rna干扰与肿瘤研究及治疗课件.ppt
RNA干扰及其在肿瘤研究及治疗方面的应用,rna干扰与肿瘤研究及治疗,2022/11/4,1,RNA干扰及其在肿瘤研究及治疗方面的应用rna干扰与肿瘤研究,内容,rna干扰与肿瘤研究及治疗,内容rna干扰与肿瘤研究及治疗,一、背景介绍,RNA 干扰( RNA interference, RNA i) 是一种由短双链RNA ( double-stranded RNA, dsDNA )所引起的序列特异性基因沉默, 是真核生物体内一种阻断外源基因表达的自我防御体系, 是dsDNA 介导的,使与其互补的具有同源序列的单链RNA 进行特异性降解的过程。 RNA干扰(RNA interference ，RNAi)最早是由Mello和Fire等1998 年在线虫体内发现。 RNAi 作为一种简单、高效的基因敲除工具，正在基因组学和疾病基因治疗领域掀起一场革命，为肿瘤的基因治疗提供了新思路，可能成为今后的肿瘤治疗策略之一。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,一、背景介绍 RNA 干扰( RNA inter,二、RNA干扰作用机制,转录水平,转录后水平,翻译水平,RNA干扰的作用是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同层次上实现的。,三个水平,rna干扰与肿瘤研究及治疗,二、RNA干扰作用机制转录水平转录后水平翻译水平,转录后水平,rna干扰与肿瘤研究及治疗,转录后水平rna干扰与肿瘤研究及治疗,rna干扰与肿瘤研究及治疗,rna干扰与肿瘤研究及治疗,转录水平,小分子干扰核糖核酸( siRNA)与互补DNA直接结合而发挥作用, 激发同源DNA 甲基化的加强, 使目的基因转录受限,表达关闭, 进而加强基因沉默。如果甲基化出现在启动子区域, 则转录不能进行, 若甲基化出现在编码区, 则转录进行, 但在转录后水平上沉默。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,转录水平 小分子干扰核糖核酸( siRNA)与,翻译水平,翻译水平上的RNA i是抑制相应mRNA的翻译, 使相应的蛋白质表达受阻, 其中起重要作用的是小时序RNA ( sm all temporal RNA,stRNA ), 它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体经dicer酶作用后形成长约21 23 nt的dsRNA, 通过R ISC结合在相应mRNA 的3 末 端非翻译区上, 进而阻断mRNA的翻译。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,翻译水平 翻译水平上的RNA i是抑制相应mR,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,（一） RNA干扰在肿瘤研究中的应用1.基因功能研究： 由于RNA 干扰能高效特异地阻断基因表达，通过基因沉默机制作用于癌基因、抑癌基因表达，影响肿瘤生长，在体外培养细胞中研究靶基因的功能。因而成为研究基因功能很好的工具。例如：肿瘤易感基因筛查和鉴定，Williams 等通过结合cDNA 芯片技术和RNAi 技术鉴定了多个结肠癌高度相关基因。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用（一） RNA干扰在肿,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,2.肿瘤发生机制研究: 设计多种小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）,可以产生多基因沉默的效果，用于细胞信号传导通路的研究。Harvey 等用RNAi 技术抑制Brk 蛋白表达，结果发现乳腺癌细胞的增生受到抑制。同时还发现Brk的无激酶活性突变体，可以接合器的形式，通过非激酶依赖的机制，促进肿瘤细胞的生长。结果表明Brk 可作为乳腺癌治疗的新目标。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用2.肿瘤发生机制研究:,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,（二） RNA干扰在肿瘤治疗中的应用1.不同siRNA 之间的增效作用 由于肿瘤是一种多基因调控的疾病，采用 RNA干扰技术对肿瘤相关基因进行多重抑制会产生更好的疗效。邵荣光针对不同的肿瘤相关基因，设计合成了靶向bcl-2、cdk-2、mdm-2、H-ras、pkc- 的siRNA, 这些siRNA 各自都能抑制黑色素瘤细胞的增殖，其抑制率分别为68%、64%、72%、74%和53%。当5 种siRNA 联合应用时，能显著提高复合siRNA 对黑色素瘤细胞的抑制作用。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用（二） RNA干扰在肿,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,2.SiRNA对靶分子药物具的增效作用 表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂埃罗替尼（erlotinib）被批准在临床上应用，但大多数晚期肺癌患者不应答, 早期肺癌患者总是发展为耐药性,占一半的复发患者T790M-EGFR 基因发生了突变。研究证明，领用RNA干扰技术敲除肝细胞生长因子受体（MET）和表皮生长因子受体（EGFR），能显著的促进埃罗替尼耐药的H1975 细胞凋亡。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用2.SiRNA对靶分子,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,3.siRNA 对DNA 损伤剂的增效作用 5-FU (5-氟尿嘧啶) 或羟基喜树碱为两种常用的抗肿瘤药物，研究证明，Bcl-2/Bcl-xl siRNA 转染细胞对5-FU (5-氟尿嘧啶) 或羟基喜树碱表现出更高的敏感性，提示Bcl-2/Bcl-xl siRNA 介导的基因沉默结合化疗药物可能是潜在的人肝癌治疗策略。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用3.siRNA 对DN,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,4. siRNA 对放疗的增敏作用 MDM2 蛋白被证明在辐射应答和肿瘤放射敏感性方面发挥关键作用, 是一个有吸引力的临床药物靶标, 利用RNA干扰技术抑制MDM2 可以加强肿瘤对放射治疗的敏感性。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用4. siRNA 对放,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,5.抗肿瘤新药研发 利用RNAi特异性地抑制癌细胞内的内源性致癌基因的表达,而不影响正常细胞的基因表达,在研究肿瘤发生发展的信号通路以及表型变化可以发挥极大的作用,从而可以进一步为肿瘤的早期诊断和后期治疗找寻新的靶点。siRNA从发现到现在的短十几年时间内,很多研究工作者、生物技术公司和制药公司己经开始广泛利用siRNA药物治疗肿瘤。 2008年,美国Calando Pharmaceuticals公司祀向核糖核苷酸还原酶M2亚基(M2 subunit of ribonucleotide reductase, RRM2)取得了突破性的进展,申请的治疗实体肿瘤的siRNA药物CALAA-01被美国H)A批准进入临床试验I期,成为最早siRNA药物治疗癌症的首例临床试验。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用 5.抗肿瘤新药研发r,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,2009年7月,德国著名制药公司Silence Therapeutics公司开展了治疗实体肿瘤的靶向蛋白激酶PKN-3基因RNA干扰药物Atu027的I期临床试验,2011年,该公司报道了其进展,资料显示,24名患者经过Atu027多次治疗后,有9名患者病情稳定,6名患者的较好疗效表现在研究终点(治疗3个月),另外3名患者还在接受治疗,目前的结果还比较令人满意。 2010年12月,加拿大Tekmira制药公司宣布开始siRNA药物TKM-080301(靶向肿瘤细胞高表达的polo样激酶I (polo-like kinase I, Plkl)的I期临床试验。目前临床前研究证明TKM-080301能特异性地杀死肿瘤细胞,而对正常细胞无明显毒副作用,对肝癌以及肝外肿瘤都有很好的抗肿瘤效果。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用 200,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,（三）RNA干扰技术在肿瘤治疗方面的优势 与基因替代、反义核苷酸治疗、细胞因子基因治疗方法相比，RNAi 技术有着无可比拟的优势。1.RNAi 基因抑制效果确切：微量的siRNA 即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上。因此，注入少量的siRNA 足以产生强大的干扰效应，减少了传统基因治疗方法大剂量用药带来的毒副作用及免疫效应。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用（三）RNA干扰技术在,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用,2. RNAi 抑制具有严格的序列特异性，将一段与基因同源的siRNA 注入细胞，它可以特异性地干扰相应基因的表达，其他基因即使与靶基因同属于一个基因家族也不会受到干扰。因此，RNAi 干扰治疗的针对性很强，副作用小。3.肿瘤是多基因、多因素疾病，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制肿瘤的生长，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA 分子，只注射一种dsRNA 即可以剔除多个基因，也可以同时注射多种dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时剔除，而且抑制效果互补干扰。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,三、RNA干扰在肿瘤研究及治疗中的应用2. RNAi 抑制具,四、问题及展望,（一） RNA干扰技术在肿瘤治疗方面要克服的问题,理论上只有在siRNA和靶mRNA特异性结合才会沉默靶基因表达。脱靶效应在疾病治疗上存在潜在的危险。由拖把效应产生的意外的基因调控成为RNAi技术治疗的一个主要障碍。,一些研宄工作者发现,由于siRNA的特殊结构、序列以及药物释放方式,会引起人体强烈的先天免疫反应,刺激干扰素和炎症细胞因子等化学物质的释放。,由于siRNA本身稳定性差,穿透细胞膜的能力差,无靶向功能,在生理环境中极不稳定,易被血清中的酶迅速降解,被肝脏和肾脏清除,因此如何siRNA体内给药以及开发siRNA输送体系是siRNA疗法的最大挑战。,免疫刺激,系统给药,脱靶效应,rna干扰与肿瘤研究及治疗,四、问题及展望（一） RNA干扰技术在肿瘤治疗方面要克服的问,四、问题及展望,（二） 展望 RNA i技术已经引起了实验生物学的巨大变革, 在肿瘤治疗, 它可以单独应用，也可以与药物等其它治疗手段联合应用。随着研究的深入， RNA干扰技术将日渐成熟并运用于更广更多的领域。随着新的小分子RNA的不断出现及人们对RNA干扰机制的深入研究和 干扰技术的不断完善，RNA干扰有望成为抗肿瘤的最新方法。相信不久的将来， RNA干扰技术将会逐渐完善，必将探索出一条攻克恶性肿瘤的新路。,rna干扰与肿瘤研究及治疗,四、问题及展望（二） 展望rna干扰与肿瘤研究及治疗,
