临床免疫学检验课件第15章免疫细胞标志和功能检测技术.pptx
第十五章 免疫细胞标志和功能检测技术,第十五章 免疫细胞标志和功能检测技术,免疫细胞,免疫细胞:凡是参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞的统称为免疫细胞 。淋巴细胞T细胞、B细胞、NK细胞抗原提呈细胞单核巨噬细胞、树突状细胞等其他细胞中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等,免疫细胞免疫细胞:凡是参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞的统,3,免疫细胞的分离及检测,检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定方法：体外法为主目的：判断机体免疫状态意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效,免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的细胞从 血液或组织中分离出来,3免疫细胞的分离及检测检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功,细胞分离基本原理,细胞密度不同细胞生物学特性不同细胞表面分化抗原不同,第一节 免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T、B细胞和T细胞亚群的分离,细胞分离基本原理细胞密度不同第一节 免疫细胞的分离 外周血,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。 分离原理：根据比重不同进行分离,一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripher,PBMC,血小板,多核白细胞,红细胞,PBMC血小板多核白细胞红细胞,对分离介质的要求：对细胞无毒；基本等渗；与血浆和分离细胞不相溶；有特定的比重。不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.085大鼠：1.087人：1.0751.090常用Ficoll分离液(1.0770.001)分离人的PMBC,分离介质是关键,对分离介质的要求：分离介质是关键,(聚蔗糖-泛影葡胺）,纯度达95%,上层：血浆,中层：分离液,底层：红细胞和多核细胞,白膜层,Ficoll分离液份6%聚蔗糖蒸馏水溶液份34%泛影葡,二 、淋巴细胞分离,贴壁粘附法 吸附柱过滤法 Percoll 分离液法,二 、淋巴细胞分离贴壁粘附法,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37温箱静置1 h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞。,1.贴壁黏附法,注意：B细胞也可粘附,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。,2. 吸附柱过滤法,巨噬细胞或单核细胞 DC B细胞 T细胞=红细胞,细胞的黏附能力：,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入,3. Percoll 分离液连续密度梯度离心法,是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。高速离心后可形成连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。,操作流程长，繁琐，实际应用受限,3. Percoll 分离液连续密度梯度离心法 是一种经聚乙,红细胞低渗裂解法：在PBMC中加入蒸馏水，轻摇片刻使红细胞裂解，随后加入等量的1.8%氯化钠溶液恢复等渗。血小板胎牛血清梯度离心，利用PBMC与血小板比重的差异，离心后PBMC沉淀、血小板悬浮。,其他成分去除,红细胞其他成分去除,淋巴细胞,T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等,B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等,分离方法,阳性选择法：纯化所需的细胞,阴性选择法：去除不要的细胞，留下所需细胞,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离,淋巴细胞T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等B,E花环沉淀法尼龙毛纤维分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法亲和板分离法,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离,E花环沉淀法尼龙毛纤维分离法亲和板分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法,E花环沉淀法三、T、B细胞和T细胞亚群的分离E花环沉淀法,1. E花环沉淀法方法：淋巴细胞+SRBC悬液加入分层液 T细胞形成E花环而沉于管底悬液 中为B细胞。,成熟T细胞具有CD2分子能结合绵羊红细胞,缺点：分离效率低，易受多种因素影响,1. E花环沉淀法成熟T细胞具有CD2分子能结合绵羊红细胞缺,方法：将所需的细胞对应的单克隆 抗体包被于小管内加入淋 巴细胞形成Ag-Ab复合物 洗去不反应的物质。,2. 尼龙毛分离法(吸附能力差异)方法：淋巴细胞通过聚酰胺纤维管洗脱下来的是T细胞,3. 亲合板结合分离法分离亚群,方法：将所需的细胞对应的单克隆2. 尼龙毛分离法(吸附能力差,4. 磁性微球分离法,磁性微球：微球核心一般为金属小颗粒（Fe2O3, Fe3O4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠，有免疫配基和磁响应的性质。,4. 磁性微球分离法磁性微球：微球核心一般为金属小颗粒（Fe,正筛选细胞时，抗体可引起细胞凋亡或活化。,细胞-抗体-磁珠复合物,免疫磁珠法分离细胞原理,正筛选细胞时，抗体可引起细胞凋亡或活化。细胞-抗体-磁珠复合,临床免疫学检验-课件-第15章-免疫细胞标志和功能检测技术,评价免疫磁珠分离细胞的重要指标：纯度和得率取决于：磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小,评价免疫磁珠分离细胞的重要指标：纯度和得率取决于：磁珠所连,经典的流式细胞分析仪,5 .荧光激活细胞分选仪分离法（FACS）,优点：可对单个细胞进行快速、准确和客观的检测，对特定群体加以分选缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和 仪器昂贵,经典的流式细胞分析仪5 .荧光激活细胞分选仪分离法（FACS,什么是流式细胞仪?,流式细胞仪（flow cytometer）：是多学科交叉融合的产物，是集光学、化学、材料学、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新型分析仪器。作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分析仪器。流式细胞仪特点：速度快，每秒可测量数万个微粒；精度高；准确性好；多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、化学和生物特性的多参数测量。,什么是流式细胞仪?流式细胞仪（flow cytometer）,经典流式细胞仪的结构,（一）基本结构 经典分选型的流式细胞仪的结构组成液流系统：液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流 光学系统：光源、光束形成器（流动室前光学系统）、流动室后光学系统 信号检测及光电转换系统：光电转换器、放大器和信号处理电路 分选系统：电荷加载系统、超声压电晶体、液流断点监控系统、偏转电极、细胞收集系统和气溶胶控制系统计算机分析系统,经典流式细胞仪的结构（一）基本结构,经典流式细胞仪的结构,经典流式细胞仪的结构,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,流式细胞仪分选原理,细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液,流式细胞术分选的原理,流式细胞术分选的原理,早期,细胞物理属性,细胞生物属性,分辨率和灵敏度不高,现在（根据细胞表面标志）,分辨率和灵敏度高,四、不同细胞分离方法的综合评价,早期细胞物理属性细胞生物属性分辨率和灵敏度不高现在（根据细胞,1、细胞计数单位：细胞数/毫升。工具：血细胞计数板 方法：分离的免疫细胞悬液轻轻混匀后，取一定体积细胞悬液加等量的细胞稀释液混匀，吸取1滴滴入血细胞计数板中，计算4个大方格的细胞数。,五、分离细胞的保存和活力检测,1、细胞计数细胞数=4个大方格的细胞数4104 稀释倍数,4个大方格，体积为0.1mm3,4个大方格，,2、分离细胞的保存 对保存液的要求：等渗，具pH 缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc-199、RPMI 1640 ）。 短期保存，置4放置较好，可减低细胞代谢活动。 需长期保存，应放入液氮罐中在深低温(-196)条件下保存细胞。,2、分离细胞的保存,3、细胞活力测定 细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，常用台盼蓝(trypan blue)染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。,用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数200 个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。,3、细胞活力测定 用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和,一、T细胞表面标志及亚群,二、B细胞表面标志,三、自然杀伤细胞表面标志,第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类,一、T细胞表面标志及亚群二、B细胞表面标志三、自然杀伤细胞表,白细胞分化抗原：造血干细胞在分化为不同谱系、各个细胞谱系分化不同阶段、及成熟细胞活化过程中表达的细胞表面分子；簇分化抗原（cluster of differentiation）：CD分子或分化群，通常鉴定的同一白细胞分化抗原归为同一分化群；淋巴细胞鉴定和计数常用的细胞表面标志：簇分化抗原(CD)；,相关概念,白细胞分化抗原：造血干细胞在分化为不同谱系、各个细胞谱系分化,一、T细胞表面标志及其亚群,T细胞共同的标志抗原：CD3分子根据免疫效应功能和表面的CD分子分为：辅助性T细胞（help T cell,Th）： CD3+CD4+CD8- 细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell, Tc or CTL） ：CD3+CD4-CD8+ 调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）：CD4+CD25+Foxp3+,一、T细胞表面标志及其亚群 T细胞共同的标志抗原：CD3分子,（一）辅助性T细胞（help T cell,Th）典型标志：CD3+CD4+CD8- 主要包括Th1 、Th2、 Th3和Th17细胞 Th1和Th2相对特异的标志：CD3+CD4+CD30- （ Th1 ）CD3+CD4+CD30+（ Th2 ）,一、T细胞表面标志及其亚群,分泌IL-2、IFN-、TNF-辅助细胞免疫,分泌IL-4、5、6、10，辅助体液免疫,（一）辅助性T细胞（help T cell,Th）一、T细胞,（二）细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL）典型标志：CD3+CD4-CD8+ Tc1和Tc2相对特异的标志：CD3+CD8+CD30- （ Tc1 ）CD3+CD8+CD30+（ Tc2 ）,一、T细胞表面标志及其亚群,（二）细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,Tc,（三）调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）分两类：自然调节性T细胞（natural Treg，nTreg）诱导性调节性T细胞（inducible Treg，iTreg）分子标记：转录因子Foxp3；nTreg的典型标志：CD4+CD25+Foxp3+iTreg的检测要结合其他T细胞标志。,一、T细胞表面标志及其亚群,（三）调节性T细胞（regulatory T cell,Tr,二、B细胞表面标志,mIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体等，其中以mIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标； 其他特异的分子有： CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等；CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19+CD5+ ，而B2细胞为CD19+CD5-。B2细胞为通常所指外周成熟的B细胞。,二、B细胞表面标志 mIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体,B1与B2细胞的比较,2,B1与B2细胞的比较2,CD19+CD5-,:B2细胞,二、B细胞表面标志,B细胞特有，鉴定B细胞可靠指标,成熟B细胞共有,Fc受体,补体受体,CD19+CD5-:B2细胞mIg：膜表面免疫球蛋白CD19,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。,三、NK细胞表面标志 人类NK细胞表面标志主要以,抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），分两类：专职提呈细胞：巨噬细胞、树突状细胞、B细胞，表达MHC II类分子；非专职提呈细胞：内皮细胞、上皮细胞等其他：表达MHC-类分子 能提呈内源性抗原的细胞,第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测,抗原提呈细胞（antigen-presenting cell,1、单核-吞噬细胞系统 主要表面标志：CD142、树突状细胞（DC）形态、表型和功能高度异质；共同特征：树突样形状，胞质存在Birbeck颗粒状结构、表达CD1a、MHC II类分子、吞噬功能低、诱导静息幼稚T细胞增殖 ；主要表面标志：CD1a、CD11c、CD83。,第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测,1、单核-吞噬细胞系统第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测,第四节 淋巴细胞功能检测,第四节 淋巴细胞功能检测,一、T淋巴细胞功能的检测,T细胞功能： 对外来物质的应答功能 直接杀伤特异性靶细胞 辅助或抑制B细胞产生抗体 产生细胞因子功能,一、T淋巴细胞功能的检测T细胞功能：,分为体内实验和体外实验。体内实验：间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应，如迟发型超敏反应。体外实验：包括增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。,一、T淋巴细胞功能的检测,分为体内实验和体外实验。一、T淋巴细胞功能的检测,（一）T淋巴细胞增殖试验（T细胞转化试验）,T细胞,外来物质,细胞内大分子物质的合成增加,T细胞形态变化,丝裂原：非特异性刺激物 PHA、ConA、PWM,抗原性刺激物：PPD (purified protein derivative),同位素法,形态法,（一）T淋巴细胞增殖试验（T细胞转化试验）T细胞外来物质细胞,1、同位素法(3H-TdR掺入法),外周血单个核细胞,5%CO2 37 56h,+,收集培养细胞于滤膜上,液体闪烁器计数cpm,加入3H-TdR,PHA,无PHA,37 16h,1、同位素法(3H-TdR掺入法)外周血单个核细胞5%CO2,计算刺激指数(stimulation index,SI)：,SI =,含PHA管cpm,不含PHA管cpm,方法评价：,客观性较强，灵敏度高，重复性好所需仪器昂贵有同位素污染,计算刺激指数(stimulation index,SI)：S,2、形态法,标本：外周血或单个核细胞,37 72h,+,取培养细胞涂片染色镜检,观察细胞形态学改变,PHA,无PHA,2、形态法标本：外周血或单个核细胞37 72h+取,未转化和转化淋巴细胞的形态特征,未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化细胞未转化淋巴细胞淋巴母细,临床免疫学检验-课件-第15章-免疫细胞标志和功能检测技术,转化率 =,转化的淋巴细胞数,转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数,100%,计数200个淋巴细胞，求转化率,正常参考值：60%80%,方法学评价：1) 简便易行2) 受主观影响因素较大、重复性差,转化率 =转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细,3、MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。,琥珀酸脱氢酶,还原,不溶性蓝黑色结晶甲臜沉积,酶标仪检测A570nm,淋巴细胞,丝裂原,MTT,DMSO或盐酸异丙醇溶解,甲臜生成量与细胞增殖水平正相关,3、MTT比色法 是一种检测细胞存活和生长的方法。琥,计算刺激指数(stimulation index,SI)：淋巴细胞增值程度,SI =,试验孔A570nm均值,对照孔A570nm均值,方法学评价：1) 简便易行，无放射性污染2) 灵敏度相对较低,计算刺激指数(stimulation index,SI)：淋,（二）T淋巴细胞分泌功能测定,细胞因子检测,（二）T淋巴细胞分泌功能测定细胞因子检测,（三）T淋巴细胞介导的细胞毒试验,T细胞,靶细胞,靶细胞,37,靶细胞被杀灭,(lymphocyte mediated cytotoxicity，LMC),1、形态学检查法,镜检,抑制率% =,对照组平均残留肿瘤细胞数 实验组平均残留肿瘤细胞数,对照组平均残留肿瘤细胞数,100%,（三）T淋巴细胞介导的细胞毒试验T细胞靶细胞靶细胞37靶细,2、同位素法（51Cr释放法）,靶细胞,37,靶细胞,靶细胞,T细胞,51Cr透过细胞膜与胞浆蛋白质结合,51Cr,同位素释放,靶细胞被杀灭,检测靶细胞的放射性强度,51Cr,2、同位素法（51Cr释放法）靶细胞37靶细胞靶细胞T细胞,特异性抗原皮肤试验结核菌素皮肤试验：,（四） 体内试验,PHA皮肤试验敏感性高、安全可靠，临床常用于检测机体细胞免疫水平,注射OT,2448h,根据硬结直径判断阳性,特异性抗原皮肤试验（四） 体内试验PHA皮肤试验注射OT24,二、 B淋巴细胞功能检测,产生抗体功能,对外来物质应答功能,(B细胞增殖能力),IgM诱导增殖试验LPS诱导增殖试验葡萄球菌诱导试验,血清Ig的测定体内试验溶血空斑形成试验,二、 B淋巴细胞功能检测产生抗体功能对外来物质应答功能 (B,（一）体内试验,适量抗原,白喉类毒素、破伤风类毒素,待检者,检测待检者血清中相应抗体的效价,（一）体内试验适量抗原白喉类毒素、待检者检测待检者血清中相应,（二）溶血空斑形成试验,检测动物抗体形成细胞的功能,SRBC,取出脾细胞，加入SRBC及补体,4天,47 0.7%琼脂溶液,37 3-5h,1、直接溶血空斑形成试验,溶血,SRBC抗SRBC抗体补体复合物导致SRBC溶解形成溶血空斑,（二）溶血空斑形成试验 检测动物抗体形成细胞的功能SRBC,一个溶血空斑表示一个抗体形成细胞 溶血空斑的大小表示抗体形成的量检测IgM生成细胞,一个溶血空斑表示一个抗体形成细胞,2、间接溶血空斑形成试验：检测IgG、 IgA生成细胞,SRBC,取出脾细胞，加入SRBC及补体,4天,47 0.7%琼脂溶液,37,加入抗鼠Ig抗体,SRBC抗SRBC抗体抗小鼠抗体补体复合物导致SRBC溶解形成溶血空斑,2、间接溶血空斑形成试验：检测IgG、 IgA生成细胞SRB,3、被动空斑形成试验,SRBC,补体,47 0.7%琼脂溶液,37,抗原,可检测人类抗体形成细胞的功能,待检血,单个核细胞,如果用一定方法将SRBC与其他抗原连接，则可检查与该抗原相应的抗体形成细胞，这种非红细胞抗体性溶血空斑试验，称为被动空斑形成试验。,SRBC抗原与抗原相应的抗体补体复合物导致SRBC溶解形成溶血空斑,吸附,+,+,3、被动空斑形成试验 SRBC补体47 0.7%琼脂溶液3,4、反向空斑形成试验如用抗IgG、IgA、IgM抗体包被SRBC，检测相应的免疫球蛋白产生的细胞。,抗IgG、IgA、IgM抗体,SRBC抗抗体抗体补体复合物导致SRBC溶解形成溶血空斑,可检测人类抗体形成细胞的功能,4、反向空斑形成试验抗IgG、IgA、IgM抗体SRBC,溶血空斑形成试验应用：1、测定药物或其它因素对体液免疫功能的影响2、评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的功能,溶血空斑形成试验应用：,（三）酶联免疫斑点试验,可测抗体分泌细胞，又可测抗体分泌量具有稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌、可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞,（三）酶联免疫斑点试验可测抗体分泌细胞，又可测抗体分泌量,三、自然杀伤细胞活性检测,NK细胞活性：既不依赖抗体，也不需抗原刺激和致敏就能杀伤靶细胞。NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的受体结构，通过受体直接与靶细胞结合发挥杀伤作用。,三、自然杀伤细胞活性检测NK细胞活性：既不依赖抗体，也不需抗,方法及原理：,靶细胞,效应细胞,靶细胞死亡,可被台盼兰染色,形态法,释放胞内酶,酶释法,乳酸脱氢酶,简便易于操作可较早反应NK活性受主观因素响大无法计数轻微损伤的细胞,可定量检测简便本底高,方法及原理：靶细胞效应细胞靶细胞死亡可被台形态法释放胞内酶酶,同位素法,靶细胞,效应细胞,靶细胞死亡,同位素,同位素释放,检测靶细胞的放射性强度,51Cr透过细胞膜与胞浆蛋白质结合,51Cr,3HTdR,3HTdR参与细胞DNA合成,同位素法靶细胞效应细胞靶细胞死亡同位素同位素释放检测靶细胞的,第五节 其他免疫细胞功能检测技术,大吞噬细胞：单核巨噬细胞系统小吞噬细胞：中性粒细胞 吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。,第五节 其他免疫细胞功能检测技术大吞噬细胞：单核巨噬细胞系统,一、中性粒细胞功能检测,细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能检测,一、中性粒细胞功能检测 细胞趋化功能的检测,(一) 细胞运动功能趋化功能检测,1.原理：,趋化因子（微生物的代谢产物，补体片段C3a和C5a，细胞因子)作用下，中性粒细胞产生趋化运动，其强度反映中性粒细胞的功能。,(一) 细胞运动功能趋化功能检测1.原理： 趋化因子,2. 方法学：,滤膜渗透法（Boyden 小室法）,2. 方法学：滤膜渗透法（Boyden 小室法）,琼脂糖平板法,A：向左侧孔移动距离即趋向移动距离B：向右侧孔移动距离即自发移动距离趋化指数：A/B，判断移动距离,趋化因子,对照,琼脂糖平板法 A：向左侧孔移动距离即趋向移动距离趋化因子对照,(二)吞噬和杀菌功能测定,中性粒细胞可吞噬颗粒性物质（如金黄色葡萄球菌），根据吞噬率 (phagocytic rate) 和吞噬指数 (phagocytic index)可判断该细胞的吞噬功能，根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率。,(二)吞噬和杀菌功能测定 中性粒细胞可吞噬颗粒,1显微镜检查法：,原理：将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合、温育后，涂片用碱性亚甲蓝液染色。在油镜下计数吞噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数,1显微镜检查法： 原理：将白细胞与葡萄球菌或,临床免疫学检验-课件-第15章-免疫细胞标志和功能检测技术,2. 溶菌法,原理：将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混合后，置37。每隔一定时间取定量培养物，稀释后接种固体平板培养基。37培养18h后，计数生长菌落数，以了解中性粒细胞的杀菌能力。,2. 溶菌法 原理：将白细胞悬液与经新鲜人血清调理,3硝基蓝四氮唑 (nitroblue tetrazolium，NBT) 还原试验,NBT阳性细胞百分率可反映中性粒细胞杀菌功能,方法评价： 正常值为40%50%，一般以阳性细胞数超过10% 判定为NBT试验阳性。,3硝基蓝四氮唑 (nitroblue tetrazoliu,二、巨噬细胞功能检测,斑蝥敷贴法收集检测溶酶体酶的活性酸性磷酸酶的测定非特异性酯酶的测定促凝血活性测定,二、巨噬细胞功能检测斑蝥敷贴法收集,反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。CD4/CD8组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。,第六节 免疫细胞标志和功能检测的临床应用,反映机体免疫功能状态。第六节 免疫细胞标志和功能检测的临床应,小 结,免疫细胞的分离,免疫细胞的计数,PBMC分离：细胞密度不同,淋巴细胞分离：生物学特性不同,T、B细胞和T细胞亚群分离： 细胞表面标志：免疫磁珠,T细胞表面标志及亚群：CD3+CD4+CD8- ThCD3+CD4-CD8+ CTLCD4+CD25+Foxp3+ Treg,CD30+/-,Th1/Th2；Tc1/Tc2,B细胞表面标志：mIg:特有CD19：成熟B细胞共有；CD19+CD5+：B1细胞； CD19+CD5-：B2细胞：体液免疫,单核吞噬细胞表面标志：CD14树突状细胞：CD1a、CD11c、CD83,荧光激活细胞分离仪计数,小 结免疫细胞的分离免疫细胞的计数PBMC分离：细胞密,免疫细胞功能检测,小 结,T细胞功能检测,T细胞增殖试验T细胞分泌功能T细胞介导细胞毒试验,抗原皮肤试验PHA皮肤试验,体内试验,形态学法同位素法MTT比色法,形态学法、同位素法,B细胞功能检测抗体生成能力检测,溶血空斑试验酶联免疫斑点试验,直接法和间接法测抗红细胞抗体产生细胞被动法和反向法测人类抗体形成细胞,NK细胞功能检测,形态学法、酶释放法、同位素法,中性粒细胞功能检测,趋化功能吞噬和杀菌功能,滤膜渗透法琼脂糖平板法,显微镜检查法溶菌法NBT法,免疫细胞功能检测小 结T细胞功能检测T细胞增殖试验抗原,T细胞均有共同的标志性抗原是 分子？B细胞表面最重要的标志是 。采用Ficoll分离法处理血清后，分离结果从上至下依次为 。利用贴壁粘附法可从PBMC中去除 。用于吞噬和杀菌功能测定的方法有 。,思考题,T细胞均有共同的标志性抗原是 分子？思考题,1、PBMC的分离方法及原理？2、淋巴细胞分离的方法有哪些？各有什么特点？3、细胞表面标志的检测方法有哪些？4、T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的主要分化抗原是什么？5、T细胞功能检测方法学及相应的原理有哪些？,思考题,1、PBMC的分离方法及原理？思考题,
