原核蛋白表达与纯化ppt课件.ppt
The key of Prokaryotic protein expression and purification,北京全式金生物技术有限公司：400-898-0321,原核表达概述 原核表达策略选择表达结果验证常见问题与实验例,上篇 原核表达,原核表达原理概述表达载体表达菌株表达条件,原核表达概述,原核表达原理概述,表达载体,目的基因,重组载体,表达菌株,“基因载体菌株培养”,培养，诱导,构建,转化,表达载体,启动子 融合标签 常用表达载体系统,常见启动子 pL启动子：热诱导启动子 trp启动子：化学诱导启动子 trc启动子：trp+lac杂交启动子 tac启动子：trp+lacUV5杂交启动子；pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）T7/T7lac启动子：pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）,T7启动子,T7lac启动子,融合标签,常用于蛋白检测与纯化。 有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。,N端融合：易于构建。终止密码子来自载体/基因表达量高提前终止会干扰纯化二级翻译起始不影响纯化,C端融合：构建时注意避免移码基因不能自带终止密码子提前终止不影响纯化二级翻译起始会干扰纯化,常用融合标签 HisTagpET系统 GSTTagpGEX系统 MBPTagpMal系统,常用表达载体系统,表达菌株,稀有密码子不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。,表达条件,乳糖操纵子与诱导物 常用表达条件的优化,乳糖操纵子与诱导物,1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统 Guarante L, Roberts TM, Ptashne M. A technique for expression eukaryotic genes in bacteria. Science, 1980, 209: 14281430 启动子Plac + 操纵基因lacO + 结构基因 lacI负调控： 阻遏物lacI与操纵基因lacO结合，抑制表达 IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达 cAMP-CAP正调控 cAMP结合并激活CAP，起始转录，实现正调控 葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为cAMP，无cAMP-CAP，无转录,常用表达条件的优化,培养基组分 温度 IPTG浓度 OD值 培养体积与溶氧量,根据实验目的选择表达策略载体选择感受态细胞选择表达条件,原核表达策略选择,根据实验目的选择表达策略,明确实验目的选择表达载体选择表达菌株优化表达条件,实验目的表达策略活性分析可溶表达制备抗原包涵体高纯度融合标签结构研究天然蛋白,选择表达载体,选择表达菌株,毒基因：基因表达产物即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）,Page Down,Page Up,BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶菌酶的严谨调控机制,优化表达条件,葡萄糖：抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性IPTG浓度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性lac透性酶(lacY1)突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖的诱导：Tuner，OrigamiB，Rosetta其他因素：菌体密度Mg2+培养体积与通气,ArtMediaTM Protein Expression（AM PE）,葡萄糖抑制cAMP形成，无cAMP-CAP，不能正调控乳糖操纵子，因而无法利用乳糖，使得大肠杆菌优先利用葡萄糖 AM PE中含有特定配比的葡萄糖与乳糖，利用该机理，使得葡萄糖耗尽开始摄入乳糖时，控制细菌恰好生长到适合诱导的阶段（对数期），利用乳糖代谢，启动自动诱导！ 无需监控菌体生长，实现自动诱导 无需加入IPTG，对细菌生长无抑制 细胞密度高，蛋白产量高 应用于一切乳糖操纵子表达系统：pET、pGEX、pMal、pEASY,4,1,2,3,pET28a,30 kDa1：ArtMedia 2：LB 3：LB+0.2% Glucose4：SOB,载体：pEASY-E1蛋白：70 kDa菌株：Transetta(DE3)Lane 1: LB培养基，对照Lane 2: LB培养基，IPTG诱导Lane 3: AM-PE自动诱导,载体：pGEX-5X-3蛋白：70 kDa蛋白：30kDa菌株：BL21Lane 1: LB培养基，IPTG诱导Lane 2: AM-PE自动诱导Lane 3: LB培养基，对照,1,2,3,1,2,3,表达定位,表达结果验证,表达定位,菌液,离心,菌体,细胞总蛋白,培养基组分,悬菌，渗透压休克,菌体,细胞周质组分,悬菌，裂解，离心,胞质可溶组分,沉淀,溶解，离心,胞质不溶组分,沉淀,沉淀,上清,全菌,可溶表达,沉淀,上清,全菌,包涵体,常见问题与实验例,无表达或表达量低蛋白不可溶蛋白纯化障碍,无表达或表达量低,载体-菌株搭配不当摸索最佳的组合,无表达或表达量低,稀有密码子 影响：翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达 应对：在宿主中补充稀有密码子的tRNARosetta系列菌株（Novagen公司）,1：BL21(DE3)； 2：Rosetta(DE3) ； 3：BL21(DE3)pLysS,目的蛋白,M,1,2,3,无表达或表达量低,毒基因 影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无表达 应对：严谨调控启动子，抑制本底表达选择特殊的载体（pETcoco）选择特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE ）优化培养条件与诱导表达条件包涵体表达,1,2,3,pET28aLane 1：Rosetta(DE3) Lane 2：BL21(DE3)pLysSLane 3：BL21(DE3),蛋白不可溶,成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。 定位：可溶蛋白胞质，细胞周质，胞外（培养基） 包涵体胞质，细胞周质 特点：可溶蛋白天然构象，正确折叠，具有生物活性包涵体高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解,增加可溶表达,1,2,3,Lane 1：37Lane 2：30Lane 3：25,1,2,pET,pGEX,促进包涵体形成 目的高浓度，高纯度毒基因表达免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽） 手段胞质表达提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc）特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)）,蛋白纯化障碍,表达纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解下篇详述,纯化策略选择 亲和层析与离子交换层析 层析方法的组合与顺序 包涵体纯化与复性,下篇 蛋白纯化,根据蛋白自身特点选择纯化方案常用实验流程,纯化策略选择,蛋白自身特点,可溶/包涵体 融合标签表面净电荷分子量其它特点,可溶/包涵体,可溶蛋白无需变性步骤适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法包涵体需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤适用于某些亲和层析方法（6HisTag）、离子交换层析不适用于某些亲和层析方法（GSTTag、 MBPTag ）不适用于凝胶过滤层析等方法,融合标签,表面净电荷与蛋白质等电点、溶液pH值密切相关离子交换层析的重要标准,分子量天然构象下，蛋白分子正确折叠，近似球形，大小与分子量成正比凝胶过滤层析的重要标准,其他特点利用蛋白质本身的特点进行亲和层析耐热蛋白可用热变性法进行纯化,常用实验流程,菌体裂解蛋白预处理层析纯化,菌体裂解,避免蛋白质降解低温蛋白酶抑制剂,蛋白质预处理(可溶),初分离/粗纯 DNA去除 热变性（对耐热蛋白）交换Buffer (NH4)2SO4沉淀 透析,蛋白质预处理(包涵体),洗涤 变性溶解,1,3,Lane 1：洗涤前Lane 2：洗涤Lane 3：洗涤后,2,层析纯化,选择适当层析方法 亲和层析 离子交换层析 凝胶过滤层析,亲和层析,利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。 特异性 酶底物 抗原抗体 配体受体 可逆性 改变条件可以使结合解除,金属螯合层析6HisTag纯化,基本原理与特点常用纯化流程 常见问题与技巧,基本原理与特点,利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。 Ni-Beads 基质：琼脂糖凝胶 侧链：NTA、IDA 配基：Ni2+,Ni2+与组氨酸形成配位键,Ni-NTA,Ni-IDA,常用纯化流程,样品处理 装柱，平衡 上样 洗涤与洗脱 再生,常见问题与技巧,蛋白不结合 无标签构建有误、提前终止（C端）、二级翻译起始（N端） 测序，重新构建 标签未暴露变性不充分，天然蛋白折叠 充分变性 结合条件不合适螯合剂、还原剂、咪唑、pH值 螯合剂EDTA0.1 mM（忌用） 还原剂DTT1 mM（不推荐）-ME20 mM（慎用） 咪唑 20 mM（因蛋白而异）,1-S,1-FT,2-S,2-FT,样品1：0.5 mM EDTA样品2：无EDTA,蛋白杂带多 洗脱条件不合适咪唑浓度、pH值 梯度洗脱 非特异性结合 上调初始咪唑浓度 -ME 非离子型去垢剂、甘油、NaCl 蛋白不完整蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（C端） 低温，蛋白酶抑制剂 重新构建 填料过多,无初始咪唑,10 mM 初始咪唑,填料过多,无-ME,有-ME,N端融合,C端融合,蛋白提前洗脱 洗脱条件不合适咪唑浓度、pH值 改变洗脱条件 蛋白结合能力弱 下调初始咪唑浓度,蛋白洗脱无检出 洗脱条件不合适咪唑浓度、pH值 增加洗脱强度 蛋白结合能力强 上调初始咪唑浓度 蛋白浓度低 Western Blot 优化表达 蛋白未结合或被提前洗涤 电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱,S,FT,Wash,Elute1,Elute2,Elute3,Elute4,Elute5,咪唑浓度：Lane S：10 mMLane Wash ：20 mM Lane Elute15：40 mM, 80 mM, 120 mM, 160 mM, 200 mM,GST标签基本原理与特点,GST：Glutathione S-transferase，谷胱甘肽S-转移酶填料：固定于基质的谷胱甘肽原理： GST与谷胱甘肽的特异性结合（酶与底物）洗脱：还原型谷胱甘肽特点（以pGEX系统为例）N端融合有助正确折叠，多为可溶表达不适用于变性条件的纯化标签可以切除填料没有理想的再生方法,GST,GST 融合蛋白,10 mM Glutathione,离子交换层析,离子交换层析原理 离子交换层析分类 离子交换层析特点,离子交换层析原理,离子交换层析分类,按活性基团分 阴离子交换剂：DEAE、Q 阳离子交换剂：CM、S、P11按基质材料分 离子交换树脂 离子交换纤维素 离子交换葡聚糖：Sephadex 离子交换琼脂糖：Sepharose,离子交换层析特点,原理：待纯化物质与填料的静电作用洗脱：离子强度，pH值特点无需融合标签，理论上可纯化任何蛋白适用于天然或变性条件的纯化需要灵活调整pH值与离子强度填料可用高盐浓度简单再生,S,FT,Wash,Elute1,Elute2,Elute3,Elute4,填料：P11目的蛋白20 kDa，pI=9.02平衡缓冲液pH7.4, 20 mM KCl,需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序。例如：His蛋白纯化时，要小心Buffer中螯合剂（EDTA）与还原剂（DTT）的影响而进行离子交换纯化时，则必须考虑Buffer与样品的pH值和离子强度，尤其是细菌裂解后，细胞内物质的释放对pH值与离子强度的影响硫酸铵沉淀与透析的搭配使用包涵体蛋白的变、复性与纯化,纯化方法的组合,以某蛋白质为例，组合不同的纯化方法pI/MW: 6.31 / 75 kDa，pET28a/BL21(DE3)方法1：确认表达裂解菌体、离心保留上清His纯化 ，确认纯化效果 合并目的蛋白，透析 DEAE纯化 ，确认目的蛋白 合并目的蛋白方法2：确认表达裂解菌体、离心保留上清硫酸铵沉淀、溶解、透析DEAE纯化 ，确认目的蛋白His纯化 ，确认纯化效果 合并目的蛋白，透析 合并目的蛋白,DEAE,Ni-NTA,DEAE,Ni-NTA,包涵体洗涤 包涵体变性与纯化 包涵体复性,包涵体纯化与复性,包涵体洗涤,目的：去除沉淀中的杂质，粗纯化包涵体蛋白 沉淀：包涵体细胞膜碎片+膜蛋白杂蛋白（氢键/二硫键/疏水作用/静电结合） 洗涤buffer2 MUrea1%Triton X-100（中性去垢剂）1 mMDTT0.1 mMEDTA0.5 MNaCl,包涵体洗涤,正常现象 上清有较浅颜色或基本透明 沉淀量没有明显减少或略有减少 异常现象 上清颜色较深或半透明；沉淀量明显减少 原因：目的蛋白（包涵体）可能被洗涤Buffer溶解 对策：保留上清，电泳验证。调整洗涤Buffer组分，减少洗涤次数 洗涤效果好坏，直接影响包涵体纯化的纯度！,1,3,Lane 1：洗涤前Lane 2：洗涤Lane 3：洗涤后,2,包涵体变性与纯化,包涵体变性原理 变性溶解：变性溶解 包涵体成因：未正确折叠导致不溶 解决手段：变性即解链，解链即可溶 彻底变性与否，是包涵体纯化的关键,变性方法 变性剂尿素/盐酸胍8 M/6 M 助溶剂SDS0.5% 还原剂DTT/-ME pH磷酸钠系统8.0 其它助溶手段：加热/极端pH值,变性剂比较,二硫键与还原剂对变性的影响 二硫键 2个SH基被氧化而形成 有助于蛋白质正确折叠 阻碍包涵体的彻底变性（溶解） 还原剂：DTT/-ME 可将二硫键还原 通常辅助尿素、SDS使用,还原剂比较,包涵体复性,复性方法 稀释复性 透析复性 柱上复性 蛋白与填料结合或在填料中移动，减少了复性过程中聚集形成沉淀的可能,复性技巧 低温，低浓度 缓慢去除变性剂 氧化/还原环境 助溶剂：甘油 中性pH值，适当离子强度,谢 谢！,
