五章透射电子显微镜生物样品制备技术(共53张).pptx

五章透射电子显微镜生物样品制备技术(共53张PPT),五章透射电子显微镜生物样品制备技术(共53张PPT),优选第五章透射电子显微镜生物样品制备技术,第2页，共53页。,优选第五章透射电子显微镜生物样品制备技术第2页，共53页。,第一节 透射电子显微镜 生物样品的 超薄切片制备技术,第3页，共53页。,第3页，共53页。,透射电镜的样品制备技术，主要有超薄切片技术、负染色技术和冷冻蚀刻复型技术。 超 薄切片样品制作技术，是透射电镜生物医学样品制备的最常用技术，其制作程序和石蜡切片的方法步骤基本相同，但是在所使用的某些化学试剂及切片机是完全不同的，对各技术步骤的操作要求要比石蜡切片严格很多。一个能满足透射电镜观察要求的超薄切片应具备以下几点： 1、切片厚度均匀，厚度在5070nm. 2、切片无划痕、无震颤、无人工污染。 3、耐高真空，在真空中不变形、不升华。 4、耐电子束的轰击。,第4页，共53页。,第4页，共53页。,根据上述要求，制作一个合格的超薄切片需要经过以下步骤：取材、固定（双固定）、清洗、脱水、置换、浸透、包埋、聚合、修块、超薄切片、捞片、电子染色。 由于透射电镜是观察研究组织或细胞内的超微结构，也就是主要研究细胞器的内部结构，它对观察样品的要求十分严格。所以在样品的制备过程中一定要慎重的对待每一操作步骤，否则会造成实验结果的失败。因为有很多材料不能重复取材（如人的病理组织），所以一旦结果不好或失败， 是不可彌补的。,第5页，共53页。,根据上述要求，制作一个合格的超薄切片需,一、取材 从动、植物体上获得所需实验材料的过程叫取材。 1、取材的方法动物和植物的取材方法稍有不同。动物组织的取材：取动物材料时需要先处死动物，然后要在尽短的时间内（要求在分钟之内）把所需要的组织取出放入预冷（ 40C ）的固定液中，稍加固定后再切成适当大小的块(要求立方毫米大小）；植物组织的取材：植物材料可直接切成适当大小的块，放入预冷的固定液中，,第6页，共53页。,一、取材第6页，共53页。,如果材料漂在液体上面，需抽气让组织沉到液体的底部，以便使组织得到充分的固定游离细胞的取材：悬液培养的细胞需要离心获得细胞的沉淀物，然后再用预冷的固定液进行固定处理；贴壁培养的细胞要先想办法收集细胞团再进行固定处理。细菌的取材：取材方法基本和培养细胞的方，法相同。悬液培养的要离心获得细菌沉淀物进行固定，平板和斜面培养的可直接获得菌团进行固定。人体病理组织的取材：需提前做好准备，到手术室取材。,第7页，共53页。,如果材料漂在液体上面，需抽气让组织沉到液体的底部，以便使组,2、取材的注意事项 1）、取材的全过程要求在冷（40C ）的环境中进行，所用的液体要提前进行预冷。 2）、切割样品时要采取一刀切开的方法，不能用拉锯式切割法，尽量减少对样品的机械损伤。 3）、样品的块要小，要求是1个立方毫米。这样可使样品在较短的时间内得到充分的固定。 4）、如果所取样品的表面有污染物，动物材料要用冷的生理盐水洗；植物材料可用无离子水或自来水洗，但清洗的时间一定要短。,第8页，共53页。,2、取材的注意事项第8页，共53页。,二、固定 用物理或化学的方法迅速杀死细胞的过程叫固定。 1、固定的目的：保存细胞的精细结构，防止组织细胞的自溶；保护样品使其组成物质在以后的清洗、脱水和包埋过程中不至溶解和丢失，并使组织适度硬化，防止切片的变形。 2、固定的方法：有物理固定法和化学固定法。 1）、物理固定法：用高温、冷冻、干燥等物理手段，使细胞结构固定，一般不用。 2）、化学固定法：用化学物质对细胞结构进行固定，是常用的方法。,第9页，共53页。,二、固定第9页，共53页。,化学固定又可分为： （1）、单一固定法。即对样品只用一种固定剂进行固定，这种方法只是在一些特殊要求的样品制备中使用（如电镜细胞化学样品制备时），常规制样一般不使用。 （2）、双重固定法。用两种或两种以上的性质不同的固定剂对同一种样品进行固定，这种方法是最常选用的。它可以相互彌补固定剂各自的不足，使细胞内的各种结构都得到充分的固定。 （3）、原位固定法。主要用于动物深层组织取材过程中使用的方法，可以防止细胞的自溶。 （4）、灌流固定法。也是在动物组织取材时选用的一种临时固定方法，从动脉向组织内灌注固定液，使组织在短时间内得到充分的固定，本方法适用于独立性好的器官取材时的的临时固定。,第10页，共53页。,化学固定又可分为：第10页，共53页。,3、影响固定效果的因素1）、固定液的PH值：固定液的 PH值必须接近被固定样品的PH值。这样可以避免蛋白质结构和性质的变化，大部分的动物组织的平均PH值为7.4，选用PH值7.27.4较为适宜；植物组织常用pH值6.87.1固定液，固定效果较好。2）、固定液的浓度：固定液的浓度一定要合适，戊二醛的常用浓度为13，锇酸一般为12。3）、固定液的渗透压：一般堤身固定液可使细胞膨胀，而高身固定液可使细胞收缩。固定液的渗透压可通过改变缓冲液的浓度或增加纳、钙和镁等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质来调节。4）、组织块的大小：组织块大固定的时间要长，固定效果差；组织块小，固定时间短固定效果好。5）、固定温度：为降低酶的活性，防止细胞的自溶，固定大都在4度中进行。,第11页，共53页。,3、影响固定效果的因素第11页，共53页。,4、常用固定剂的种类及溶液的配制 1）、固定剂的选择: 一种优良的固定剂应具备以下条件：渗透能力强；使蛋白质交联成稳定的凝胶，而蛋白质分子结构不发生明显的变化和凝集；能保存酶的一定活力和细胞内其它成分（核酸、核蛋白、糖元及脂类）；对细胞没有收缩和膨胀作用；对细胞不产生人工假象，并能提高电子反差。根据以上条件，适用于电镜样品固定的固定剂常见的有：戊二醛、锇酸、多聚甲醛、高锰酸钾等。 （1）、戊二醛 它是一种还原剂，分子量是100.12，商品是25的水溶液。,第12页，共53页。,4、常用固定剂的种类及溶液的配制第12页，共53页。,PH为4.05.0 。它的穿透能力很强，是蛋白质的优良交联剂，对细胞膜系统、细胞骨架、糖元、核蛋白和细胞基质的固定效果较好。但不能保存脂类物质，不能有效地提高样品的电子反差。 （2）、锇酸 是一种强氧化剂，分子量为254.2，水溶液为中性。它对脂类物质固定效果很好，对核蛋白、蛋白质都有较好的固定效果，能有效地提高样品的电子反差。但不能保存糖类物质，对人体的粘膜组织刺激很强，毒性大。用时一定要在通风条件好的环境中进行。,第13页，共53页。,PH为4.05.0 。它的穿透能力很强，是蛋白质的,2）、缓冲液和固定液的配制 （1）、缓冲液的配制 在电镜样品制备中。常用的有磷酸和二甲砷酸钠两种缓冲液。 A、 0.2mol磷酸缓冲液的配制 甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液 磷酸氢二钠（含2个水分子） 36.61g (含7个水分子） 53.65g （含12个是分子） 71.64g 加双蒸水至 1000ml,第14页，共53页。,2）、缓冲液和固定液的配制第14页，共53页。,乙液：0.2M磷酸二氢钠溶液 磷酸二氢钠（含1个水分子） 27.60g (含2个水分子） 31.21g 加双蒸水至 1000ml 不同PH的0.2M 的磷酸缓冲液的配制 PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液(ml) 13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 乙液(ml) 36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 B、 二甲砷酸钠缓冲液的配制 甲液：二甲砷酸钠 4.28g 加双蒸水至 100ml,第15页，共53页。,乙液：0.2M磷酸二氢钠溶液第15页，共53页。,乙液：0.2N的盐酸。 按下表混合得不同PH值的缓冲液 PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液(ml) 50 50 50 50 50 50 乙液(ml) 18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7（2）、固定液的配制 A、 0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液 戊二醛的最终浓度（） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 0.2M磷酸缓冲液(ml) 50 50 50 50 50 50 50 25戊二醛水溶液(ml) 4 6 8 10 12 16 20 双蒸水加至(ml) 100 100 100 100 100 100 100,第16页，共53页。,乙液：0.2N的盐酸。第16页，共53页。,B、 0.1M二甲砷酸钠缓冲戊二醛固定液 戊二醛最终浓度（） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.2M二甲砷酸钠缓冲液（ml) 50 50 50 50 50 25%戊二醛水溶液(ml) 4 6 8 10 12 双蒸水加至(ml) 100 100 100 100 100 对生物样品的固定，戊二醛的常用浓度是2.5 ，有时为了加快固定的速度，也常用3.0的。使用的量一般是样品总体积的1020倍，对大多数样品固定的时间是12小时以上 ，也可在本固定液中把样品保存一段时间，但不能太长。 C、2%锇酸储存液的配制 锇酸一般是0.5克为一个包装，在使用时大多数情况下，先配制成2%的水溶液储存，用时再加等量的0.2M的缓冲液配成1%的使用。,第17页，共53页。,B、 0.1M二甲砷酸钠缓冲戊二醛固定液第17页，,由于戊二醛是还原剂，锇酸是氧化剂。所以，如果对同一样品进行戊二醛和锇酸双固定时，戊二醛固定结束，一定要用与配制戊二醛相同浓度和PH值的缓冲液彻底清洗后（清洗的时间一般在2小时以上），才能再用锇酸固定。 锇酸的使用浓度是1（用0.2M 缓冲液等比例稀释储存液）的水溶液，在本液中固定的时间不能太长，一般是1.52小时。锇酸固定结束，一般用双蒸水清洗样品，直到把锇酸清洗干净。 整个固定和清洗时间都应在40C环境中进行（是为了避免液体体积发生变化，造成对组织微细结构的损伤）。,第18页，共53页。,由于戊二醛是还原剂，锇酸是氧化剂。所以,三、清洗与脱水 1、清洗：在超薄切片制备技术中，清洗主要是指：当用两种化学性质完全不同的固定液对同一样品进行固定时，前一种固定液固定结束，一定要进行彻底清洗后，才能用另一种固定液进行固定。如戊二醛和锇酸双重固定，用戊二醛固定结束，必须用与配制戊二醛所用的相同浓度和相同PH值的缓冲液彻底清洗后，再用锇酸固定。否则会发生不良反应，对样品造成不良影响，甚至损伤样品，使实验失败；再就是用锇酸固定结束，要用双蒸水彻底清洗后，才能进行脱水。 清洗的时间一般不少于2小时，中间要换几次新清洗液。,第19页，共53页。,第19页，共53页。,2、脱水：用脱水剂逐渐取代掉组织中水分的过程叫脱水。 常用的脱水剂有酒精、丙酮。因丙酮对组织内的物质有抽提作用，因此，在制作超薄切片时，组织的脱水都用酒精，很少用丙酮。 脱水是采用逐渐提高脱水剂浓度的方法对样品进行逐级脱水。脱水剂设置的浓度级差一般有：50、70、80、90、100（2次）。在每级中脱水的时间据材料的质地不同有一定变化，动物组织一般每级20分钟；植物样品应加长脱水的时间。对一些含水多，柔软的样品，应适当增加脱水剂的浓度级差，可从30开始脱水。,第20页，共53页。,2、脱水：用脱水剂逐渐取代掉组织中水分的过程叫脱水。第2,EPON812 10.它的穿透能力很强，是蛋白质的优良交联剂，对细胞膜系统、细胞骨架、糖元、核蛋白和细胞基质的固定效果较好。它对脂类物质固定效果很好，对核蛋白、蛋白质都有较好的固定效果，能有效地提高样品的电子反差。保护样品使其组成物质在以后的清洗、脱水和包埋过程中不至溶解和丢失，并使组织适度硬化，防止切片的变形。B、倒口包埋法：本方法适用于单细胞、单层培养细胞和单个微小动、植物体的包埋。如果选择的包埋剂不合适，在固化后会出现空泡或硬度和组织的硬度有差别，这样就起不到很好的支撑作用，甚至会使切片失败。另外，因为动物组织和植物组织的质地（硬度）不同，所使用的包埋剂的配方也有差别，植物组织的浸透要选用较硬的配方。由于包埋剂是粘稠的液体，在混合时一定要避免产生气泡。A、铜网的清洗：新铜网在使用前先用丙酮浸泡，再用酒精洗几次，然后放在铺有干净滤纸的培养皿中干燥备用。包埋剂在35度时不硬化，所以在此温度下仍有浸透的作用，一些植物材料可在35度中多放一些时间，可加强浸透的效果，进入45度就开始硬化。环氧丙烷与包埋剂等量混合液浸透2472小时；A、包埋的容器一定要干燥。D、在切片厚度控制器上调节切片的厚度，一般开始使用半薄切片的厚度进行预切（目的是将前端的包埋剂和最表面的样品切掉），然后再选择到所要的厚度进行超薄切片。0ml 3.44ml 0.DDSA 6.,3、脱水时的注意事项（1）、整个脱水过程应在较冷的环境中进行（要求4摄氏度）。（2）、在更换液体的过程中一定要避免样品的自然干燥。（3）、当进入高浓度的脱水剂时，要及时盖好容器的盖子，防止空气中的水分进入脱水剂，也要避免低浓度的脱水剂过多的带入高浓度的脱水剂中。（4）、脱水一定要彻底、干净。否则，会造成包埋剂不能渗透到组织细胞的每个部位，使制片失败。,第21页，共53页。,EPON812 10.,四、浸透与包埋 1、置换：由于脱水剂酒精不能与包埋剂互溶，所以在浸透之前必须用既能和脱水剂互溶又能与包埋剂互溶的溶剂对经过脱水的样品进行处理（即置换），以便包埋剂渗透到组织细胞的各部位中。常用的置换剂是环氧丙烷。置换的方法是逐渐提高置换剂的浓度，使样品最后进入纯置换剂中，一般用纯酒精和环氧丙烷等量混合液处理样品2030分钟，再用纯环氧丙烷处理30分钟。即可进行包埋剂的浸透处理。 2、浸透：用包埋剂逐渐取代组织中的置换剂并渗透到细胞的各个部位的过程叫浸透。,第22页，共53页。,四、浸透与包埋第22页，共53页。,3）、固定液的渗透压：一般堤身固定液可使细胞膨胀，而高身固定液可使细胞收缩。重金属盐具有很强的电子散射能力，生物切片经过它们浸染后，不同的结构成分吸附有不同数量或不同种类的重金属离子，结合重金属离子多的区域，对电子的散射能力强，在电镜下观察呈现电子致密的黑色。EPON812 10.B、倒口包埋法：本方法适用于单细胞、单层培养细胞和单个微小动、植物体的包埋。植物组织常用pH值6.把厚度合格的切片贴附到带有支持膜的载网上的过程叫捞片。2）、缓冲液和固定液的配制国产618树脂（无锡树脂厂生产）配方另外，因为动物组织和植物组织的质地（硬度）不同，所使用的包埋剂的配方也有差别，植物组织的浸透要选用较硬的配方。A、包埋的容器一定要干燥。C、调节样品的前面（即切面）与刀刃的关系。C、二次包埋法：这种包埋方法只是在彌补上一次聚合后样品制备的不足时使用的一种方法。C、调节样品的前面（即切面）与刀刃的关系。,（1）包埋剂的种类及配方 A、包埋剂的选择条件：包埋剂的选择在超薄切片样品制备中很关键，因为它是渗入到组织的各个部位，固化后起支撑作用。如果选择的包埋剂不合适，在固化后会出现空泡或硬度和组织的硬度有差别，这样就起不到很好的支撑作用，甚至会使切片失败。一种优良的包埋剂应具备：包埋剂单体的粘度低，这样可便于向组织内渗透；固化后收缩率小，可降低对组织的收缩损伤；耐电子束轰击；在高真空中不便形、不升华；固化后有良好的切削性能。 B、包埋剂的种类：根据上述选择条件，可用于制作超薄切片的包埋剂有三种：甲基丙烯酸酯类；聚脂树脂类和环氧树脂类。常用的是环氧树脂（EPON812），它是从国外进口的，它是一种塑料单体，为淡黄色的粘稠的液体。,第23页，共53页。,3）、固定液的渗透压：一般堤身固定液可使细胞膨胀，而高身固定,它必须与一定比例的催化剂、固化剂（也叫交联剂）混合后才能使用。常用的催化剂有：2，4，6三（二甲基苯酚）（简称DMP30），还有二乙基苯胺，乙二胺等；固化剂有：十二烷基琥珀酸酐（简称DDSA)和甲基内次甲基邻苯二甲酸酐（简称MNA)；使用不同比例的固化剂可以改变包埋剂硬化后的硬度范围。 有时为了改变包埋剂的切削性能，在配方中加少量的增塑剂（也叫增韧剂），如邻苯二甲酸二丁酯（简称DBP）。 C、常见的包埋剂配方有： 国产618树脂（无锡树脂厂生产）配方 618树脂 6ml DDSA 4ml DBP 0.5ml DMP-30 0.1ml,第24页，共53页。,它必须与一定比例的催化剂、固化剂（也叫交联剂）混合后,适合不同季节使用的EPON812配方 适合冬季 适合夏季 EPON812 10.7ml 11.5ml MNA 5.9ml 7ml DDSA 6.6ml 6.5ml DMP-30 0.44ml 0.37ml 不同硬度的包埋剂配方 成分 A B C D E EPON812 9.44ml 9.44ml 9.44ml 9.44ml 9.44ml DDSA 20.0ml 15.0ml 10.0ml 5.0ml 0.0ml MNA 0.0ml 3.33ml 6.67ml 10.0ml 13.33ml DMP-30 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 软 硬,第25页，共53页。,适合不同季节使用的EPON812配,改良EPON812配方 EPON812 13ml DDSA 8ml MNA 7ml DMP30 0.42ml 包埋剂在配制时，要在干燥的环境中进行；对上述药品逐一进行均匀的混合；由于包埋剂是粘稠的液体，在混合时一定要避免产生气泡。（2）、浸透的方法 是采用逐渐提高包埋剂浓度的方法，把组织内的置换剂彻底取代掉。对动组织的浸透一般是：环氧丙烷与包埋剂等量混合液浸透处理1224小时，纯包埋剂浸透1224小时就可以了。,第26页，共53页。,改良EPON812配方第26页，共53页。,植物材料的浸透用时间较动物材料长很多，一般是3比1的环氧丙烷比包埋剂处理24小时或更长；环氧丙烷与包埋剂等量混合液浸透2472小时；纯包埋剂浸透2次，每次2472小时。有些木质化程度高的材料，每步骤还需要加长时间。 不管是动物材料还是植物材料，浸透是很关键的一步，要使纯包埋剂渗入到组织细胞的各个部位，浸透一定要彻底、完全。只有这样包埋剂固化后，才能使组织细胞得到很好的支撑，才能切出较理想的切片。 另外，因为动物组织和植物组织的质地（硬度）不同，所使用的包埋剂的配方也有差别，植物组织的浸透要选用较硬的配方。 整个浸透的过程也要在较干燥的环境中进行，包埋剂易吸收空气中的水分。,第27页，共53页。,植物材料的浸透用时间较动物材料长很多，一般是3比,3、包埋与聚合 （1）、准备工作：主要是包埋容器的准备，在包埋前应对所使用的包埋容器进行干燥处理。 在制作超薄切片时，包埋使用的容器有：药用胶囊、专用锥形底塑料包埋容器、多孔的橡胶包埋模板。 （2）、包埋的方法 A、常规包埋法：本法适用于所有块状组织。操作方法是将干燥的包埋容器的尖端滴加一滴纯包埋剂，用牙签挑一块浸透好的样品放入包埋容器的尖部，然后缓缓加满包埋剂，加入写好的标签，使有字的一面紧贴包埋容器的内壁，盖好容器的盖子，放入专用的聚合仪或恒温培养箱内进行聚合处理。 聚合就是使包埋剂硬化的过程，一般操作是35度1224小时；45度1224小时；60度1224小时。包埋剂在35度时不硬化，所以在此温度下仍有浸透的作用，一些植物材料可在35度中多放一些时间，可加强浸透的效果，进入45度就开始硬化。,第28页，共53页。,3、包埋与聚合第28页，共53页。,第29页，共53页。,第29页，共53页。,B、倒口包埋法：本方法适用于单细胞、单层培养细胞和单个微小动、植物体的包埋。操作方法是将浸透好的材料放在一载玻片或盖玻片上，将包埋胶囊内加满包埋剂，放入标签后，倒扣在有样品的位置上，把它们一起放入聚合仪或恒温培养箱内进行聚合，聚合结束后用低温冷冻的办法去掉载玻片或盖玻片。 C、二次包埋法：这种包埋方法只是在彌补上一次聚合后样品制备的不足时使用的一种方法。一般是样品的切片性能不好时，把有样品的部位切下，再放入包埋容器内加满新的包埋剂，再进行聚合，以彌补上次的制样的不足。有时也用于较大的单个细胞的二次包埋。,第30页，共53页。,B、倒口包埋法：本方法适用于单细胞、单层培养细胞和单个微,（3）、包埋时的注意事项 A、包埋的容器一定要干燥。 B、所有药品要注意防潮，最好存放在干燥器 中。 C、配制包埋剂时，每加一种药品要充分搅拌均匀后，在加另一种药品。 D、配好的包埋剂不能有气泡。 E、聚合好的包埋块要存放在干燥器中，以防止受潮。,第31页，共53页。,（3）、包埋时的注意事项第31页，共53页。,五、超薄切片 包埋聚合结束，组织和包埋剂成为一体的、具有一定硬度的包埋块了。在进行超薄切片之前，还需完成包埋块的修整、在支持铜网上做上支持膜、制作玻璃刀等工作。 1、包埋块的修整：包埋块的修正有人工修块方法和机械修块法。人工修块，是用单面刀片对包埋块进行修整，一般操作熟练的技术人员，都是用这种方法。 机械修块法是用修块机修块，这种方法修出的包埋块形状规则，但修快速度很慢，熟练者一般不用。不管采用哪种方法，修正好的包埋块的形状应如下图所示：,第32页，共53页。,五、超薄切片第32页，共53页。,修块机,第33页，共53页。,修块机,第34页，共53页。,第34页，共53页。,2、支持膜的制备 （1）、铜网的选择及清洗：超薄切片必须捞在特制的金属载网（其作用如同石蜡切片的载玻片）上，才能在电镜下观察。电镜使用的载网，根据制作材料的不同有多种。如尼龙网、铜网、镍网等，它们的大小都是相同的，一般直径为3毫米。各种材质的载网根据在上面存有的网眼的多少不同，可分为单孔、双孔、多孔、100目、 200目、300目 1000目。在生物样品 制备中经常用的载网 是200目铜网。,第35页，共53页。,2、支持膜的制备第35页，共53页。,A、铜网的清洗：新铜网在使用前先用丙酮浸泡，再用酒精洗几次，然后放在铺有干净滤纸的培养皿中干燥备用。 一些使用过的旧铜网，先在二氯乙烷中浸泡30分钟，然后用超声波清洗器处理25分钟，再用二氯乙烷洗几次，换酒精再超声洗一次，用无水酒精洗2次，放培养皿中干燥。 B、支持膜的制作：在干净的载网上覆盖上一层薄膜，用以支持所要观察的切片，这层膜就叫支持膜。支持膜的厚度一般为20nm. 支持膜有碳膜、火棉胶膜和Formva（聚乙烯醇缩甲醛）膜，最 常用的是Formvar膜。,第36页，共53页。,A、铜网的清洗：新铜网在使用前先用丙酮浸泡，再用酒精洗,Formvar膜的制作方法：先配制0.20.5的Formvar二氯乙烷（或氯仿）溶液。取一直径8cm的结晶皿（或培养皿）盛满蒸馏水，把一干净光滑的载玻片（或制刀用的玻璃条）浸入上述溶液中，然后垂直提出，放置在干燥（相对湿度不能高于30）的地方，干燥后载玻片上就结有一层薄膜。用锋利的刀片在载玻片的边缘将膜划破。然后将带膜的玻片的前端与水面呈45度角与结晶皿中的水接触，并慢慢向水中压玻片，这时由于水的张力作用，膜会逐渐脱离玻片漂于水的表面，取出玻片。将干净的铜网有光泽的一面向着漂在水面上的膜，均匀的摆放在膜上，然后用一与膜等宽的擦镜纸，平整的放在带有铜网的模上，等水完全湿透纸，用镊子将纸提出，带有支持膜的铜网就沾在纸上。将有铜网面向上放在干净的培养皿中干燥备用。 具体过程见下图示：,第37页，共53页。,Formvar膜的制作方法：先配制0.20.,第38页，共53页。,第38页，共53页。,火棉胶膜和碳膜因为一般不用，其制作方法在此不作介绍。有兴趣者可看有关的参考书。 3、玻璃刀的制作：在超薄切片技术中，所用的切片刀有两种，一种是钻石刀，它价格昂贵，常用于硬质材料的切片（如植物、动物的骨骼材料等）；另一种是最常用的玻璃切片刀。制作玻璃刀用的玻璃是特制的专用玻璃，要求含硅量达到75以上，无杂质，无气泡，光洁度好，厚度在46.5mm。宽度是25mm的玻璃条。 制作玻璃刀有两种方法，即手工制作法和制刀机制作法，手工制作法成功率很低，一般不用，各电镜室都用制刀机来制作玻璃切片刀。制刀机的结构见下图所示。,第39页，共53页。,火棉胶膜和碳膜因为一般不用，其制作方法在,LKB的制刀机,第40页，共53页。,LKB的制刀机,LKB制刀机模式图,第41页，共53页。,LKB制刀机模式图,制刀时首先用制刀机将玻璃条切割成25x25mm的方块，然后再用制刀机把一块方形玻璃制作成两把切片刀（制刀的具体步骤不作详述）。 制作出的刀应检 查用于切片的刀刃 是否合乎要求。 刀的质量优劣 见右图所示：,第42页，共53页。,制刀时首先用制刀机将玻璃条切割成25x,切片的玻璃刀要用新制的，如果制的刀不用，时间长了刀刃会变得不锋利了。 选好可使用的刀后，需要在刀刃的前面制作一个水槽，切片时把里面加满双蒸水，使切出的片子漂在水面上，以便进行收集和捞片。制作水槽的方法见下图所示：,第43页，共53页。,切片的玻璃刀要用新制的，如果制的刀不,做水槽的材料有专用的带状金属箔，现在多数是用医用胶布条，做好水槽后用牙科蜡封固胶布与玻璃刀之间的缝隙。在做水槽的过程中不能用手触摸胶布带，以防有污物粘在上面尔后污染了切片。 4、超薄切片：以上的工作准备好后就可以进行切片了。 （1）、超薄切片机的种类 ： 超薄切片用的设备叫超薄切片机，它主要是由样品推进装置；切片刀座；立体观察镜；照明装置；切片厚度选择装置和机座组成。根据对样品的推进原理不同，超薄切片机可分为两种：一种是机械推进式。它对样品的推进是靠机械作用实现的，这种超薄切片机如奥地利卫永,第44页，共53页。,做水槽的材料有专用的带状金属箔，现在多,公司生产的ULTRACUT E型。 另一种是热膨胀式超薄切片机。这种切片机对样品的推进原理是：在样品臂上饶有导电线圈，通电后产生热量使样品臂受热膨胀，向前推进样品；断电后样品臂不受热保持原位，这样循环往复，就可根据所选切片厚度切出所需要的超薄切片。 （2）、超薄切片的步骤 A、将修好的包埋块安装到超薄切片机的样品夹持器上，并用固定旋钮加紧。 B、将带有水槽的切片刀安装到刀座上 ，,第45页，共53页。,公司生产的ULTRACUT E型。第45页，共5,奥地利卫永公司的 ULTRACUT-E型超薄切片机,第46页，共53页。,奥地利卫永公司的第46页,第47页，共53页。,第47页，共53页。,用固定旋钮紧固好，并将水槽内加适量的双蒸水（既不能太少也不能太满）。 C、调节样品的前面（即切面）与刀刃的关系。 D、在切片厚度控制器上调节切片的厚度，一般开始使用半薄切片的厚度进行预切（目的是将前端的包埋剂和最表面的样品切掉），然后再选择到所要的厚度进行超薄切片。 C、将超薄切片机从手动调到自动，开始切片。 超薄切片切出的片子都漂浮在水槽内，我们虽然在切片前已经在厚度调节器上选择了所要的厚度。但因包埋块的切削性能、环境因素的影响，所切出的片子并不是每片都合格。这就需要在立体放大镜的帮助下，跟据切片的干涉颜色来挑选合格的切片。,第48页，共53页。,用固定旋钮紧固好，并将水槽内加适量的双蒸水（既不能太少,第49页，共53页。,第49页，共53页。,（3）、合格切片的选择：透射电镜所观察的切片的最佳厚度是5070nm，此厚度的片子在水面上的颜色是银灰色。当水槽的水面上布满切片后，用眉笔将其它颜色的切片挑出，把银灰色的切片集中到水槽的一个区域，即可进行捞片。 干涉色与切片厚度的关系 切片的颜色 切片的厚度(nm) 暗灰色 40以下 灰色 4050 银灰色 5070 金黄色 7090 紫色 90以上,第50页，共53页。,（3）、合格切片的选择：透射电镜所观察的切片的最佳厚度是,六、捞片 把厚度合格的切片贴附到带有支持膜的载网上的过程叫捞片。具体操作是：把厚度合格的切片集中到水槽的一个部位，用镊子夹一小块滤纸沾少许二甲苯逐渐靠近水面上的切片，在二甲苯蒸气的作用下，切片在水面上展得很平。这时用尖头镊子夹一带有支持膜的铜网，使有膜的一面对准切片并逐渐接近切片，切片就被吸附到铜网上，用滤纸小心的吸去铜网上的水分（不要损伤了切片），放入专用的切片盒内备用（注意：要始终记住有切片的面）。,第51页，共53页。,六、捞片第51页，共53页。,第52页，共53页。,第52页，共53页。,七、超薄切片的染色（电子染色） 1、染色的目的：由于生物组织是由低原子序数的物质组成，超薄切片在染色之前反差是很弱的，不能直接在透射电镜下观察。因此必须进行增强反差处理，也就是样品要经过电子染色后才能观察。超薄切片的染色剂多数是重金属盐类化合物，如铀、铅、锇、钨等。重金属盐具有很强的电子散射能力，生物切片经过它们浸染后，不同的结构成分吸附有不同数量或不同种类的重金属离子，结合重金属离子多的区域，对电子的散射能力强，在电镜下观察呈现电子致密的黑色。反之，对电子的散射能力弱，图像颜色较淡；没有结合重金属离子的区域为电子透明区。总之，样品经电子染色处理，不仅能增强电子反差，也能增加图像的清晰度，使细胞的微细结构充分的显示出来。,第53页，共53页。,七、超薄切片的染色（电子染色）第53页，共53页。,感谢聆听,感谢聆听,