂的干扰，如三硝基甲苯和十二烷基硫酸钠。而由于少量的（0.1%）去垢剂的存在而导致的结果偏差可用适当的控制来校正。 蛋白质-染色剂的复合物可与石英比色皿结合，分析人员必须使用玻璃比色皿。 反应颜色随不同种类的蛋白质而变化，因此，必须仔细地选择作为标准的蛋白质。,比浊法,原理低浓度（310%）的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙酸中的铁氰化钾能使提取的蛋白质沉淀形成蛋白质颗粒的悬浊液。其浊度可由辐射光传送过程中的衰减而确定，辐射光传送过程中的衰减是由于蛋白质颗粒的散射造成的，辐射光衰减的程度与溶液中的蛋白质浓度成正比。,比浊法,方法 测定小麦蛋白质的常规方法为磺基水杨酸法，具体方法如下所述： 1小麦面粉用0.05N氢氧化钠溶液萃取。 2溶于碱液的蛋白质从不溶性原料中离心分离。 3磺基水杨酸和蛋白质溶液混合。 4在540nm处测定其浊度，并扣去空白。 5蛋白质的含量可根据经凯氏定氮法校正过的标准曲线来计算。,比浊法,应用 比浊法已经用于测定小麦面粉和玉米的蛋白质含量。 优点：1快速，可在15min内完成。2测定结果不包括除了核酸外的非蛋白氮。 缺点：1不同的蛋白质沉淀的速率不同。2浊度随酸试剂浓度的不同而变化。3. 核酸也能被酸试剂沉淀。,杜马斯法（燃烧法）,原理 样品在高温下（700800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD）的气相色谱仪测定。测得的氮含量转换成样品中的蛋白质含量。,杜马斯法（燃烧法）,方法 样品（大约100500mg）称量后置于样品盒中，放入具有自动装置的燃烧反应器中，释放的氮气由内置的气相色谱仪测定。,杜马斯法（燃烧法）,应用 燃烧法适用于所有种类的食品，AOAC方法992.15和992.23分别用于肉类和谷物食品。 优点：1燃烧法是凯氏定氮法的一个替代方法。2不需要任何有害化合物。3可在3min内完成。4最先进的自动化仪器可在无人看管状态下分析多达150个样品。 缺点：1需要的仪器价格昂贵。2非蛋白氮也包括在内。,红外光谱法,原理 红外光谱法测定由食品或其他物质中分子引起的辐射吸收（近红外、中红外、远红外区）。食品中不同的功能基团吸收不同频率的辐射。对于蛋白质和多肽，多肽键在中红外波段（6.47um）和近红外(NIR)波段 (如33003500nm,20802220nm,15601670nm)的特征吸收可用于测定食品中的蛋白质含量。针对所要测的成份，用红外波长光辐射样品，通过测定样品反射或透射光的能量（反比于能量的吸收）可以预测其成份的浓度。,红外光谱法,应用 红外牛奶分析仪采用中红外光谱法测定牛奶蛋白质含量，同时近红外光谱仪也广泛应用于食品蛋白质的分析中（如谷物、谷类制品、肉类和乳制品中）。这些仪器非常昂贵,且必须经适当的调试。但分析人员只需经最低程度的培训就可以快速分析样品(30sec2min)。,氨基酸的测定方法,一、茚三酮比色法,原理氨基酸（酰氨键）在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据可以测定样品中氨基酸含量。,应用,常用来定性测定食品中蛋白质和氨基酸的存在。茚三酮法还没有广泛应用于食品中蛋白质的定量，然而可用来测定食品加工中多肽键的水解和氨基酸的定量。比较快速，但准确性较低，反应生成的颜色随不同的氨基酸化合物而变化。标准曲线必须针对每一个具体情况而准备。,二、甲醛滴定法,原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。,方法特点及应用,此法简单易行、快速方便。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。,操作方法,吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100ml容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加水60ml，开动磁力搅拌器，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液ml数（V10），供计算总含量。加入10.0ml甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积（V11）。,同时取80ml蒸馏水置于另一200ml洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至PH8.2，（此时不计碱消耗量），再加入10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。,结果计算,氨基酸态氮（%）= 式中：V1（V11-V10）样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（PH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml； V2空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，ml； c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/l； m测定用样品溶液相当于样品的质量.g； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol。,说明及注意事项,也可用双指示剂法指示终点。此法准确快速，适用于测定食品中游离氨基酸。 固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。若样品颜色较深或浑浊需用电位滴定法进行测定。,氨基酸的分离及测定,薄层色谱法氨基酸自动分析仪法气相色镨法液相色谱法,薄层色谱法,原理取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅可大致确定其含量。,氨基酸自动分析仪法,氨基酸的组分分析，现代广泛的采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。原理：利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的peyaH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；分子量小的比分子量大的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。定量测定的依据：氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。,氨基酸分析仪有两种，一种是低速型，使用300400目的离子交换树脂；另一种是高速型，使用直径46um的树脂。不论哪一种，在分析组成蛋白质的各种氨基酸时，都用柠檬酸缓冲液；完全分离和定量4046种游离氨基酸时，则使用柠檬酸锂缓冲液。但分析后者时，由于所用缓冲液种类多，柱温也要变为三个梯度，因此一般不能用低速型。,气相色谱法,原理将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色镨分析的衍生物三氟酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯化合用三氟乙酸酐（TFFAA）的酰化两各步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色镨分析。,液相色谱法,原理蛋白质样品经酸或碱水解后再用丹磺酰氯进行衍生化作用而溶解于流动相溶液中，采用C8反相柱的高压液相色镨仪分离并用荧光检测器进行测定，即可测定出各种氨基酸的含量。,方法的比较,样品的比较原理灵敏性速度,1样品的比较：,采用凯氏定氮法和红外光谱法则样品几乎不需要多加处理，20目或更小的颗粒一般都可以满足这些测定方法的要求，一些更新型的NIR仪能够直接测定不经磨碎或其他方法处理的完整的谷物，以及其他粗糙的颗粒产品。本章中介绍的其他方法则要求原料必须是微小的颗粒，以便于从复杂的食品体系中抽提蛋白质。,2原理：,杜马斯法和凯氏定氮法直接测定食品中有机氮元素的总量。其他方法测定蛋白质的各种性质，例如，双缩脲测定多肽键，福林酚法测定多肽键、酪氨酸和色氨酸，红外光谱法利用样品特别是多肽键经红外波长的光辐射时的能量吸收直接测定蛋白质含量。,3灵敏性：,凯氏定氮法、杜马斯法、双缩脲法和阴离子染色法的灵敏度低于紫外测定法、福林酚法、BCA法或Bradford法。,4速度：,在仪器经适当的调试后，红外光谱法可能是上述讨论过的最为快速的方法。在涉及到比色测定的方法中，在和显色试剂混合前，必须把蛋白质从干扰实验的不溶性物质中分离出来，或者在混和后从显色的蛋白质-试剂复合物中除去不溶性物质，但是比色法的测定速度还是快于凯氏定氮法。,特殊的注意事项,1针对具体的应用、灵敏度、精确度、重现性以及食品的物化性质来考虑选择适用的测定方法。2食品加工方法，如加热可能会减弱分析时蛋白质萃取的能力，从而在涉及萃取的步骤时会导致蛋白质含量的测定偏低。3.除了凯氏定氮法和紫外测定法，其他所有方法对纯化蛋白质的测定都需要使用标准或参比蛋白质，样品中的蛋白质必须与标准蛋白质具有相似的结构和性质,特殊的注意事项,4. 非蛋白氮存在于所有食品中。要测定蛋白氮，样品通常先要在碱性条件下萃取蛋白质，然后用三氯醋酸或磺基水杨酸沉淀。酸的使用浓度影响沉淀得率，因此，非蛋白氮的含量随所用试剂的种类和浓度而变化。加热能够帮助酸、乙醇或其他有机溶剂沉淀蛋白质。除了酸沉淀法用于非蛋白质的测定外，其他较少数方法如透析、超滤和柱色谱法也能从含少量非蛋白组分的物质中分离得到蛋白质。,特殊的注意事项,5.在测定食品蛋白质的营养价值如蛋白质消化率和蛋白质功效比（PER）时，凯氏定氮法采用6.25的换算系数来计算蛋白质的含量。如果相当数量的非蛋白氮存在于食品中, 测得的PER值就可能会偏低。如果食物样品中的非蛋白氮含量较高（特别是如果非蛋白氮不含许多氨基酸或者小肽），所得到的PER值可能会低于含有相似的蛋白质结构成份，但非蛋白氮含量较低的样品的PER值。,总结,本章介绍了基于蛋白质和氨基酸的特性来测定蛋白质的方法，其中杜马斯法和凯氏定氮法测定氮含量，双缩脲法和福林酚法利用铜-肽键的反应来分析，紫外280nm比色法、染色法、茚三酮法和福林酚法涉及到了氨基酸性质。BCA法利用蛋白质在碱性溶液中的还原性，红外光谱法则基于多肽对红外波长光辐射的吸收性质。不同方法的分析速度和灵敏度各不相同。不同食品体系的复杂性导致各种蛋白质分析方法都会有一些问题。通常都要使用经选择的蛋白质作为标准（如凯氏定氮）方法校正。,第三节 蛋白质的定量测定,关于氮-蛋白质换算等数,6.25,=,6.25,=,6.38,=,5.95,一、凯氏定氮法,常量凯氏定氮法 1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定, 消化,2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4,(NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点,加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂,加氧化剂 加速有机物氧化速度, 蒸馏,NH4+ + OH-,= NH3 +H2O,影响氨化完全和速度的因素,（1）K氏烧瓶和取样量（2）分解剂 1g样品 K2SO4： H2SO4 = 7g : 12ml 还有一种比例：K2SO4： H2SO4 = 10g : 20ml,用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定 指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿） 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸）, 吸收与滴定,反应式为： NH3+H3BO3=NH4+H2BO3- H2BO3-+H+=H3BO3, 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。,现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h后，估计消化完全，取出消化液加入少量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。,讨 论,大量的脂肪,振摇,大火加热,消化,2h后，估计消化完全,量NaOH,少,计 算,X =,X为样品中蛋白质的含量V1为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C为盐酸标准液的浓度MN为氮的摩尔质量W为样品的质量K为氮换算为蛋白质的系数,二、双缩脲法,150160,双缩脲,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物。,紫色络和物。,操作方法,1、制作标准曲线取10支干试管分成两组，按下表平行操作,取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。,2、样品测定取4支试管分成两组，按下表平行操作：,取两组测定的平均值计算：Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml）N为稀释倍数c为样品原浓度（mg/ml）。,3、计算,福林-酚法（双缩脲法的发展）,两步反应,(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质铜络合物。,(2)此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸(olin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。,杜马斯法（燃烧法）,样品在高温下（700-800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。,几种蛋白质测定方法比较,总氮量,蛋白氮,总氮量,蛋白氮,凯式定氮装置,分光光度计,高温装置、GC,分光光度计,浓硫酸,用量较少,不需要,福林-酚试剂,长,简单快速,3min,简单快速,其他方法,染色法,紫外吸收法,水杨酸比色法,采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算： 水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl当量浓度=0.1142N，1号样品所用的HCl溶液的毫升数=22.0ml，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5ml，空白的HCl溶液的毫升数=0.2ml，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。,第三节 氨基酸定量测定,一、甲醛滴定法,氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。,双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂,同时取两份样, +中性红，用NaOH滴定, +百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定,二、非水溶液滴定法,在水溶液中1、能溶解的物质有限，尤其是有机物质2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄3、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。,溶剂选择原则,1、不引起副反应2、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物3、应考虑溶剂的酸碱性 对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好 碱 碱,氨基酸的非水溶液滴定,1、选择冰乙酸作为溶剂,2、选择高氯酸进行滴定,三、电位滴定法,根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH 标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH 值判断和控制滴定的终点。,pH,8.2,9.2,测某样品中铁元素的含量，称样1.050g于坩埚中灰化，残渣用稀酸溶解后定容至100mL，吸取5mL样液于25mL容量瓶中显色、定容、测定，从标准曲线中查得样液中铁的含量为4.2g/mL，请问该样品中铁元素的含量为多少？,0.2%,在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg于100mL容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL进行测定，用0.05N氢氧化钠滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液7.0mL, 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2时，消耗标准碱液10.12mL,同法作空白实验，滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液0.08mL, 加入甲醛后滴定至pH9.2时，消耗标准碱液0.90ml。问该样品的氨基酸态氮含量？,0.301%,你 算 对 了 吗？,