第五章层析分离技术ppt课件.ppt

1,第五章 层析分离技术,In order to purify proteins, peptides and nucleic acids we need powerful techniques.,2,概念：层析技术(又称：色谱技术)是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,层析技术的原理,3,层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。,4,一、层析的原理,层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。,第一节 层析概述,5,6,二、层析的分类,按固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析,7,根据流动相的形式： 液相层析、气相层析,8,层析分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的层析方法：按机理分为：吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析,根据分离作用机理的分类,9,凝胶过滤,原理,吸附层析,疏水层析,分配层析,亲和层析,离子交换,10,三、层析基本操作过程,上样均一性 洗脱装置,目的不同 检测方法不同活性检测,基质均匀性柱层析的L/d比值,11,1、柱层析的L/d比值,12,2、洗脱装置,不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵,维持流速恒定的简易装置,13,改变溶剂系统,分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。,14,梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。,线性梯度洗脱装置,性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱,15,3、结果检测,活性检测 比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性,16,结果保存薄层层析&纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分仪变成数据柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理,17,4、层析装置的仪器化,HPLC,与微机、质谱等连用,18,四、层析前蛋白质处理,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,19,1、盐析法,盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。,20,2、等电点沉淀,在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。,21,3、有机溶剂沉淀,降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。,22,五、层析系统的基本概念及要求,Resolution Efficiency Selectivity Symmetry,23,层析分离的基本概念,分配系数可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度,24,层析分离的基本概念,滞留时间（tR）和滞留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一,25,层析分离的基本概念,洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,26,层析分离的基本概念,Resolution factor Rs,Resolution = Peak separation Peak width at height,分辨率（Resolution, Rs）,27,层析分离的基本概念,Resolution: depends on efficiency and selectivity,Efficiency: Is a measure of peak width High efficiency means sharp peaks High efficiency means a good packed column High efficiency can compensate for low selectivity,Selectivity: Is a measure of peak separation High selectivity gives baseline separations If selectivity is high, low efficiency can be tolerated (if large peak volume is acceptable).,28,层析分离的基本概念,色谱柱的理论塔板数N与高度H,N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽理论塔板高度：L-柱长,29,层析分离的基本概念,Efficiency depends on: Particle size of matrixParticle size distribution of matrixPacking quality of the columnSample (volume and viscosity)Flow rate,30,Resolution: the power to separate peaks,Maximum number of peaks in RPC 150,0 10 20 ml,Maximum number of peaks in gel filtration ca 15,Remember: we are not purifying peaks, but proteins & peptides !,层析分离的基本概念,31,一、原理,根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附解吸再吸附再解吸的过程，达到分离目的。无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。,第二节 吸附层析,32,机理:样品组分对固定相表 面吸附力不同进行组份分离吸附剂: Al2O3, SiO2(硅胶), 聚酰胺等吸附剂和洗脱剂的选择:物质极性 吸附活性 洗脱剂极性 强 小 强 弱 大 弱,33,常见的吸附类型及其主要特点,物理吸附： 吸附作用力为分子间引力、无选择性、无需高活化能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较快。化学吸附：吸附作用力为化学键合力，需要高活化能、只能以单分子层吸附，选择性强、吸附和解吸附速度较慢。,34,常用吸附剂:氧化铝 硅胶活性炭纤维素聚酰胺硅藻土,常用洗脱剂极性次序:石油醚环己烷CCl4甲苯CH2Cl2CHCl3乙醚醋酸乙酯正丙醇乙醇甲醇水,35,二、常用吸附剂种类,吸附剂通常应具备以下特征：对被分离的物质具有较强的吸附能力有较高的吸附选择性机械强度高再生容易、性能稳定价格低廉。,36,常用吸附剂,硅胶氧化铝聚酰胺活性炭大孔吸附树脂,37,1、硅胶,颗粒表面存在的很多硅酰基作为活性中心与所进行层析的化合物形成强的氢键作用硅酰基能够通过氢键的形成而吸附水分，并随着吸着的水分增加而降低吸附力,38,39,活化 加热至100110，除去硅胶表面因氢键所吸附的水分 当温度升高至500时，硅酰基脱水缩合转变为硅氧烷键，不再有吸附剂的性质再生 一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，110烘干活化处理,40,2、氧化铝,多孔的A1203的聚合物，吸附性能也可通过改变其含水量加以控制。,优点： 吸附容量较高、价格低廉等缺点： 具有催化性能。碱性条件下不稳定的化合物分离时容易发生诸如异构化、氧化和消除等次级反应,41,酸性氧化铝 pH值约为4.0，分离酸性化合物如羧酸类碱性氧化铝 pH值约为10.0，分离诸如生物碱类的碱性化合物中性氧化铝 pH约为7.0，分离相对非极性的化合物如类固醇,42,活化 200左右加温46小时再生 弃去柱顶端的加样部位后，依次用甲醇、稀乙酸、氢氧化钠溶液和水洗涤，再经高温(200)活化,43,3、聚酰胺,尼龙-6：己内酰胺聚合而成 尼龙-66：己二酸与己二胺聚合而成丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类以及硝基化合物等通过氢键结合而被吸附对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差应用：生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离,44,4、活性炭,吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱可分离水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物、氨基酸与肽、单糖与多糖目前，多用于在结晶过程中进行脱色和脱臭等操作中的简单吸附过程,45,活 性 炭（Active carbon）,46,粉末活性炭,47,锦纶活性炭,48,活性炭对物质的吸附规律,活性炭是非极性吸附剂，因此在水中吸附非极性溶质的能力大于有机溶剂中的吸附能力。针对不同的物质，活性炭的吸附遵循以下规律：（1）对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物（2）对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物（3）对相对分子量大的化合物的吸附力大于相对分子量小的化合物（4）pH 值的影响: 碱性 中性吸附 酸性洗脱 酸性 中性吸附 碱性洗脱（5）温度: 未平衡前 随温度升高而增加,49,5、大孔吸附树脂,六十年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，不含交换基团、具有多孔网状结构和较好的吸附性能的非离子型共聚物大孔吸附树脂同时兼有吸附性和筛选性，其吸附性是由于范德华力或氢键作用的结果，而筛选性是由于它具有多孔网状结构,50,树脂大孔网状吸附剂,特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳定；机械强度好；吸附速度快；解吸、再生容易。但价格昂贵，吸附效果易受流速以及溶质浓度等因素的影响。,51,非极性树脂 由偶极矩很小的单体聚合而成，不带任何功能基，适于从极性溶液中吸附非极性物质，主要依靠分子中亲脂键、偶极离子及氢键的作用中等极性树脂 含酯基，对于极性物质和非极性物质都具有吸附作用。极性吸附树脂 含酰胺基、腈基、酚羟基及含氮、氧、硫极性功能基。,52,53,大孔吸附树脂的吸附机理,非离子型共聚物，借助于范德华力从溶液中吸附各种有机物，其吸附能力与树脂的化学结构、物理性能以及与溶质、溶剂的性质有关。通常遵循以下规律：非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质；极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质；中等极性吸附剂兼有以上两种能力,54,吸附等温线,概念：当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。Langmuir吸附等温线 qo和K是经验常数，c代表溶液中溶质浓度蛋白质分离提纯时适合此吸附方程,55,Langmuir吸附等温线,56,影响吸附的主要因素,吸附剂的性质：比表面积、粒度大小、极性吸附质的性质：对表面张力的影响，溶解度，极性，相对分子量温度：吸附是放热过程，吸附质的稳定性溶液pH值：影响吸附质的解离盐浓度：影响复杂，要视具体情况而定,57,常用的解吸方法,低级醇、酮或水溶液解吸 原理：使大孔树脂溶胀，减弱溶质与吸附剂间 的相互作用力碱解吸附 原理：成盐，主要针对弱酸性溶质酸解吸附原理同上水解吸附 原理：降低体系中的离子强度，降低溶质的吸附量,58,常用的吸附单元操作方式,间歇吸附 依据是吸附等温线和物料衡算方程连续搅拌吸附固定床吸附 柱式塔 穿透点,59,一般吸附层析的操作程序,根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物,60,第三节 分配层析,原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数K不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相K= 影响因素： 溶剂、溶质、温度、压力等,固定相中溶质的浓度,流动相中溶质的浓度,61,第三节 分配层析,载体：通常为多孔性惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：滤纸硅胶硅藻土纤维素葡聚糖凝胶,纸层析,薄层层析气相层析液相层析,62,原理：分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。固定相 极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等） 能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，呈不流动状态流动相 非极性的有机溶剂,63,分配系数(a) 指在一定温度和压力条件下物质在固定相和流动相两部分浓度达到平衡时的浓度比值。,分配系数较大的物质 分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移动较慢分配系数较小的物质 移动速度较快。,64,一、纸层析,载体滤纸固定相：滤纸纤维的结合水（6%左右）流动相：有机溶剂分离原理：分配系数不同，导致各物质移动速率Rf不同，从而达到分离的目的。,65,移动速率Rf的影响因素,分离物质的结构和极性滤纸型号层析展开溶剂系统pH值温度展开方式样品溶液中杂质,66,纸层析的操作过程,样品处理点样平衡展开显色定性、定量分析,67,双向纸层析法,几种成分在一个溶剂系统中层析所得Rf值相近，不易分离清楚，可采用双向纸层析。在第一次层析后将滤纸吹干逆转90角，再采用另一种溶剂系统进行第二次层析,68,氨基酸双向纸层析图谱,69,二、薄层层析,薄层层析的分离原理与操作过程与纸层析相似支持板：通常是玻璃板流动相：二元或多元溶剂系统固定相：硅胶、硅藻土、纤维素、聚酰胺等优点：速度快，1530 min；分辨力高，比纸层析高100倍；温度、压力影响小；缺点：Rf重现性略差,70,薄层层析常用支持物的主要用途,71,第三节 分配层析,HPLC、GC等,72,第四节 离子交换层析,原理：依据物質所帶阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交換剂有不同的亲和力，改变沖洗液的离子強度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出來,R+A- + B- R+B- + A-,73,离子交换层析的特点,Useful at all stages of purification and at all scalesControllableHigh selectivityHigh capacityConcentratingHigh recovery,74,原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。应用：离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。,75,高分子聚合物基质、配基和平衡离子,平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用,76,H值的影响,77,离子取代顺序,78,离子浓度影响,离子浓度增加,79,80,常用的离子交换载体系列,离子交换树脂系列阳离子交换树脂，阴离子交换树脂离子交换葡聚糖凝胶系列 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25离子交换纤维素系列 DEAE-Sephacel Cellex系列 离子交换琼脂糖系列 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow，Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,81,离子交换树脂的结构,具有三维空间立体结构的网络骨架联接在骨架上的活性基团活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）,82,树脂的网络骨架,83,离交树脂三维空间立体结构,84,离子交换的分类,按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基团）和阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳 强阴、弱阴,85,离子交换的一般过程,86,常用的离子交换树脂,强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；,87,新型离子交换树脂,大孔离子交换树脂 大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔吸附剂合成后（加入致孔剂），再引入化学功能基团，便可得到大孔离子交换树脂,88,大孔离子交换树脂的优点,通过在合成时加入惰性致孔剂，克服了普通凝胶树脂由于溶胀现象，产生的“暂时孔”现象，从而强化了离子交换的功能；减少了凝胶树脂在离子交换过程中的“有机污染”现象（大分子不易洗脱）；可以通过致孔剂选择调整孔径大小、树脂的比表面积，以适应不同的分离要求。常用的致孔剂有：良溶剂（能与单体互溶的）甲苯、四氯化碳；不良溶剂 长链醇（碳4-10） 煤油；高分子聚合物 聚苯乙烯、聚丙烯酸酯,89,其它离子交换树脂类型,两性树脂：同时含有酸、碱两种基团的树脂；均孔型离子交换树脂：主要是阴离子型凝胶离子交换树脂，孔径均匀，交换容量高、机械强度好；螯合树脂：树脂上含有具有螯合能力的集团，既可以形成离子键，又可以形成配位键；主要用于脱除金属离子；*多糖基离子交换树脂：固相载体为多糖类物质，亲水性强、交换空间大、对生物大分子物致变性作用,90,离子交换树脂命名法中分类代号和骨架代号,91,离子交换树脂的命名方法,92,离子交换树脂的制备,加聚法和缩聚法（依聚合方法分类）加聚：指具有一个或一个以上双键的单体为原料，在分散相中进行聚合缩聚法是基于缩合反应的聚合过程；共聚法和均聚法（以单体分类）共聚是指两个或两个以上的单体进行聚合均聚是指以一种单体进行聚合,93,几种主要的离子交换树脂制备方法,苯乙烯型离子交换树脂 单体：苯乙烯、二乙烯苯 酸性树脂引入磺酸基，碱性树脂引入季 铵，伯、叔胺酚醛树脂 单体：水扬酸、苯酚、甲醛经缩聚而成,94,离子交换树脂的理化性能,外观：球形、浅色为宜，粒度大小为1660目90%；机械强度：90%；含水量：0.30.7g/g 树脂；交换容量：重量交换容量、体积交换容量、工作交换容量或称表观交换容量（在某一条件下）；稳定性：化学稳定性、热稳定性；膨胀度：交联度、活性基团的性质与数量、活性离子的性质、介质的性质和浓度、骨架结构；湿真密度：单位体积湿树脂的重量；孔度、孔径、比表面积,95,影响离子交换树脂选择性的因素,水合离子半径：半径越小，亲和力越大；离子化合价：高价离子易于被吸附；溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；离子强度：越低越好；有机溶剂：不利于吸附；交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； 树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；,96,离子交换纤维素 树脂骨架为纤维素分类：根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高。常用的离子交换纤维素有： 甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素、二乙基氨基乙基纤维素,97,DEAE anion exchanger,98,CMC Cation Exchanger,99,离子交换纤维素,100,常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素）,开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。 回收率高,优点：,101,葡聚糖凝胶离子交换树脂骨架为葡聚糖凝胶，如Sephadex，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂命名方法：交换活性基团+骨架+原骨架编号特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂：CM-sephadex C-25、DEAE-sephadex A-25等,102,常用离子交换葡聚糖凝胶,103,优点：,不会引起被分离物质的变性或失活非特异性吸附少交换容量大,离子交换葡聚糖的选用：,一般根据蛋白质的分子量而定中等分子量（30000-200000）一般选A50和C50低分子量（30000）和高分子量（200000） 均宜选用A25和C25。,104,琼脂糖离子交换剂,105,优点：,对pH及温度的变化均较稳定，可在pH310和070范围内使用改变离子强度或pH时，床体积变化不大流速快，分辨率高特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离。,106,高分子聚合物基质、配基和平衡离子,离子交换剂的基本组成：,107,四、离子交换层析法的基本操作,108,1、离子交换剂的选择,配基的选择 取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。 一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。,109,基质的选择,110,颗粒大小,111,2、离子交换剂的处理,酸碱浸泡 进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。,膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。,水悬浮去除杂质和细小颗粒,112,3、缓冲液的选择,保证各个待分离物质的稳定；使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。,离子强度和pH,113,4、层析柱的选择,亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大 增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。,114,采用离子强度较大的梯度洗脱 选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为1520cm。,115,5、上样,样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。上样量要适当，不要超过柱的负荷能力，通常上样量为交换剂交换总量的1-5。,116,6、洗脱,改变溶液的pH或改变离子强度 当使用阴离子交换剂时，增加盐离子浓度，则降低pH值。 当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高pH值 亲和洗脱 目的蛋白与加入离子发生特异性相互作用而被置换添加置换剂 能置换基质上所有蛋白质洗脱方法 阶段洗脱和梯度洗脱,117,7、洗脱速度,洗脱速度通常要保持恒定洗脱速度慢比快的分辨率好如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。,118,8、洗脱液的监测收集及组分鉴定,监测 用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收收集 用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等,119,9、离子交换剂的清洗、再生和保存,可溶于碱的污染物 0.1 mol/L NaOH洗涤 Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤 结合缓冲液洗涤可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。对于疏水性污染物 乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤可以除去脂类和其他的疏水性物质。,120,金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCL（即pH=2）处理柱子沉淀物杂质 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。,121,再生 对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。 酸碱交替浸泡保存 处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02 %的叠氮钠，4C下保存。,122,离子交换层析操作的基本步骤,平衡上样吸附洗脱再生,123,Equilibration,124,125,126,127,Sampleapplicationand wash,Elution,Equilibration,Regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,128,第四节 离子交换层析,129,130,131,第四节 离子交换层析,Expanded Bed,132,五、离子交换层析应用实例,阴离子交换层析 从人血浆中分离得到血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG),133,用DEAE-Sepharose CL-6B柱大量分级人血浆蛋白,134,阳离子交换层析 用CM纤维素分离鸡蛋清中的蛋白质组份,135,表 鸡蛋清中一些蛋白质用CM纤维素分离结果的分析,136,第五节 凝胶层析,又称凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析20世纪50年代末期发展起来的一种快速而又简便的分离技术，不需要再生处理就可反复使用；适用于分离不同相对分子量的各种物质；操作方便；实验室和工业中广泛应用。,137,一、凝胶层析基本原理,凝胶层析柱中装有多孔凝胶，混合各组分的溶液流经凝胶时又两种不同的运动：垂直向下的移动和布朗运动大分子物质分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布在凝胶颗粒的空隙中，以较快的速度流过凝胶柱小分子物质能进入凝胶内，不断地进出一个个颗粒的微孔内外，向下移动速度因而慢于大分子的速度各组分按照分子质量又大到小的顺序先后流出层析柱分子量不是唯一分离依据，分子形状、各物质与凝胶间的非特异性吸附作用也影响分离,138,凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离。,139,优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差,140,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。,141,大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱,142,143,1、体积参数,分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。Kd(Ve一Vo)Vi,144,145,Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中， 因而洗脱速度最快。即该成分的Kd0。ViVe-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部, 因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低一般物质的Kd值是0Kd l。,洗脱行为可以有三种可能的情况:,146,147,2、影响分离效果的因素,流速加样体积样品浓度离子强度,148,影响洗脱液流速的因素,洗脱液加在柱上的压力 为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。凝胶交联度凝胶颗粒大小,149,流速过低 样品横向扩散增大，峰变宽，分辨率降低，洗脱时间长流速过高 洗脱峰重叠，柱压增大，分离效果变差线性流速控制在210cm/h,150,加样体积,体积过大 平台洗脱峰或相邻峰重叠体积过小 目的蛋白收集量少、稀释倍数大、浓度低,151,样品浓度,进样前，样品应高度浓缩，浓度为1020mg/ml分组分离&脱盐除杂 适当提高样品浓度分级分离&分析性实验 浓度低,152,离子强度,可防止蛋白质与蛋白质之间或与凝胶介质之间的相互作用常用盐溶液： 20-100mmol/L NaCl浓度过高 引起凝胶柱床体积变化,153,二、凝胶过滤的介质,葡聚糖凝胶Sephadex G-系列聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列琼脂糖凝胶Sepharose系列Superose系列多硅胶,154,葡聚糖凝胶,以微生物产生的葡聚糖Dextran为原料用环氧氯丙烷为交联剂，在碱性条件下交联而成商品的凝胶，称为SephadexSephadex G-X X-为单位重量凝胶吸水值的10倍。 反应了凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。,葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性,156,157,琼脂糖凝胶,较常用的是Pharmacia和BioRad两家的产品，前者生产的称为Sepharose，后者的产品为BioGel A。BioGel A 系列的产品有不同的颗粒度，有粗、中和细三档，它们的颗粒度分别为l50m300 m，80m150m和40m80m 。,158,159,聚丙烯酰胺系列,一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成的凝胶。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为Sephacryl或Bio-Gel P。,160,161,162,多孔硅胶,优点： 物理化学稳定性高，耐热耐压，使用寿命长缺点： 柱效较低 、表面具有离子性，对蛋白质有吸附性、不能在强碱性环境中使用,刚性亲水性填料，具有一定直径的多孔网状结构的球状颗粒,163,三、基本操作,凝胶的选择 凝胶柱的制备 上样洗脱凝胶柱的重复使用与保存,164,1、凝胶的选择,分组分离 根据样品中的大分子和小分子分配系数上的显著差异，将其分开。 可选用Sephadex G-25和G-50 小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。,165,分级分离 将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离。 选用分级范围较窄的凝胶，且中间值 接近于目的蛋白的分子量,166,颗粒大小的影响,167,2、凝胶柱的制备,用于分组分离 短而粗 L/D值10 用于分级分离 L/D值比较大 对很难分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在15cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。,柱L/D值的选择,168,装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，以检测凝胶柱的均匀程度。,169,3、上样,粘度因素 粘度过大，分子因运动受限制，影响进出凝胶孔隙，洗脱峰形宽而矮，有些可分离的组分因此重叠。分级分离 加样体积约为凝胶柱床体积的15左右分组分离 加样体积约为凝胶柱床体积的1025,170,4、洗脱,水 分离不带电荷的中性物质电解质溶液（酸、碱、盐的溶液 ） 分离带电基团的样品水与有机溶剂的混合液（水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮） 用于吸附较强的组分,洗脱液,171,5、凝胶柱的重复使用与保存,当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可以加入新的样品，继续使用。保存液相中保存：于凝胶悬液中加入防腐剂或高压灭菌后 4保存。在半收缩状态下保存：60%-70%酒精液洗冲，凝胶体 积缩小干燥状态保存：长期不用，水洗净后，用含乙醇的水 洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的 乙醇,172,四、凝胶层析的应用,脱盐分离提纯测定高分子物质的分子量高分子溶液的浓缩蛋白质复性研究,173,1、脱盐,高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。优点： 操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性适用的凝胶： SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6,174,蛋白质不会因为脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,175,2、分离提纯,凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规格。每种规格都有其特定的分级的范围，一旦超出分组范围，不论是其上限还是下限，即使分子量有大有小，但载体的排阻情况基本相同，就不能分离。在凝胶过滤层析时，要根据所要纯化的样品的分子量选择所用的凝胶过滤的基质。,176,天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离,177,178,3、测定高分子物质的分子量,179,洗脱液中蛋白质浓度,180,181,4、高分子溶液的浓缩,182,5、蛋白质复性研究,183,凝胶层析操作过程,装柱 a.人手操作选择好粗细均匀，一定直径和一定高度的层析柱在柱的底部放置一层玻璃纤维或者棉花，柱内先充满洗脱剂一边搅拌一边缓慢而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，直到到达所需的高度 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9）,184,凝胶层析操作过程,上柱：将欲分离的混合溶液加入凝胶层析柱的过程。 分析用量：柱床体积的12% 制备用量：柱床体积的2030%洗脱 洗脱液体积一般为凝胶床体积的120左右收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪,185,操作要点,1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。,186,凝胶柱的重复使用与保存,当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4保存。此法至少可以保存半年以上。用完后，以水冲洗，然后用60%70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于6080干燥后保存。,187,第六节 亲和层析,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,188,一、原理,亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。分离原理 通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。,189,亲和层析,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,190,重组蛋白 用基因工程的方法引入特殊结合位点（如金属结合位点），将其加在重组目的蛋白的氨基端或羧基端 。 紧邻结合位点的位置加入蛋白酶切割位点，以便在用亲和层析纯化之后，将多余的蛋白质片段去掉 。,191,192,二、亲和层析用基质,具有较好的物理化学稳定性能够和配体稳定的结合结构为均匀的多孔网状结构与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附,193,1、各类基质优缺点,19